PLoS ONE: Svækket XPC Expression er ikke forbundet med Nedsat DNA reparation i blærekræft

Abstrakt

Blærekræft har en høj forekomst med betydelig sygelighed og dødelighed. Svækket ekspression af DNA beskadigelse respons protein xeroderma pigmentosum komplementering gruppe C (XPC) er blevet beskrevet i blærekræft. XPC spiller en væsentlig rolle som den vigtigste initiator og skader-detektor i den globale genom nukleotid excision reparation (NER) af UV-inducerede læsioner, voluminøse DNA-addukter og intrastrand tværbindinger, såsom dem fremstillet af det kemoterapeutiske middel cisplatin. Derfor kan XPC protein være en informativ biomarkør til at guide personlige terapi strategier i en delmængde af blærekræft sager. Derfor målte vi XPC proteinekspression niveau og funktionel NER aktivitet af 36 blæretumorer på en standardiseret måde. Vi optimerede betingelser for dissociation og

in vitro

kultur af primære blære cancerceller og bekræftede svækkede XPC ekspression i ca. 40% af tumorerne. Imidlertid NER aktivitet svarede til samdyrket vildtypeceller i alle undtagen en af ​​36 blæretumorer. Vi konkluderer, at (i) funktionel NER-mangel er et relativt sjældent fænomen i blærekræft og (ii) XPC protein niveauer er ikke anvendelig som biomarkør for NER aktivitet i disse tumorer

Henvisning:. Naipal KAT, Raams A , Bruens ST, Brandsma I, Verkaik NS, Jaspers NGJ, et al. (2015) Svækket XPC Expression er ikke forbundet med Nedsat DNA reparation i blærekræft. PLoS ONE 10 (4): e0126029. doi: 10,1371 /journal.pone.0126029

Academic Redaktør: Kerstin Borgmann, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Tyskland

Modtaget: Januar 5, 2015; Accepteret: marts 27, 2015; Udgivet: 30 April, 2015

Copyright: © 2015 Naipal et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:. den forskning, der fører til disse resultater, er udført med støtte fra det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram (FP7 /2007-2013) i forbindelse med tilskudsaftale nr HEALTH-F2- 2010-259893 (DDResponse) til JH, RK og DVG, URL: https://cordis.europa.eu/fp7/home_en.html; Hollandske Cancer Society (KWF) tilskud nr. 2011-5030 til JH, URL: https://www.kwf.nl/Pages/default.aspx; og Vereniging Trustfonds Erasmus University Rotterdam til JB, URL: https://www.eur.nl/eur/fondsen/trustfonds/. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

Blærekræft (BC) er den femte mest almindelige malignitet i Europa med en forekomst på mere end 150.000 sager resulterer i mere end 50.000 dødsfald om året [1]. Blæretumorer enten som nuværende ikke-muskel-invasiv (NMIBC) (70%) eller muskel-invasiv blærekræft (MIBC) (30%) [2]. MIBC er en potentielt dødelig sygdom med en 5-års overlevelse på 50-60% [3]. Terapi af MIBC involverer primært kirurgi og systemiske kemoterapeutiske behandlinger, sidstnævnte primært til tilbagevendende og metastatisk sygdom.

Der er et klart klinisk behov for udvikling af nye strategier for MIBC systemisk behandling, som overlevelse MIBC patienter har ikke forbedret i de seneste årtier. Behandlinger rettet mod tumorspecifikke pathways har vist sig at være effektive i forskellige cancerformer, såsom bryst-, ovarie- og nyrecancer men for BC sådanne behandlinger ikke er tilgængelige. Behandlinger rettet mod DNA-skade respons (DDR) mekanismer er lovende tilgange i anticancer behandling [4]. DDR mekanismer er afgørende for bevarelse af genomisk stabilitet gennem DNA-reparation, cellecyklusregulering og apoptose. Funktionaliteten af ​​specifikke DDR pathways er en vigtig parameter, der bidrager til følsomheden af ​​maligne celler til DNA-ødelæggende kemo- og stråleterapi. Desuden kan målrette specifikke defekter i DDR pathways resultere i en mere effektiv behandling. For eksempel DDR defekten er forårsaget af

BRCA1

eller

BRCA2

mutationer i bryst- og ovariecancer sensibiliserer disse tumorer inhibitorer af poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) [5,6] . Således kan bestemme DDR status for individuelle tumorer være værdifuldt for anti-cancer behandling valg.

nukleotid excision reparation (NER) er ansvarlig for reparation af en bred vifte af forskellige typer af DNA skader produceret af miljømæssige mutagene og kræftfremkaldende stoffer. Strukturelt ubeslægtede læsioner repareres af NER omfatter helix forvridninger UV-induceret, voluminøse DNA-addukter og intrastrand tværbindinger (fx induceret af lægemidler såsom cisplatin) [7]. To store subpathways af NER omfatter global genom NER (GG-NER) og transskription koblet NER (TC-NER). Xeroderma pigmentosum komplementering gruppe C (XPC) er specielt involveret i GG-NER og fungerer som en skade anerkendelse protein i kompleks med HR23B. Først efter skader anerkendelse af XPC-HR23B de centrale NER proteiner rekrutteres til læsionen og NER udføres [8]. Dette antyder, at XPC er det hastighedsbegrænsende faktor i GG-NER

Flere linjer af beviser tyder på, at NER gener spiller en rolle i udviklingen og progressionen af ​​BC.; polymorfier i nogle NER gener øger BC risiko, især hos rygere [9-12]. Desuden blev det vist, at svækket udtryk for NER protein XPC er til stede i ~ 40% af alle blæretumorer og en medvirkende faktor i tumor progression [13]. Også hypermethylering af

XPC

genpromotoren er betydeligt højere i BC sammenlignet med normal slimhinde og er forbundet med højere patologisk stadium, tilstedeværelse af metastase og p53-mutationer [14]. Disse observationer tyder på, at specifikke

XPC

defekter i BC forårsager defekt NER og et dårligt resultat i en undergruppe af tumorer. På den anden side,

XPC

fejl kan udnyttes til individualiseret målrettet kemoterapi. Ved selektivt at målrette NER defekt ved anvendelse af forbindelser, der inducerer specifik DNA-skade, hvis reparation kræver NER, f.eks Cisplatin, kunne øget cytotoksicitet skal nås af NER mangelfulde tumorceller.

I den foreliggende undersøgelse, vi havde til formål at identificere XPC ekspressionsniveauer i individuelle kliniske BC prøver sammen med funktionel NER aktivitet, som udgangspunkt for individuel terapi . Vi har etableret en reproducerbar metode til at opnå en kortsigtet enkelt lag cellekultur fra friske blære tumor prøver at udføre vores analyser og konkluderer, at lave XPC udtryk ikke nødvendigvis resulterer i defekt NER

Materialer Metoder

Samling af menneskelige blærekræft prøver

BC prøver (n = 105) blev indsamlet på Erasmus MC Rotterdam. Ni tumorprøver blev opnået ved radikal cystektomi og den resterende af Trans urethrae resektion (TUR). Efter høst blev de tumorprøver direkte transporteres til laboratoriet i et transportmedium (RPMI-1640, 10% føtalt kalveserum og antibiotika). Alle prøver blev derefter givet en unik kode, og forskerne var blindet for patientdata. Alle tumor prøver blev evalueret efter standard HE farvning og tumor scenen og kvalitet blev vurderet af patologen ifølge WHO klassifikationen 1973 og 2009.

Blære prøver blev indsamlet som kirurgisk restmateriale. Ifølge hospitalets politik patienter blev gjort opmærksom på, at restmateriale kan bruges til forskningsformål, medmindre patienterne vælger ikke at deltage. Alle materialer blev kodet på en sådan måde, at forskere ikke kunne spore information til den enkelte patient. Derfor blev der ikke udtrykkelig skriftlig /mundtlig informeret samtykke indhentes, og behovet for skriftlig /mundtlig informeret samtykke blev givet afkald af Institutional Review Board of Erasmus MC og denne specifikke forskningsprojekt og procedure blev godkendt af IRB (METC-2012-113).

Vævskultur

tumorprøver blev manuelt skåret i mindre stykker under anvendelse af kirurgiske sakse og efterfølgende udsat for dissociation hjælp Miltenyi Biotec Tumor dissociation Kit i kombination med en gentleMACS Dissociator ifølge producentens protokol. Cellesuspensioner blev podet på dækglas i AmnioMax-C100 medium (Gibco Life Technologies, Carlsbad, CA) og inkuberes natten over ved 37 ° C, 5% CO

2 og atmosfærisk ilt. Hvis et tilstrækkeligt antal tumorceller blev fæstnet, et lille antal vildtype humane fibroblaster, C5RO, blev tilsat til kulturen for at tjene som interne kontroller for standardiseret unscheduled DNA-syntese (UDS) assay, der blev udført den næste dag. At adskille de C5RO celler fra tumorceller, blev deres cytoplasma forhånd mærket med 2.0μm polystyrenkugler [15].

Blære cellelinier blev opnået fra ATCC (HT-1197 [ATCC CRL-1473] og T24 [ATCC HTB-4] og dyrket i RPMI1640-medium suppleret med 10% FCS og antibiotika.

Unscheduled DNA-syntese (UDS) assay

UDS assay blev udført ved UV-udstrålende celler med 16 J /m

2 UVC lys og efterfølgende mærkning celler i tre timer med 20 uM 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (edu, en thymidin-analog) i dyrkningsmediet (Hams F10 uden thymidin, 10% dialyseret FCS, antibiotika) [16, 17]. Bagefter blev cellerne vasket og inkuberet i medium suppleret med 10 pM thymidin i 15 minutter for at fjerne ikke-specifik edu binding. celler blev fikseret under anvendelse af 3,7% formaldehyd i PBS indeholdende 0,5% Triton X-100. edu inkorporering blev visualiseret ved fluorescensmikroskopi hjælp klik det kemi (Life Technologies) i overensstemmelse med producentens protokol og kvantificeres ved billedanalyse hjælp FIJI (ImageJ).

Immunfluorescensfarvning

for at visualisere XPC-protein, faste celler blev inkuberet med et primært antistof mod XPC (Santa Cruz D-10; sc-74410 fortyndet 1/1000) i 90 minutter og en sekundær Alexa 488 eller 594 konjugeret antistof i 60 minutter, før montering i DAPI indeholdende monteringsmedium (Vectashield). Specificitet af antistoffet blev testet på XPC vildtype (C5RO) vs XPC deficiente (XP21RO) -celler.

Billedanalyse

XPC samt UDS-farvning på mindst 50 individuelle tumor cellekerner blev kvantificeres ved standard billedbehandling software (ImageJ) og sammenlignet med mindst 20 C5RO kerner på samme dias. Efterfølgende blev standardiseret XPC og UDS niveauer af tumorceller beregnes som:

Immunhistokemi farvning

For at visualisere XPC på formalin-fikseret paraffin indstøbt (FFPE) sektioner af blæretumorer, sektioner blev opvarmet til 95 ° C i 15 minutter med antigen hentning buffer (DAKO S1699) og permeabiliseret med 0,5% Triton X-100 i PBS i 20 minutter. Primært antistof (anti-XPC Santa Cruz D-10; sc-74410 fortyndet 1/1000) blev tilsat, efterfulgt af inkubation natten over ved 4 ° C. Sekundære HRP antistoffer blev inkuberet i 60 minutter ved stuetemperatur og visualiseret under anvendelse af DAB-peroxidase-kemi (DAKO K6438). Prøverne blev analyseret kvantitativt ved anvendelse af en immunhistokemisk scoresystem (S1 Fig). Dette immunoreaktivitet scoring (IRS) systemet tager hensyn til procentdelen af ​​positive celler og intensiteten af ​​den observerede farvning [18].

immunblotting

Immunoblotting blev udført under anvendelse af polyklonalt kanin-anti-XPC [19 ] og monoklonale muse-anti-tubulin (klon: B-512, Sigma-Aldrich) i en time ved stuetemperatur, efterfulgt af inkubering med sekundære antistoffer IRDye 800CW Donkey anti-mus IgG (H + L) (LI-COR) og IRDye 680RD Donkey anti-kanin IgG (H + L) (LI-COR) i en time ved stuetemperatur i mørke. Immunoreaktive bånd blev visualiseret ved hjælp af Odyssey 3.0 (LI-COR).

Colony overlevelse

150 celler per brønd blev podet i seks brønde plader, og hver tilstand blev belagt i tre eksemplarer. Næste dag, når cellerne blev bundet, blev de behandlet med 0, 2, 4, 6 og 8 J /m

2 UVC. Efter 8 dages inkubation blev cellerne farvet med 0,1% Coomassie Brilliant Blue i mindst 30 min. Kolonier blev talt med GelCount (Oxford Optronix).

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af IBM SPSS Statistics v21 og GraphPad Prism v5.

Resultater

XPC udtryk i blærekræft

Fyrre syv ud af 105 indsamlede tumorprøver indeholdt tilstrækkelige tumor at generere FFPE sektioner. XPC-protein-ekspression blev undersøgt i disse 47 tumorer ved immunhistokemi og der blev observeret en bred vifte af XPC niveauer. Størstedelen (58%) af prøverne viste stærk XPC udtryk (IRS = 3), mens 38% af prøverne viste lavere niveauer (IRS = 1 eller 2). I 4% (2 tilfælde) kun blev påvist baggrundsniveauer (IRS = 0) (figur 1A og S1 Fig). XPC niveauer viste ikke signifikant korrelation med tumor etape (Kruskal-Wallis, p = 0,53) eller med tumorklassificering (Mann-Whitney, p = 0,66). (Fig 1B og 1C)

A. Frekvens fordeling af XPC IRS klassifikationer i 47 TURB prøver. B. Frequency distribution af XPC IRS klassifikationer baseret på tumor scenen. Forskelle i IRS klassifikationer var ikke statistisk signifikant (Kruskal-Wallis test, p = 0,5266). C. Frequency distribution af XPC IRS klassifikationer baseret på tumor klasse. Forskelle i IRS klassifikationer var ikke statistisk signifikant (Mann-Whitney test, p = 0,6612).

Optimering ex vivo kultur af dissocierede blære cancerceller

Efterfølgende vi undersøgte, om forskellene i XPC proteinekspression korreleret med variationer i DNA-reparation kapacitet. NER aktivitet kan kvantificeres ved at måle reparation-associeret DNA-syntese (også kaldet unscheduled DNA-syntese (UDS)). UDS-assayet måler inkorporeringen af ​​et mærket nukleosid, 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (edu), efter eksponering for UV-C-stråling (overvejende 254nm), og bestemmes i celler, der ikke undergår S-fase-afhængig DNA syntese [20]. UDS analysen kræver en enkelt celle lag af celler, fordi UV-C-stråling ikke trænger i tykke vævsbiopsier. Derfor er en reproducerbar metode blev etableret for at opnå en kortsigtet enkelt lag cellekultur fra friske blære tumor prøver.

Først skal vi sammenlignet adskillige dissociation metoder til at opnå cellekulturer fra BC biopsier på dækglas. Enzymatiske dissociationer anvendelse af forskellige proteaser resulterede i lave succesrater med hensyn til tumor cellebinding. Vi overvejede fastgørelsen succes, når tumorceller er knyttet til mere end 5% af dyrkningsskålen overflade. Attachment mellem 5-30% blev anset mellemliggende, mens mere end 30% angivet passende fastgørelse (tabel 1). Vi opnåede vedhæftet tumorceller i kun 35% af tumorer upon collagenase VII behandling, hvorimod ingen tilknytning blev opnået med trypsin eller Dyspase behandlinger (tabel 1). Især i tilfælde af celler, der er knyttet til glasset dækglasset, små klumper af celler knyttet mere effektivt end enkelte celler (S2A Fig). På den anden side, dissociator dissociation assays under anvendelse af Miltenyi Biotec Tumor dissociation Kit og gentleMACS resulteret i enkelte cellelag kulturer i ca. 80% af tumorerne (tabel 1). At skelne disse urothelial tumorceller fra fibroblaster, som ofte forurener sådanne primære kulturer, udførte vi en farvning mod cytokeratin 18. I tilfælde af passende fastgørelse størstedelen af ​​cellerne farvet positive for cytokeratin 18, der indikerer en ren urothelial tumor cellekultur (S2B Fig) . På den anden side, tumorbiopsier der vises ætsninger virkninger på HE-farvning, hvilket indikerer diatermisk tumor fjernelse, ikke tillægger dækglas muligvis på grund af (tumor) celledrab af overdreven opvarmning. Endvidere tumor biopsiprøver afledt fra cystektomi prøver fastgjort med succes i kun én ud af ni prøver, hvilket indikerer, at invasive blæretumorer er vanskelige at dyrke

ex vivo

i en enkelt cellelag.

Forskellige coating strategier dækglas, såsom gelatine, fibronectin eller poly-L-lysin førte ikke til bedre vedhæftning af celler (data ikke vist). Endelig har vi testet forskellige celledyrkningsmedier at øge binding af tumorceller. Medier sammensat af DMEM eller RPMI-1640 (begge suppleret med 10% FCS og antibiotika) viste fastgørelse af celler på mindre end 50% af prøverne, hvorimod AmnioMax-C100 medium opnået fastgørelse i mere end 80% af prøverne (tabel 2). Kombinationen af ​​Miltenyi Biotec dissociation metode og AmnioMax-C100 medium blev anvendt i alle efterfølgende forsøg og resulterede i en kortsigtet enkelt lag BC tumor cellekultur inden for to dage efter tumor fjernelse.

UDS i blærekræft prøver

Funktionel NER-aktivitet blev analyseret i vedhæftede tumorceller fra 36 forskellige blæretumorer ved hjælp af UDS analysen. Derudover vurderede vi XPC-proteinniveauer i de samme celler ved immunfluorescensfarvning. Nettet til XPC og UDS blev udført under anvendelse helt metode, der sammenlignede gennemsnitlige farvningsintensitet af tumorceller, som de normale menneskelige C5RO fibroblaster, som blev co-dyrket på det samme dækglas som tumorcellerne. Fibroblasterne i blandede kulturer blev mærket med 2 um polystyrenkugler at diskriminere dem fra tumorcellerne (fig 2). Næsten 42% (15/36) af blæretumorer udtrykt mindst to gange lavere niveauer af XPC protein end samdyrket fibroblaster (0-50%) (tabel 3). De fleste tumorer vises næsten normale niveauer af XPC protein (50-180% af co-dyrkede fibroblaster). Vi har ikke observere XPC farvning intensiteter på mindre end 5%, et niveau, typisk for XPC-mangel fibroblaster (XP21RO) opnået fra en XP-patient (figur 3A). Bemærkelsesværdigt, viste XPC udtryk meget svag sammenhæng med UDS i disse tumorer: R

2 = 0,32 (figur 3B). De fleste tumorer med relativt lave XPC niveauer viste normale UDS niveauer (fig 2B og 3). Normale UDS (mere end 50% af co-dyrkede fibroblaster) blev observeret i 34 ud af 36 tumorprøver (tabel 3). To tumorer viste reduceret UDS (mindre end 50% af co-dyrkede fibroblastceller kontroller), men i en af ​​disse UDS var tæt på 50%, meget højere end observeret i XPC

– /- celler (fig 2C og 3A) . Den anden tumor viste XPC og UDS niveauer svarende til den i XPC

– /- celler. Desværre, på grund af manglende materiale kunne udføres nogen yderligere genetisk analyse på denne tumor. Afsluttende kan relativt lave niveauer af XPC udtryk stadig støtter NER aktivitet og nedsat XPC udtryk ikke nødvendigvis påvirke NER aktivitet i ex vivo dyrkede BC celler.

A. Øverst til venstre billede vises alle DAPI kerner. Til højre er en lys felt (BF) billede, hvor C5RO cellen er mærket med cytoplasmatiske polystyrenkugler. Næste: XPC fluorescerende farvning viser XPC proteinekspression af tumorceller at være den samme i forhold til tilstødende vildtype fibroblast. Øverst til højre billede: edu fluorescerende farvning viser UDS signal af tumorceller at være den samme i forhold til tilstødende vildtype fibroblast. B. midterste række billeder repræsenterer en blære tumor prøve med lavere XPC ekspression sammenlignet med C5RO celler dog normale niveau af UDS. C. Lavere række af billederne repræsenterer en blære tumor med lav XPC udtryk samt lave UDS niveauer. Hvid pil angiver vildtype C5RO celle. Andre kerner repræsenterer specifikke blærekræft prøve.

A. Hver tumor er repræsenteret med dens respektive score for XPC og UDS niveauer som en procentdel af co-dyrkede C5RO celler. Ingen tumorer vises XPC niveauer så lave som XP21RO, en XPC deficient cellelinje. En tumor viste UDS scoringer ligner XP21RO. B. Scatterplot af UDS og XPC snesevis af hver tumor. XPC niveauer er ofte lavere end 50%. To tumorer vise UDS niveauer af mindre end 50%, men fra et af disse UDS niveauerne ligger tæt på 50%. Determinationskoefficienten (R

2 = 0,32) angiver ingen eller meget svag sammenhæng.

Dette fund er uventet i lyset af en tidligere publikation viser, at XPC ekspressionsniveauerne varieret blandt en lille panel af individuelle etablerede BC cellelinier og at en cellelinie med lavt XPC proteinniveau var faldet DNA-reparation kapacitet. Vi opnåede denne cellelinie (HT-1197) fra ATCC indsamling og sammenlignet det med en BC cellelinje med normal XPC udtryk (T24). Overraskende, vi ikke observere en forskel i XPC protein niveauer eller UDS niveauer blandt normale fibroblaster, T24 og HT-1197 celler, selvom fibroblaster afledt af en XP patient (XP21RO) viste tydeligt reduceret XPC protein niveauer og reduceret UDS (S3A Fig) . Efterfølgende sammenlignede vi XPC niveau af HT-1197 og andre kendte XPC-dygtige og deficiente celler ved immunoblotting (S3B Fig). Igen havde HT-1197 ikke vise et reduceret XPC niveau, mens de kendte XPC-mangelfulde celler viste en klar mangel på XPC protein. Vi analyserede også følsomheden af ​​HT-1197 og T24 for UV-C-stråling ved at udføre en koloni overlevelse assay og fandt ingen forskel i følsomhed (S3C Fig). Derfor konkluderer vi, at HT-1197 ikke har en nedsat XPC proteinniveau eller reduceret NER kapacitet.

XPC udtryk og tilbagefald risiko for BC

Endelig, for at undersøge, om tumor tilbagefald har nogen indflydelse på XPC proteinekspressionsniveauer vi samlet yderligere klinisk relevante data og sammenlignet XPC protein niveauer fra primær NMIBC til den af ​​tilbagevendende NMIBC. XPC niveauer adskilte sig ikke signifikant (Mann-Whitney, p = 0,58) mellem disse to grupper (S4A Fig). Også XPC protein niveauer ikke signifikant forskellig (Mann-Whitney, p = 0,77) mellem tumorer, der viste tilbagefald inden for et år, og tumorer, der ikke gjorde. Disse data blev frembragt fra patient opfølgning, uanset om en analyseret BC prøve var en primær tumor eller en gentagelse (s4b Fig). Dette indebærer, at XPC ekspressionsniveauerne dårligt korrelerer med risiko for fornyet NMIBC.

Diskussion

I tråd med tidligere undersøgelser [13,14], fandt vi, at svækket XPC proteinekspression er en fælles fænomen i BC, både i dissocierede tumorceller samt i FFPE prøver. Men tidligere undersøgelser ikke analysere funktionel NER aktivitet i BC. Derfor har vi udviklet en

ex vivo

cellekultur til at udføre UDS analyser, en funktionel test for NER aktivitet. Her bekræfter vi, at XPC udtryk varierede meget blandt primære BC prøver, men overraskende, vi fandt, at sænkede XPC protein niveauer ikke generelt påvirke NER kapacitet i BC. Mere vigtigt synes funktionelt NER-mangel at være langt mindre hyppige i BC end det ville være forventet baseret på tidligere undersøgelser. Reducerede niveauer af XPC protein i disse tumorer forekom tilstrækkelig til funktionelt understøtte NER. Derudover har vi ikke observere en sammenhæng mellem XPC udtryk og tumor lønklasse eller scene, heller ikke vi observere en relation med tumor recidiv risiko. Vi konkluderer, at XPC protein niveauer bør ikke anvendes som biomarkør for at vælge blæretumorer til nedsat DNA-reparation kapacitet.

I den foreliggende undersøgelse, viser vi, at alvorlige funktionelle NER defekter, der giver overfølsomhed over for kemikalier forårsager NER-repareres skade, er sjældne i BC. Derfor er det usandsynligt, at forringet NER aktivitet kan udnyttes terapeutisk i BC. Endvidere kan hyppigheden af ​​XPC defekter i BC overvurderes i litteraturen, som vi ikke fandt en XPC heller NER defekt i HT-1197 cellelinje, for som tidligere blev rapporteret at huse sådanne defekter [13]. Forskelle i påvisningsmetoden af ​​XPC ekspressionsniveauer eller DNA-reparation kapacitet kan forklare disse uoverensstemmelser. Ikke desto mindre er mange rapporter tyder på, at

XPC

gen polymorfier kan påvirke BC risiko eller prognose [10,12,21]. Det er stadig uvist, om disse polymorfier indflydelse XPC udtryk, men det kan være, at den sænkede XPC udtryk og polymorfier har en subtil indflydelse på NER aktivitet, som kunne bidrage til øget mutagenese og carcinogenese, især i tilfælde af eksponering for visse DNA-ødelæggende midler, f.eks cigaretrøg. Vores undersøgelse er den første til at beskrive sammenhængen mellem funktionelle NER aktivitet og XPC proteinniveauer målt direkte i primær blærekræft. I vores analyse, NER aktivitet på mere end 50% (af co-dyrkede fibroblaster) blev anset normal og en mild nedgang vil ikke blive samlet op. På den anden side, analyser UDS udført på flere NER gen defekter, i mus samt humane celler, viser signifikant sænkede NER aktiviteter (mindre end 50% af co-dyrkede fibroblaster). Det konkluderer, at UDS analysen er egnet til at detektere en NER mangel. I XP21Ro celler tilsyneladende XPC niveauer på omkring 5% korrelerede godt med de 10% resterende NER aktivitet. Ingen af ​​de analyserede tumorer viste dette lave niveau af XPC, hvilket antyder, at de observerede XPC niveauer kan støtte næsten normal NER og at XPC sandsynligvis ikke bedømme begrænsende på disse tumorer. Ex vivo primær tumor kulturmodel anvendt i denne undersøgelse var specielt konstrueret og optimeret for nøjagtigt analysere NER kendetegn for de enkelte blære tumorprøver. Den primære tumor blev dissocieret og cellerne blev dyrket på dækglas at lette standardiserede UDS assays og XPC målinger ved immunfluorescerende billeddannelse. Denne kultur-systemet viste robust reproducerbarhed og derfor kan bruges til at screene kliniske tumor prøver vha funktionelle

ex vivo

analyser. Den høje succesrate på denne metode forhindrer indføring af en markering forspænding forårsaget af udvækst af kun en undergruppe af kliniske cancer prøver. Derfor kan dette dyrkningsmetode bidrage til identifikationen af ​​biomarkører, som kan forudsige respons på anti-cancer behandlinger

Vores eksperimentelle design har den fordel, at andre celler kan co-dyrkes med tumorcellerne som interne kontroller, fjerne eksperimentel variabilitet mellem prøver. Faktisk kan flere kontrolceller inkorporeres under anvendelse polystyrenkugler med forskellig størrelse eller fluorescerende farve. På den måde, vi bemærkede også, at en tumor med lavere UDS viste højere niveauer af resterende reparation kapacitet end en XPC

– /-. Celle, hvilket indikerer, at NER ikke var helt ophævet i at prøve

Således vigtigt første konklusion fra vores resultater er, at XPC niveauer ikke kan anvendes som biomarkør til at guide terapi valg eller behandling respons på NER-repareres DNA-skadelige stoffer i BC. Vi konkluderer også, at

ex vivo

kultur-system og UDS assay er velegnede værktøjer til at identificere tumorer (andre end BC) med nedsat NER aktivitet. Endvidere kunne hidtil ukendte funktionelle DNA reparation assays udvikles til at vurdere aktiviteten af ​​andre DNA reparationsmekanismer i tumorceller og i sidste ende identificere DNA-reparationsmekanismer defekter, der kan udnyttes terapeutisk. Især denne undersøgelse understreger den store betydning af funktionelle assays til at evaluere resultaterne af mere indirekte målinger, såsom RNA og protein ekspressionsniveauerne.

Støtte Information

S1 Fig. Immunoreaktivitet scoringssystem (IRS).

A. IRS pointsystem. B. Repræsentative billeder af XPC farvning på blære kræft prøver for forskellige kategorier af IRS

doi: 10,1371 /journal.pone.0126029.s001

(PDF)

S2 Fig. Små klumper af celler knyttet til dækglas.

A. Repræsentative lyse felt billeder viser forskellige klumper af den samme tumor knyttet til dækglasset og spredning ud. B. I tilfælde af passende fastgørelse størstedelen af ​​celler farvet positive for cytokeratin 18, hvilket indikerer en ren tumor cellekultur og ingen kontaminerende fibroblaster. Blå = DAPI, Grøn = cytokeratin 18.

doi: 10,1371 /journal.pone.0126029.s002

(PDF)

S3 Fig. HT-1197 viser normale XPC protein og UDS niveauer.

A. Immunofluorescerende billeder sammenligne XPC og UDS niveauer af XP21RO, T24 og HT-1197 celler til det i C5RO celler. XP21RO er kendt for at være mangelfuld i XPC og UDS. Ingen forskel ses mellem T24 og HT-1197. Blå = DAPI, BF = Bright Field billede, der viser C5RO celler mærket med 2 um polystyren perler, Grøn = XPC udtryk niveau, Rød = UDS niveau. Hvide pile angiver kernerne i den respektive cellelinje. B. Immunblot for XPC sammenligne HT-1197 til T24, kendt XPC mangelfulde og vildtype fibroblaster. C. Colony overlevelse assay viser kolonidannelse kapacitet HT-1197 og T24-celler efter UV-stråling. Ingen forskel mellem HT-1197 og T24 overholdes. Fejl søjler indikerer standardafvigelsen baseret på fire uafhængige forsøg

doi:. 10,1371 /journal.pone.0126029.s003

(PDF)

S4 Fig. XPC protein niveauer og gentagelse af tumorer.

A. Tumorer blev delt i to grupper, primære tumorer og tilbagevendende tumorer og standardiserede XPC protein udtryk scoringer blev sammenlignet fra disse grupper. blev ikke observeret nogen signifikant forskel mellem disse grupper. Mann-Whitney-test, p = 0,58. B. Patient opfølgende data, der indikerer ingen forskel mellem XPC niveauer fra tumorer, der ikke ville gentage sig inden for et år af TUR og tumorer, der ville gentage sig. Hvert datapunkt repræsenterer en tumor. Vandret linje repræsenterer median og fejl søjler indikerer interkvartile område

doi:. 10,1371 /journal.pone.0126029.s004

(PDF)

Tak

Forfatterne vil gerne takke den kliniske hold af Urologi afdelingen og Patologi afdeling af Erasmus Medical center i Rotterdam for støtte i at indsamle forskningsmateriale.