PLoS ONE: En integreret analyse af miRNA og mRNA udtryk i ikke-småcellet lungekræft

Abstrakt

Brug mikromatrice, genereret vi både mRNA og miRNA udtryk data fra seks ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) væv og deres matchende normal kontrol fra tilstødende væv for at identificere potentielle miRNA-markører til diagnostik. Vi viste, at HSA-miR-96 er betydeligt og konsekvent opreguleret i alle 6 NSCLCs. Vi valideret dette resultat i et uafhængigt sæt 35 parrede tumorer og deres tilgrænsende normale væv, såvel som deres sera, der er indsamlet før kirurgisk resektion eller kemoterapi, og resultaterne tydede på, at HSA-MIR-96 kan spille en vigtig rolle i NSCLC udvikling og har stort potentiale til at blive anvendt som en ikke-invasiv markør for diagnosticering NSCLC. Vi forudsagde potentielle miRNA target mRNA baseret på forskellige metoder (Targetscan og Miranda). Yderligere klassifikation af miRNA regulerede gener baseret på deres forhold til miRNA afslørede, at HSA-miR-96 og visse andre miRNA har tendens til at nedregulere deres mål mRNA i NSCLC udvikling, som har ekspressionsniveauerne eftergivende for direkte interaktion mellem miRNA og deres mål mRNA. Desuden identificerede vi en signifikant sammenhæng af miRNA regulering med gener sammenfaldende med høj tæthed af CpG øer, hvilket tyder på, at miRNA kan repræsentere en primær reguleringsmekanisme regulerer grundlæggende cellulære funktioner og celle differentieringer, og en sådan mekanisme kan være et supplement til DNA-methylering i at undertrykke eller aktivere genekspression

Henvisning:. Ma L, Huang Y, Zhu W, Zhou S, Zhou J, Zeng F, et al. (2011) En integreret analyse af miRNA og mRNA udtryk i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 6 (10): e26502. doi: 10,1371 /journal.pone.0026502

Redaktør: Boris Zhivotovsky, Karolinska Institutet, Sverige

Modtaget: 23. maj 2011; Accepteret: September 28, 2011; Udgivet: 27 okt 2011

Copyright: © 2011 Ma et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde underbygges af Naturlig Science Foundation i Zhejiang-provinsen (Y2110960) og Bureau for Videnskab og Teknologi i Zhoushan tildelt professor Yongkui Zhang (20.081.059), og forskningsfonden for Zhoushan Hospital tildelt Dr. Lina Ma, og National Basic Research Program ( 973 Program, 2011CB944100 og 2011CB944101) og National Natural Science Foundation of China (90.919.024) tildelt professor juni Yu. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

øjeblikket, ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er den førende årsag til kræft dødsfald i [1] verden. Kirurgisk resektion er primært udføres i tilfælde tidlige fase og er også effektiv, men dens virkning er begrænset til patienter med lokalt fremskreden kræft på grund af den høje fjernmetastaser og gentagelse. Således kemoterapi og strålebehandling, samt en kombination af begge, udføres altid ved behandling af patienter med lokalt fremskreden kræft. Men den 5-års overlevelse på patienter med lungecancer falder dramatisk med kliniske stadier af sygdommen, for eksempel fra en anslået 61% for patienter med stadie IA sygdommen til 38% for patienter med stadie IB sygdom. Andre etape-relateret 5-års overlevelsesraten for sygdommen er 34% for patienter med IIA sygdom, 13% for patienter med stadie IIIA sygdom, 5% for patienter med stadie IIIB sygdom, og 1% for patienter med stadie IV [2] [3], [4], [5]. De fleste lungekræftpatienter kun diagnosticeret efter tumorer har spredt sig ud over deres primære steder, og dette er en vigtig årsag til den dårlige resultat af lungekræft behandlinger. Desuden variation analyse blandt en række forskellige cancere foreslog, at lungekræft har større antal muterede gener end andre cancere [6]. Derfor er opdagelsen af ​​effektive diagnostiske markører og forhører mekanismer i udviklingen lungekræft, både er nødvendige for at forbedre overlevelsesraten for lungecancerpatienter. Salg

miRNA er korte ikke-kodende RNA’er (-22 nt lang), som binder komplementære sekvenser i target mRNA, hvilket resulterer i deres selektive nedbrydning eller selektiv hæmning af oversættelse. Derfor gennem regulering deres målgener, er miRNA vides at være involveret i en lang række biologiske funktioner, såsom cellulær proliferation, differentiering og apoptose [7], [8]. Afvigende miRNA udtryk er blevet rapporteret at forårsage sygdomme, såsom kræft [9], Alzheimers sygdom [10], hjertesygdomme [11], spinal motor neuron anomalier [12], og etc .. I NSCLC, er det blevet foreslået, at miR -31 kan virke som et onkogent miRNA ved at undertrykke tumorsuppressorer: LATS2 og PPP2R2A [13], og ekspression af HSA-mIR-205 er blevet foreslået at være i stand til at skelne skællede fra nonsquamous ikke-småcellet lungekræft [14]. Desuden beviser viser, at høj HSA-mir-155 og lav HSA-let-7a-2-ekspression korrelerede med ringe overlevelse af patienter med lungecancer [15], og har-miRNA-126 kan fremme NSCLC-celler apoptose induceret af bestråling gennem PI3K-Akt pathway [16]. miRNA nu fremstår som særdeles vævsspecifikke biomarkører for diskriminere kræftformer fra noncancerous væv og forskellige kræftformer, samt forskellige prognostiske resultater [15], [17].

mRNA profilering har afsløret, at transkriptionel abnormitet af mange gener er ansvarlige for udviklingen af ​​NSCLC [18], [19], og differential også er blevet påvist udtryk for miRNA mellem lungekræft væv og de tilstødende normale væv [15], [20]. I den foreliggende undersøgelse anvendte vi mikroarrays til at måle ekspressionsniveauerne af miRNA og mRNA’er samtidigt i parret NSCLC og deres tilgrænsende normale væv at undersøge mulige roller miRNA. Vores analyser både integrerede og temmelig dybt i søgen efter mulige kandidat miRNA og deres mRNA mål for yderligere undersøgelser og kliniske anvendelser.

Resultater

differentielt udtrykte mRNA i NSCLC væv sammenlignet med deres parrede normale væv

Vi udførte genekspression profilering for parrede tumor-normal vævsprøver fra 6 NSCLC patienter og undersøgt 34,694 gener /udskrifter. Vi definerede 581 op-regulerede gener og 1, 297 ned-regulerede gener, som var konsekvent op- eller nedreguleret i alle 6 tumorvæv sammenlignet med de hosliggende normale væv (Tabel S2 og tabel S3). Blandt differentielt udtrykte gener, vi identificeret to markant opreguleret og 22 betydeligt nedreguleret gener på en falsk Discovery Rate (FDR) på 0,1 (tabel S2 og tabel S3). Vi efterfølgende udført GO berigelse analyse ved hjælp hypergeometric test og multiple test justering metode BH gennem WebGestalt2 [21] og defineret de berigede veje på en

s

værdi 0,001. Den hypergeometriske fordeling er en diskret sandsynlighedsfordeling, der beskriver antallet af succeser i en sekvens af

n

trækker fra en endelig population uden erstatning, ligesom binomialfordelingen beskriver antallet af succeser for trækker med udskiftning. Hypergeometrisk test hjælper med at finde ud af hvilke GO termer er overrepræsenteret i en stor gen listen. Ifølge hypergeometriske testresultater blev cellecyklus M-fase og DNA metaboliske proces overvejende aktiveret, hvorimod veje involveret i immunfunktioner signifikant undertrykt i NSCLC (tabel 1). Derudover blev op-regulerede gener overvejende beriget i “kromosom” i modsætning til nedreguleret gener, blev overvejende beriget med “cellemembran” (tabel 2).

differentielt udtrykt miRNA i NSCLC væv sammenlignet med deres parrede normale væv

Vi udførte miRNA udtryk profilering med de samme 6 parrede prøver af den primære tumor og dens tilstødende normale væv. Vi opnåede 25 opreguleret og 24 nedreguleres miRNA som var konsekvent op- eller nedreguleret i alle 6 tumorvæv sammenlignet med de tilstødende normale væv før signifikanstest (tabel S4 og tabel S5). Baseret på en mere stringent analyse, opnåede vi en enkelt markant opreguleret miRNA, HSA-miR-96, på et falsk Discovery Rate (FDR) på 0,1. Vi undersøgte yderligere ekspressionsniveauet af dets potentielle mRNA-mål (Disse mål har bevaret miRNA bindingssites blandt hvirveldyr eller pattedyr og blev forudsagt under anvendelse Targetscan): 13 af 728 totale kandidat målgener (Tabel S2 og tabel S6) (Konto for 2,24% af de 581 up-regulerede gener) blev opreguleret og 48 ud af de samlede (tabel S3 og tabel S6) (konto for 3,70% af de 1, 297 ned-regulerede gener) blev nedreguleret (figur 1A). Vi valideret derefter HSA-MIR-96-ekspression baseret på kvantitativ RT-PCR i et uafhængigt sæt 35 NSCLC og deres serumprøver (for sera, udtrykket værdier blev normaliseret til normale mennesker uden kræft historie eller anden sygdom på det pågældende tidspunkt), og fundet HSA-mIR-96 var signifikant opreguleret i både væv og serumprøver fra patienter med NSCLC (figur 2). Derfor HSA-miR-96 kan være en vigtig faktor for at bidrage til NSCLC udvikling og kan have et stort potentiale til at blive brugt til at diagnosticere.

(A) Microarray resultaterne af de nedreguleret mål kandidater af HSA-miR -96 i NSCLC. Vi analyseret 6 parret NSCLC vs. normalt væv. C og N står for kræft og tilstødende normalt væv, henholdsvis. Stjernen markerer gener tilhører korreleret gruppe, og de resterende gener er grupperet i den anti-korreleret gruppe efter udtrykket forholdet af disse gener med deres regulerende miRNA. (B) Validering af microarray resultater ved QRT-PCR. Vi valgte 10 nedreguleret mål kandidater af HSA-miR-96 og udførte QRT-PCR-forsøg for validering af relative mRNA-ekspression i forhold til glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH). Den relative ekspression værdier er de middelværdier ± SE. *,

P

0,05 af

t

test; **,

P

0,001 af

t

test

To grupper af sammenligninger blev udført:. (1) tumor vs. tilstødende normale lungevæv, og (2) kræft serum vs. ikke-cancer serum. Relativ HSA-MIR-96-ekspression blev bestemt i forhold til en intern U6 snRNA kontrol. Relative udtryk værdier er normaliseret gennemsnit ± SE.

Som miRNA altid undertrykke ekspressionen af ​​målgener, de 48 ned-regulerede mål for HSA-miR-96 kan være mest tilbøjelige til at bidrage til NSCLC udvikling gennem HSA-miR-96 regulering. Vi valgte 10 nedreguleres mål for HSA-MIR-96 at validere deres mRNA ekspressionsniveauer under anvendelse QRT-PCR i 20 NSCLC og fandt, at alle af dem var signifikant nedreguleret i tumorvæv sammenlignet med de hosliggende normale væv (figur 1B ). For at undersøge, hvordan disse 48 nedreguleret potentielle mRNA-mål kan påvirke udviklingen af ​​NSCLC, vi klassificeret dem baseret på GO vilkår, og fandt, at disse gener var involveret i en række forskellige grundlæggende biologisk proces, herunder metabolisme, biologisk regulering, celle kommunikation, udviklingsmæssige proces, immunsystemet, og osv (figur S2).

Klassifikation af mRNA’er baseret på deres forhold til miRNA regulering

for at karakterisere hvordan miRNA kan regulere deres mål mRNA, vi udførte en omfattende analyse af korrelerede ekspressionen af ​​miRNA og deres mål mRNA’er. miRNA er udtrykt som lange precursor RNA’er som er behandlet af en cellulær nuklease, drosha, inden de transporteres af en exportin-5-afhængig mekanisme til cytoplasmaet [22], [23]. Når i cytoplasmaet, bliver miRNA spaltes yderligere af enzymet DICER [24], [25], og dette resulterer i 17-24 nt miRNA, der er forbundet med et cellulært kompleks, der svarer til RNA-inducerede silencing kompleks, der deltager i RNA-interferens. Men miRNA primært regulere mRNA oversættelse, mens siRNAs direkte RNA ødelæggelse via RNA-interferens (RNAi) vej [8], [26]. Derfor kan den overflod af miRNA primært afhænge af dens oprindelige udtryk og ikke importeret eksogent. Desuden flere linjer af beviser tyder på, at forhøjelse af miRNA udtryk fører til nedregulering af de målgener, og reduktion af miRNA udtryk føre til opregulering af målet gener [13], [27]. Vi hypotese derfor, at virkningen af ​​miRNA på deres mål mRNA’er er ekspressionsniveau-afhængig. Vi brugte en roman foranstaltning til at evaluere miRNA regulering, betegnes

regulering værdi

. Vi først antage, at en regulering værdi af en miRNA er positivt korreleret med sit udtryk niveau. Da en miRNA altid har mere end én målgener [28], vi antager, at en forordning værdien af ​​et givet miRNA negativt korreleret med antallet af dens mål. Derfor definerer vi en forordning værdi for miRNA som afvigelsen i udtrykket for en given miRNA divideret med antallet af udtrykte mRNA-mål.

Under udviklingen af ​​kræft, kan reguleringen variere fra sag til kontrol for en given miRNA og dermed regulering værdien af ​​et givet miRNA lig med variationen i miRNA ekspression divideret med antallet af udtrykte mål. Når ekspressionen af ​​et miRNA nedreguleres i cancere, dens regulering værdi bliver negativ, hvis antallet af dets udtrykte mål ikke ændres væsentligt. For et mål mRNA, dens regulering værdi er summen af ​​alle regulering værdier fra sine lovgivningsmæssige miRNA. Baseret på disse definitioner, vi klassificeret alle differentielt udtrykte gener i kræft i forskellige grupper på baggrund af deres korrelationer-korrelerede eller anti-korreleret med miRNA regulering. Forinden dette, vi forudsagde de potentielle target gener af disse konsekvent op- eller ned-regulerede miRNA.

Vi brugte tre metoder til at forudsige de potentielle mål for miRNA. Den software Targetscan fokuserer mere på miRNA frø (2-8nt i 5′-regionen af ​​moden miRNA), som tyder på vigtigheden af ​​denne region for miRNA target anerkendelse [29], [30], [31], [32]. Desuden har bevarelse af målsteder sekvens blevet betragtet som et vigtigt træk til at reducere falsk-positiv rate [30]. Vi forudsagde derfor potentielle miRNA mål ved hjælp Targetscan og bevarede målområder blandt hvirveldyr eller pattedyr ved hjælp af

P

CT metode Targetscan [33]. Men frø sites ikke altid giver undertrykkelse, og softwaren MIRANDA også tager hensyn til anden region i miRNA i tillæg til frø sites [34]. Vi derefter brugt Miranda som en anden alternativ metode til at forudsige miRNA mål. De to software blev ofte brugt til at forudsige miRNA mål, og derudover kan de begge anvendes til at forudsige mål for hidtil ukendte miRNA som illuminia miRNA microarray “humanMI_V2” indeholder mange nye miRNA, der genereres fra den næste generation sekventering verdensomspændende forsøg. Vi opnåede 16,160 bevarede miRNA-mål-par blandt hvirveldyr eller pattedyr ved hjælp af

P

CT metode Targetscan (tabel S6), 70,320 miRNA-mål-par ved hjælp Targetscan uden at overveje bevarelse tilstand (tabel S8), og 77,988 miRNA-mål-par ved hjælp af Miranda (tabel S10). Vi observerede, at 48,841 miRNA-mål-par var til stede i begge Targetscan og Miranda resultater (69,46% af Targetscan resultater, 62,63% af miranda resultater), og 12,403 miRNA målgruppen par af konserverede Targetscan resultater var fælles med Miranda resultater (76,75% af bevaret Targetscan resultater). Derfor var der omkring 70% forudsigelse resultater, der var almindelige i de to forskellige metoder, og bevares forudsigelse resultater af Targetscan exhibite en større andel af delte gener.

Vi først brugt de konserverede forudsigelse resultater at klassificere mRNA baseret på deres forhold til miRNA regulering. Især vi definerede 197 og 190 gener som anti-korreleret og korreleret henholdsvis og 1491 som “andre”, hvis miRNA regulering værdier er nul (tabel S7). Vi undersøgt yderligere fordelingen af ​​miRNA regulering værdi, genekspression niveau og den potentielle sammenhæng mellem disse to parametre. I de 197 anti-korreleret gener, blev 171 (konto for 13,18% af en, 297 ned-regulerede gener) nedreguleret og 26 (konto for 4,48% af 581 up-regulerede gener) var opreguleret. Gene fordeling baseret på regulering værdi foreslog også, at anti-korreleret gruppe var altid nedreguleret af miRNA (figur 3A). I de 190 korrelerede gener, 140 (konto for 10,79% af en, 297 ned-regulerede gener) var nedreguleret og 50 (konto for 8,61% af 581 up-regulerede gener) var opreguleret. Gene fordeling baseret på regulering værdi foreslået, at korreleret gruppe var altid nedreguleret (figur 3A). For 1.491 gener i “andre”, blev 986 (udgør 76,02% af 1.297 ned-regulerede gener) nedreguleret og 505 (udgør 86,92% af 581 up-regulerede gener) var opreguleret (tabel 3). Som konklusion viser disse resultater, at miRNA tendens at nedregulere genekspression, især for dem af anti-korreleret gruppe. Vi undersøgte også potentielle funktioner af anti-korreleret gruppe, der skulle være reguleret af miRNA, og fandt de var involveret i en række biologiske processer, herunder stofskifte, immunforsvar, celle drab, flercellede organismal udvikling, og celle kommunikation ( Figur S3).

Vi klassificeret alle udtryk-variable mRNA under udviklingen lungekræft baseret på deres forhold til miRNA. Resultaterne klassificeres i korrelerede, anti-korreleret, og andre (ingen korrelation). De korrelerede mRNA viser korrelerede udtryk til deres regulerende miRNA udtryk og anti-korreleret mRNA er ikke. Tre forskellige metoder blev anvendt til at forudsige potentielle miRNA mål: “Conserved” er de gener, der har bevaret miRNA bindende sites blandt hvirveldyr eller pattedyr, og disse gener blev forudsagt ved hjælp af

P

CT metode Targetscan ; “Targetscan” er de gener, der er forudsagt ved hjælp af et Perl-script af Targetscan uden at overveje bevarelse. “Miranda” er de gener, der er forudsagt potentielle mål baseret på miranda v3.3a på Linux-platformen. (A), Gene fordeling af korrelerede og anti-korrelerede mRNA’er blev plottet baseret på deres miRNA regulativværdier. (B) Gene fordeling af de tre grupper af mRNA’er blev plottet baseret på ekspressionsprodukterne værdier. Udtrykket værdi blev defineret ved at referere den af ​​det tilstødende normale væv (log2). (C) Forholdet mellem genekspression og miRNA regulering.

Vi yderligere verificeret dette resultat ved hjælp af forudsigelser af Targetscan uden at overveje bevarelse og forudsigelser af MIRANDA sekvens. Ved hjælp af Miranda, vi har 482 og 294 gener som anti-korreleret og korreleret henholdsvis og 1102 som “andre”. Brug Targetscan uden at overveje bevarelse, har vi 472 og 285 gener som anti-korreleret og korreleret henholdsvis og 1121 som “andre”. Vi yderligere undersøgt krydsfeltet mellem Targetscan og Miranda, og fandt, at de tre metoder delte omkring 80% i anti-korreleret gruppe; Targetscan og MIRANDA delte omkring 70% gener i korreleret gruppe, mens

P

CT metode deles kun omkring 50% gener med de øvrige to metoder i den korrelerede gruppe. I overensstemmelse med resultaterne af konserverede forudsigelser, miRNA i anti-korreleret gruppe synes regulere højere andel af nedregulerede mRNA’er sammenlignet med de resterende grupper er defineret baseret på følgende to metoder (tabel 3), og den anti-korreleret gruppe udviste slående anden fordeling af regulering værdi sammenlignet med korrelerede gruppe (figur 3A).

Vi derefter undersøgt target ekspressionsniveauet for de tre regulering grupper og fandt, at ekspression af den anti-korreleret gruppe var højere end de resterende grupper (figur 3B). Yderligere undersøgelse af regulering værdier med ekspressionsniveauet viste, at højt udtrykte gener i anti-korreleret gruppe tendens til at være nedreguleret af miRNA, hvorimod ringe udtrykte gener tendens til at være opreguleret. Gener i korrelerede gruppe opfører sig på den modsatte måde (figur 3C). Dette resultat antydede, at højt udtrykte gener kan bidrage mere til down-regulerede gener i anti-korreleret gruppe end til up-regulerede gener i samme gruppe.

Potentiel forhold miRNA med methylering i reguleringen mRNA-ekspression

Da methylering er en anden vigtig mekanisme til at regulere mRNA-ekspression, vi yderligere undersøgt, hvordan det kan interagere med miRNA regulering. Vi først kategoriseret målet gener i HCG (høj CpG indhold), LCG (mellemliggende CpG indhold), og ICG (lav CpG indhold) klasser (Tabel S2 og tabel S3) efter en metode beskrevet tidligere [35]. Vi fandt, at i de konserverede forudsigelsesresultater, både anti-korreleret og korreleret grupper indeholdt flere HCG gener end andre eller alle generne (figur 4A), og resultatet viser, at HCG gener er mest sandsynligt at være reguleret af miRNA, der har bevaret mål sites.

(A) fordelingen af ​​CpG-density klassificerede gener i hver gruppe. Disse målgener blev forudsagt ved hjælp af tre forskellige metoder: “Conserved” er de gener, der har bevaret miRNA bindende sites blandt hvirveldyr eller pattedyr, og disse gener blev forudsagt ved hjælp af

P

CT metode Targetscan; “Targetscan” er de gener, der er forudsagt ved hjælp af et Perl-script af Targetscan uden at overveje bevarelse. “Miranda” er de gener, der er forudsagt potentielle mål baseret på miranda v3.3a på Linux-platformen. (B) Forbindelser mellem CpG island tæthed og genekspression. Tre grupper blev klassificeret:. Alle udtrykte gener i NSCLC, de miRNA-regulerede gener, og andre gener, som ikke kan påvirkes af miRNA

Da et stort antal højt udtrykte gener blev fundet i anti-korreleret gruppe, vi yderligere spurgt, om disse HCG gener er altid højt udtrykt og har tendens til miRNA-reguleret. I alle gener udtrykt i NSCLC blev HCG gener ikke som dominerende i højt udtrykte gener i forhold til LCG eller ICG gener. Peak udtryk for HCG området fra 5 til 10, hvorimod de af ICG eller LCG gener er i et område fra 2 til 7. miRNA tendens til at regulere flere gener ved den relative ekspression på 5 til 10, derfor, når reguleret af miRNA, toppen af ​​ICG eller LCG genekspressioner bør være i dette område, og vi observeret, at der var færre LCG gener i dette udtryk interval sammenlignet med HCG eller ICG gener. Men “andre” (gener uden regulering værdi variation) har også et højdepunkt i udtrykket området, men der var ingen forskel i gen tæthed blandt de tre CpG klasser (figur 4B). Sammenfattende kan HCG gener blive beriget gener der er reguleret af miRNA på grund af deres høje ekspressionsniveauer, men det er naturligvis ikke den eneste grund.

Vi har også udført GO analyse mellem miRNA-regulerede og miRNA-ufølsom grupper til at vise, at deres gener og funktioner er forskellige fra den anti-korreleret og korrelerede grupper (Figur 5 og Figur S5). Som det er vist i figur 5, indeholder miRNA-regulerede gruppe flere gener i følgende processer: transcription regulering, nukleinsyrebinding, celle kommunikation, metaboliske, og regulering udvikling. Disse forskelle demonstrerer fra en anden vinkel, hvorfor miRNA tendens til at påvirke HCG gener med konserverede miRNA målsteder som CpG island indhold altid er korreleret med genregulering og funktionel differentiering, og disse gener kan være af betydning for grundlæggende cellulære funktioner af forskellige hvirveldyr eller pattedyr [36 ]

P

. 0,05 blev betragtet som signifikant [67]

diskussion

i denne undersøgelse undersøgte vi mRNA. og miRNA profilering af NSCLC. mRNA profilering afslørede, at et antal differentielt udtrykte gener er involveret i aktivering af cellecyklus i NSCLC. Dette resultat stemmer overens med resultaterne af tidligere undersøgelser, der antyder, at unormal cellecyklus er forbundet med forhøjet risiko for lungekræft [37], [38]. De nedregulerede gener findes at være overvejende beriget med immunsystemer samt dem lokaliseret på cellemembraner, der normalt korrelerede med celle-celle-kommunikation og deltage i immun proces. Hæmninger af disse gener er blevet formodes at lette lungekræft udvikling og progression, og dette kan i nogen grad på grund af udslip af cancerceller fra detektering og destruktion af værtens immunsystem [39], [40], [41].

i miRNA profilering sammenligning fandt vi HSA-miR-96 var signifikant opreguleret i NSCLC. 48 HSA-MIR-96 potentielle mål blev overvejende beriget med nedreguleret mRNA gruppe og er involveret i en række biologiske processer ifølge GO anmærkninger. Baseret på regulering værdi skøn, viste vi, at 42 af dem tilhører den anti-korreleret gruppe (figur 1A, tabel S7). Vores Valideringsforsøg afslørede, at den modne form af HSA-MIR-96 er stærkt udtrykt ikke blot i cancervæv, men også i sera fra cancerpatienter. Dette resultat antyder, at HSA-MIR-96 har et stort potentiale til anvendelse som en ikke-invasiv biomarkør for NSCLC diagnose.

Vores nuværende viden om HSA-MIR-96 er ret begrænset. Det ligger i det intergeniske område mellem NRF1 og UBE2H på humant kromosom 7 [42] og har en meget bred fordeling blandt dyr, fra nematoder til pattedyr, og er mere bevaret blandt hvirveldyr (fig S4). Tidligere undersøgelser har antydet, at det fungerer til at regulere fremadskriden af ​​differentiering i pattedyrs cochlear indre og ydre hårceller [43], og er forbundet med aggressive humane adfærd [44]. I forholdet til cancere, har HSA-MIR-96 blevet rapporteret at være stærkt udtrykt i blærekræft [45], prostatacarcinom [46], og kronisk myeloid leukæmi [47]. Det kan detekteres i urin og korreleres med stadium og karakter baseret på urin cytologi af urothelial carcinoma [48]. Opregulering af HSA-MIR-96 resulterer i ned-forskrifter transkriptionel faktor FOXO3a og FOXO1, og således inducerer celleproliferation i human brystcancer [49], [50]. I vores analyser, fandt vi et sæt potentielle mål, der kan korrelerer med funktionen af ​​HSA-miR-96 i NSCLC udvikling, men ingen af ​​de potentielle mål er blevet valideret af eksperimenter. Derfor yderligere eksperimenteren er essensen i at afsløre forhold mellem HSA-miR-96 og NSCLC. Desuden vil vi øge størrelsen af ​​prøven til at undersøge mulige forhold for HSA-miR-96 udtryk med prognose, og andre egenskaber ved NSCLC.

Generelt miRNA menes at binde den 3 ‘utranslaterede region af et target mRNA og nedregulerer dets ekspression på mRNA eller proteinniveauer men hovedsagelig på mRNA-niveau [51]. Derfor, når ekspressionen af ​​et miRNA er forhøjet, mRNA’er, der er reguleret af miRNA forventes at være nedreguleret; når ekspressionen af ​​miRNA er undertrykt, bør dets mål mRNA viser op-regler. Men ifølge vores resultater, anti-korreleret mRNA er altid nedreguleret, og kun en lille brøkdel af gener er opreguleret. Yderligere undersøgelse foreslog, at i anti-korreleret gruppe, nedreguleret mRNA’er er altid højt udtrykt, og opreguleret mRNA’er er altid ringe udtrykkes. Derfor kan der findes mere stærkt udtrykte gener være en vigtig bidragyder til effekten. Grunden højt udtrykte mRNA’er tendens til at være nedreguleret af miRNA og ydmyg-udtrykte mRNA’er tendens til at være opreguleret af miRNA antyder en eksistens af en regulerende balance, der fungerer til at holde hele transkriptom i en optimeret dynamisk område.

i vores analyse, vi ikke kunne finde nogen spor, der er ansvarlige for forskellen mellem den anti-korrelat og korrelerede mRNA. GO klassifikation viste ingen åbenlyse forskel enten (Figur S5). Desuden ekspressionsniveauer af target mRNA’er, der har en høj regulering værdi viste ikke signifikant variation, og omvendt (Tabel S2, tabel S3, tabel S7, tabel S9, tabel S11), og gener, hvis ekspression er signifikant varierede ikke nødvendigvis væsentligt reguleret. Da en mRNA ofte reguleres af mere end én miRNA [28], er vi stadig i stand til at vide, hvordan disse miRNA interagere med hinanden, og hvilken form for direkte interaktioner er mest effektive. Endvidere kan miRNA undertrykke deres målgener kun på proteinniveauet [52], og målene må ikke udvise mærkbare ændringer på mRNA-niveauet. Der er andre faktorer, der er involveret i reguleringen af ​​mRNA på epigenetiske niveauer, såsom histon methylering [53], [54] og acetylering [55], [56], og som altid er i stand til at blande sig med miRNA-centreret netværk [57] , [58], hvilket gør dechifrere sådanne net vanskeligere.

en anden interessant observation er, at gener i enten den korrelerede gruppe eller anti-korreleret gruppe har en større andel af HCG gener end i “andre” gruppe. Både korreleret og anti-korreleret grupper betragtes mest sandsynligt at blive påvirket eller eventuelt reguleret af miRNA. Dette resultat antyder, at miRNA tendens til at regulere HCG gener. Yderligere undersøgelser viste, at HCG gener tendens til at udtrykke på et højere niveau sammenlignet med ICG eller LCG gener. Derfor kan der være en mulighed for, at flere HCG gener påvirkes af miRNA. Men sammenligninger baseret på alle potentielle mål viste ingen forskel mellem disse grupper (figur 4A). Som den strenge standard udvalgte mål har bevaret bindingssteder af miRNA blandt hvirveldyr eller pattedyr, mere HCG målgener i miRNA-påvirket gruppe kan korrelere med gen-evolution blandt hvirveldyr.

GO sammenligning mellem det regulerede og uregulerede grupper demonstreret de var helt anderledes da førstnævnte altid indeholder flere gener involveret i transskription regulering, nukleinsyre bindende, celle kommunikation, metaboliske, og regulering udvikling. Funktionen af ​​gener og deres ekspression er altid korreleret med CpG øen indhold af promotorer. Det er blevet foreslået, at hus-holde funktioner er markant overrepræsenteret i HCG klassen, mens vilkår forbundet med specifikke funktioner karakteristiske for mere differentierede eller stærkt regulerede celler er signifikant overrepræsenteret i LCG klassen [36], [59]. miRNA er blevet foreslået at være en primær reguleringsmekanisme, som det er til stede fra lav til høj organismer, derfor kan foretrække at regulere en højere andel af HCG gener for grundlæggende cellulære funktioner.