PLoS ONE: prohibitin Expression Deregulering i Gastric Cancer er forbundet med 3′-utranslaterede region 1630 C & gt; T Polymorfi og Copy Number Variation

Abstrakt

PHB er en rapporteret onkogen og tumor suppressor i mavekræft. Her har vi vurderet, om

PHB

kopi nummer og rs6917 polymorfi påvirke dens udtryk i mavekræft. Nedregulering og opregulering af

PHB

blev observeret i de evaluerede tumorer. Reduceret udtryk var forbundet med tumor dedifferentiation og kræft indvielse. T allel af rs6917 polymorfi var forbundet med reduceret

PHB

mRNA-niveauer. Endvidere er den opregulering af

PHB

optrådte reguleres med forstærkningen af ​​yderligere genkopier. Således

PHB

kopi nummer variation og differentieret udtryk for rs6917 polymorfi kan spille en rolle i

PHB

transkriptionel regulering

Henvisning:. Leal MF, Cirilo PDR, Mazzotti TKF , Calcagno DQ, Wisnieski F, Demachki S, et al. (2014) prohibitin Expression Deregulering i Gastric Cancer er forbundet med 3′-utranslaterede region 1630 C T Polymorfi og Copy Number Variation. PLoS ONE 9 (5): e98583. doi: 10,1371 /journal.pone.0098583

Redaktør: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, USA

Modtaget: Februar 17, 2014 Accepteret: 5 maj 2014; Udgivet: 30. maj 2014

Copyright: © 2014 Leal et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPESP), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, RC, MACS og RRB) og Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, MFL, PDRC og DQC ) som tilskud og fællesskab prisuddelinger. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. RC er en akademisk Editor til PLoS ONE. De andre forfattere har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser for dem. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE Redaktionelle politikker og kriterier.

Introduktion

mavekræft (GC) er den fjerde mest almindelige kræftform og den anden hyppigste årsag til kræft-dødsfald verdensplan [1]. Trods betydelige fremskridt i studiet af GC, de molekylære ændringer, der er involveret i gastrisk carcinogenese forblive ukendt.

kromosom 17 er en af ​​de mest almindelige kromosomer udviser antalsafvigelser i GC (se gennemgang [2]). Vores gruppe har tidligere rapporteret tilstedeværelsen af ​​kromosom 17 aneuploidi, både gevinster og tab, i GC i individer i det nordlige Brasilien [3], [4], [5], [6] og i alle GC cellelinjer etableret fra neoplasier i dette befolkning [7], [8]. Derfor kan denne kromosom indeholder vigtige gener involveret i gastrisk carcinogenese.

prohibitin-1 (

PHB

) gen maps til kromosom 17q21 locus. Dette gen koder for et allestedsnærværende, evolutionært bevaret protein, der findes i en lang række organismer, herunder bakterier, planter, gær, protozoer og pattedyr [9]. PHB blev oprindeligt menes at spille en central rolle ved inhibering af celle-cyklus progression. For nylig PHB er blevet karakteriseret som en chaperone involveret i stabiliseringen af ​​mitokondrielle proteiner; Således har PHB blevet impliceret i adskillige cellulære processer, herunder reguleringen af ​​proliferation, apoptose og gentranskription [10].

PHB synes at spille en rolle i udviklingen af ​​forskellige kræfttyper. Overekspression af PHB er blevet rapporteret i kræft i livmoderhalsen, spiserør, bryst, lunge, blære, skjoldbruskkirtel, ovarie og prostata. I modsætning hertil reducerede PHB ekspression er blevet observeret i gliomer og somatiske mutationer i

PHB

er blevet påvist i sporadiske brystcancere [9]. Desuden er en funktionel enkelt-nukleotid polymorfisme (SNP) i

PHB

gen, ændre en cytosin til en thymin ved position 1630 in 3’UTR (rs6917), skaber en variant, som mangler antiproliferativ aktivitet [11] , [12] og efterfølgende kan øge risikoen for malign vækst. T allel af denne SNP er blevet forbundet med en øget risiko for brystcancer [13] og melanom [14]. Derfor rolle PHB i kræft proliferation og /eller undertrykkelse stadig kontroversielt.

rolle PHB i gastrisk carcinogenese er ikke fuldt belyst. Nogle tidligere undersøgelser har beskrevet øget PHB udtryk i GC prøver [15], [16], [17], [18] og serum af GC patienter [19]. Imidlertid har andre undersøgelser rapporteret PHB nedregulering i denne type kræft [20], [21]. Undersøgelsen af ​​de molekylære mekanismer, der er involveret i den transkriptionelle regulering af

PHB

kan give ny indsigt i sin rolle i GC og bidrage til udviklingen af ​​nye anticancer behandlinger.

I denne undersøgelse vi først evalueres mRNA og protein ekspression af PHB i GC og matchede ikke neoplastiske gastriske vævsprøver. Desuden de mulige sammenhænge mellem

PHB

og klinisk-patologiske egenskaber blev undersøgt. Fordi den

PHB

gen er beliggende i en kromosomal region ofte involveret i antalsafvigelser i GC [2], vi evalueret også

PHB

kopi nummer i tumor prøver. Desuden allel-specifikke udtryk for

PHB

mRNA blev vurderet til at undersøge den relative transskription af hver allel i heterocygote med rs6917 polymorfi som en mulig mekanisme er involveret i

PHB

regulering. Til vores viden, er der ikke tidligere undersøgelse evaluerede

PHB

kopi nummer og allel-specifik ekspression i tumorprøver.

Materialer og metoder

vævsprøver

otteogfyrre par af GC-prøver og tilsvarende ikke neoplastiske gastriske vævsprøver ( 5 cm fra kanten af ​​tumoren) blev anvendt til at evaluere

PHB

mRNA-ekspression og SNP rs6917 genotype. I 38 af disse GC prøver,

PHB

kopi nummer blev også vurderet. PHB immunoreaktivitet blev evalueret i 12 GC prøver.

Alle de gastriske prøver blev opnået fra patienter, som gennemgik gastrektomi for GC på João de Barros Barreto Universitetshospital (HUJBB) i det nordlige Brasilien. Alle patienterne havde negative historier af udsættelse for enten kemoterapi eller strålebehandling før operationen, og der var ingen samtidig forekomst af andre diagnosticeret cancere. Skriftligt informeret samtykke med godkendelse af den etiske komité af HUJBB blev opnået.

En del af hver dissekerede tumor prøve var formalin-fikseret og paraffin indstøbt (FFPE). Dele af FFPE væv blev farvet med hæmatoxylin-eosin til histologisk evaluering eller anvendes til immunhistokemi (IHC) analyse. Yderligere portioner hver tumor og parrede ikke neoplastiske vævsprøve blev lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil nukleinsyreoprensning.

Alle prøverne blev klassificeret ifølge Lauren [22], og tumorerne blev iscenesat ifølge TNM mellemstationer kriterier [23].

DNA og mRNA Purification

Totalt DNA og mRNA blev samtidig isoleret fra gastriske vævsprøver under anvendelse af et AllPrep DNA /RNA /Protein kit (Qiagen, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. DNA- og RNA-koncentrationer og kvalitet blev bestemt ved anvendelse af et NanoDrop spektrofotometer (Kisker, Tyskland), og RNA’et integritet blev bestemt ved gelelektroforese.

PHB Gene Expression

PHB

ekspression blev vurderet ved revers transkription kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR). Først blev komplementært DNA (cDNA) syntetiseret under anvendelse af en High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Polen) ifølge fabrikantens protokol. Real-time RT-qPCR-analyse blev udført ved anvendelse QuantiFast SYBR Green Master Mix (Qiagen, tysk) på en 7500 Fast Real-Time PCR maskine (Applied Biosystems, USA). Følgende primere (150 nM hver) var designet til RT-qPCR forstærkning:

PHB

F5′-GTGTGGTTGGGGAATTCATGTGG-3 ‘og R5′-CAGGCCAAACTTGCCAATGGAC-3’;

ACTB

F5′-AGAAAATCTGGCACCACA-3 ‘og R5′-AGAGGCGTACAGGGATAG-3’. Alle reaktionerne blev udført tre gange for både målgenet og den indre kontrol (

ACTB

).

PHB

udtryk blev normaliseret til

ACTB

udtryk. Den overflod af mRNA-ekspression blev justeret ved forstærkning effektivitet (

PHB

= 99%,

ACTB

= 102%) [24]. En ikke-neoplastisk gastrisk vævsprøve blev udpeget som en kalibrator for hver parret tumor til at beregne den relative kvantificering (RQ) [24].

PHB Protein Expression

De paraffinsnit blev udsat for IHC . Tumor vævssnit (3 eller 4 mm tykke) blev afparaffiniseret i xylen og rehydreret i en gradueret ethanol serie. Epitopgenfinding blev udført i citratbuffer, pH 6,0, i fugtig varme i en trykkoger. Derefter blev vævssnittene inkuberet med et primært muse-monoklonalt antistof mod PHB (II-14-10, fortynding 1:100; ThermoFisher Scientific, USA). Lokaliteter af immunoreaktivitet blev visualiseret under anvendelse af et SuperPicture Polymer detektion kit (Invitrogen, USA). Objektglassene blev set ved lysmikroskopi under anvendelse af et Nikon Eclipse E600 mikroskop (Nikon, USA) udstyret med et digitalt Nikon DSM1200F kamera (Nikon, USA). Den ikke-farvede region (hvidt område) blev udvalgt og indstillet som baggrund. Enhver farvning blev anset for at være et positivt resultat, uanset intensiteten. Negative kontroller, hvori det primære antistof blev erstattet af 5% bovint serumalbumin (BSA) i phosphatbufret saltvand (PBS), blev inkluderet i alle serier, og dele af normalt humant prostatavæv blev anvendt som positive kontroller.

PHB

Copy Number

at evaluere kopi nummer variationer (CNV), qPCR udførtes under anvendelse af kvantitative TaqMan CNV analyser (Life Technologies, USA) for

PHB

gen (Hs00178432_cn) og for den interne kontrol

RNAse P

(# 4.403.326). Multiplex qPCR reaktioner blev udført i fire eksemplarer med gDNA ifølge producentens protokol og cykling betingelser i et 7500 Fast Real-Time PCR maskine (Life Technologies, USA). Det relative kopiantal af hver prøve blev estimeret ved hjælp af Copy Caller Software V1.0 (Life Technologies, USA). Kommercielle menneskelige gDNAs (G1471 og G1521, Promega, USA) blev anvendt til kalibrering

PHB

Genotypning

DNA fra ikke-neoplastiske prøver blev brugt til

PHB.

genotypning. Individerne blev genotypebestemt for rs6917 polymorfi ved hjælp af Tilpasset TaqMan SNP prober og primere (Applied Biosystems, Foster City, CA). Følgende primere og prober blev MGB designet til allel diskrimination: primere F5′-TTGGTCCCTCTCAGATACCCA-3 ‘og R5′-CCGTGAGAAGGGCAGTCTCT-3′; FAM-mærket probe 5’-CTGCCAAAGACGTGT-3 ‘; og mindre allel VIC-mærket probe 5’-CTGCCAAAGATGTGT-3 ‘.

PHB

allel-specifik Expression

Allel-specifik ekspression blev først bestemt ved sekventering. Tyve til 40 ng DNA eller cDNA blev anvendt som template for PCR-amplifikation med primerne anvendt til

PHB

genotypebestemmelse. Før sekventering blev PCR-produkterne separeres ved anvendelse af 2% agarose-gelelektroforese, og den specifikke bånd blev ekstraheret og oprenset. Sekventering blev udført under anvendelse af fremadrettet primer anvendt til PCR-amplifikation og en BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA). Sekventeringsprodukter blev separeret ved anvendelse af et ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Nogle af prøverne blev analyseret mindst to gange, herunder særskilte RT-PCR’er og sekventering assays.

allele ekspressionsniveauer blev bestemt under anvendelse PeakPicker software [25]. Softwaren blev anvendt til først at udføre en normalisering trin, hvor SNP allel højde blev sammenlignet med højden af ​​reference- toppe i flankerende sekvenser. Vi begrænset denne normalisering trin til inden for en 21-base-vindue. Ratio værdier over 1 blev transformeret til 1 /(ratio) at transformere alle værdierne til en 0-1 skala, og værdierne blev derefter indstillet til middel af topintensiteten nøgletal fra en reference-DNA-prøve er heterozygot for rs6917 polymorfi. Genomisk DNA fra heterozygotiske (N = 3) og homozygotiske prøver (N = 3, for genotype CC, N = 2, for genotype TT) blev anvendt til at validere analysen og at bekræfte allele forhold på 50:50 og 0:100, henholdsvis. Desuden blev cDNA fra vævsprøver (tumorale og ikke-tumorale prøver) fra de to emner er homozygote for den mindre allel i rs6917 polymorfisme også anvendt som kontroller.

allelspecifik

PHB

ekspression blev også evalueret i heterozygotiske prøver ved hjælp af RT-qPCR, som tidligere beskrevet [26]. Ved hjælp af en brugerdefineret TaqMan SNP genotypebestemmelsesassay for

PHB

genotypning, genereret vi en lineær regression kurve for log10 fluorescensintensitet

vs

log10 allel på basis af det serielle fortynding af CC- og TT genotypede genomiske DNA fra kontrolprøver (prøver fra to homozygote individer) i flere forhold (CC: TT 8:01, 4:01, 2:01, 1:01, 1:02, 1:04, 1:08) ved RT -qPCR (figur 1A). Den allele forhold på genekspression blev ekstrapoleret ved skæringen af ​​log10 af FAM: VIC intensitet på standardkurven. ROX (intern reference farvestof) og ikke-specifik FAM og VIC fluorescens blev normaliseret i alle analyser. Alle reaktionerne blev udført i to eksemplarer.

A) Loggen

10 af FAM /VIC intensitet ratio for

PHB

plottet mod log

10 af FAM /VIC allel forholdet mellem blande homozygote DNA ved forskellige forhold (8:01, 4:01, 2:01, 1:01, 1:02, 1:04, 1:08 FAM /VIC allel). B)

PHB

ekspression ved rs6917 genotype i gastriske prøver. C) C /T allele-forhold i cDNA fra gastriske prøver af heterozygote patienter ved sekventering; D) FAM /VIC allel-forhold i gastriske prøver af heterozygote patienter ved hjælp af en tilpasset Genotypebestemmelse TaqMan assay, i hvilket en specifik probe for C-allelen blev mærket med FAM farvestof og en mindre allel T probe blev mærket med VIC farvestof. * Differentielt udtrykt mellem grupper af T-test for uafhængige stikprøver,

P

. 0,05

For de heterozygote cDNA prøver, allele nøgletal 0,8 eller 1.2 var betragtes som vejledende af allel-specifik ekspression.

Statistisk analyse

for mRNA-ekspression analyse, vi først vurderede den antagelse, at de data, der havde en normal fordeling ved hjælp af Shapiro-Wilk normalitet test for at finde et passende tests for de efterfølgende statistiske sammenligninger.

PHB

mRNA niveauer blev ikke normalfordelte og blev omdannet (z-score) til analyse. Observationer 2 eller -2 blev betragtet outliers og udelukket fra analyserne. En parret t-test blev udført for at sammenligne middelværdien

PHB

ekspression mellem ikke-neoplastiske og tumorprøver. T-test for uafhængige prøver og envejs ANOVA efterfulgt af Games-Howell post-hoc test blev anvendt til at vurdere de mulige sammenhænge mellem

PHB

ekspression og klinisk-patologiske karakteristika, protein immunreaktivitet, genkopital og genotype . Chi-square test eller Fishers eksakte test blev anvendt til at vurdere forholdet mellem

PHB

kopi nummer og immunoreaktivitet og klinisk-patologiske faktorer. Pearsons korrelation blev anvendt til at vurdere en mulig korrelation mellem sekventering og TaqMan assay for allelspecifik ekspression analyse. I alle analyserne,

P

. 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

PHB

mRNA ekspression i Gastric tumorer

PHB

udtryk var ikke forskellig mellem neoplastiske og matchede ikke-neoplastiske gastriske prøver (0,173 ± 0,255

vs

0,227 ± 0,297,

P

= 0,149). Imidlertid blev mRNA-niveauerne reduceret mindst 1,5 gange i 20 (45,5%) af de GC-prøver og voksede i 9 (20,5%) sammenlignet med parrede ikke neoplastiske gastriske vævsprøver.

Tabel 1 viser sammenhængen mellem

PHB

udtryk og de klinisk-patologiske kendetegn samt protein immunoreaktivitet, rs6917 genotype og gen kopi nummer. Dårligt differentierede tumorer præsenteres reduceret

PHB

udtryk sammenlignet med moderat differentierede tumorer (

P

= 0,029; tabel 1). Men både dårligt differentieret GC (0,025 ± 0,022

vs

0,239 ± 0,303;

P

0,001, ANOVA efterfulgt af Games-Howell post-hoc test) og moderat differentieret GC (0,057 ± 0,051

vs

0,239 ± 0,303;

P

0,001, ANOVA efterfulgt af Games-Howell post-hoc test) præsenterede reduceret

PHB

udtryk i forhold til ikke- neoplastiske gastrisk vævsprøver

Reduceret

PHB

udtryk var forbundet med lavere invasion (

P

= 0,002; tabel 1). og et fravær af lymfeknude metastaser (

P

= 0,040; tabel 1). Desuden præsenteres tidligt GC reduceret

PHB

udtryk sammenlignet med avanceret GC (

P

= 0,002; tabel 1). Desuden er det kun tidligt GC præsenteret en betydelig reduktion i

PHB

mRNA niveauer sammenlignet med de ikke-neoplastiske prøver (0,044 ± 0,027

vs

0,239 ± 0,303,

P

0,001, ANOVA efterfulgt af Games-Howell post-hoc test).

PHB Immunreaktivitet i Gastric tumorer

Protein immunfarvning blev observeret i alle de tumorprøver evalueret af IHC (tabel 2). I alle tilfælde blev PHB immunreaktivitet detekteret i neoplastiske og ikke neoplastiske celler, herunder tarm metaplastisk og inflammatoriske celler (figur 2A-H). PHB blev primært udtrykkes i cytoplasmaet. Farvningsintensiteten og procentdelen af ​​immunoreaktive celler varierede blandt de undersøgte tilfælde (tabel 2). Prøver der præsenterer 80% af tumorcellerne med PHB immunreaktivitet viste reduceret mRNA-ekspression (

P

= 0,036, tabel 1)

A) PHB farvning i normal gastrisk mucosa (400x).; B) PHB immunoreaktivitet i normale gastriske mucosa og inflammatoriske celler (400x); C) stærk PHB farvning i intestinale metaplastiske celler (400x); D) stærk PHB farvning i en intestinal-type, tumor; E) moderat til intens PHB immunoreaktivitet i en dårligt differentieret tumor; F) moderat til intens PHB immunoreaktivitet i en moderat differentieret tumor; G) svag PHB farvning i et moderat differentieret tumor (400x); D) svag PHB farvning i en diffus type tumor (400x).

PHB

Kopier Antal i Gastric tumorer

PHB

blev opformeret i 13 af 38 (34,2%) tumorer, herunder 2 prøver med 4 eksemplarer. Ingen tumor præsenteret en

PHB

sletning. Interessant, 3 prøver, der præsenteres outlier værdier for

PHB

mRNA ekspression præsenterede også genamplifikation. Derfor, når outlier værdier blev inkluderet i analysen,

PHB

udtryk var højere i prøver med genamplifikation end i dem uden genamplifikation (median ± interkvartile område: 0,344 ± 0,335

vs

0,047 ± 0,07;

P

= 0,003, ikke-parametriske Mann-Whitney-test, figur 3).

PHB

gevinst var forbundet med sent debuterende GC sammenlignet med tidlig debut GC (

P

= 0,022; tabel 2). Ingen sammenhæng mellem

PHB

kopi nummer og protein immunoreaktivitet eller andre klinisk-patologiske egenskaber blev fundet (tabel 3).

Linjer viser median og interkvartile vifte af

PHB

udtryk. * Differentielt udtrykt mellem grupper af Mann-Whitney test,

P

. 0,05

PHB

allel-specifik Expression

Vi undersøgte også, om tilstedeværelsen af ​​den mindre allel i rs6917 var forbundet med genekspression deregulering i GC patienter. I vores stikprøve, 11 af 48 patienter (22,9%) var heterozygote og 2 patienter (4,17%) var homozygote for den mindre allel i rs6917 polymorfisme. Alle prøverne med T-allelen præsenterede 2 kopier af

PHB

gen. Tilstedeværelsen af ​​T-allelen i rs6917 polymorfisme var forbundet med reduceret

PHB

udtryk i GC (

P

0,001; tabel 1 figur 1B) og i ikke-neoplastiske prøver (betyder ± SD:. 0,302 ± 0,325

vs

0,045 ± 0,043;

P

0,001; Figur 1B)

Et par af heterozygote prøver (tumor og ikke-tumor) blev ikke brugt til analyse af allelspecifik ekspression. blev registreret en sammenhæng mellem allel forholdet mellem rs6917 polymorfi bestemt ved sekventering og TaqMan assay (

P

= 0,003; r = 0,627). Ved sekventering, ca. 50% af tilfældene præsenteret differentiel allel ekspression (figur 1C). viste imidlertid TaqMan assay, at T og C alleler præsenteret forskellen allel udtryk i de fleste patienter (Figur 1D). Graden af ​​forskel i ekspression mellem de to alleler varierede mellem individer. T til C allelisk ekspression forholdet var ens i de fleste par af tumor- og ikke-tumorprøver. Kun en patient præsenteret en højere C /T-forhold i både tumor- og ikke-neoplastiske prøver i begge assays. I de fleste tilfælde blev en lavere C /T-forholdet opdages, uanset den anvendte metode (figur 1C og 1D). Ingen sammenhæng mellem forskellen allel udtryk og alder debut eller anden klinisk-patologisk variabel blev opdaget.

Diskussion

PHB synes at være afgørende i cellulær homeostase. Nylige undersøgelser har antydet, at PHB kan virke som et pro-tumorigen og anti-tumorigene faktor i flere celletyper (se gennemgang [10]). I den foreliggende undersøgelse, protein- og mRNA-ekspression profiler af PHB præsenteret en heterogen mønster blandt tumorprøver. Selvom vi ikke finde en signifikant forskel mellem GC- og matchede ikke neoplastiske prøver, observerede vi, at mRNA-niveauet blev reduceret 1,5 gange i 45,5% af GC-prøver og voksede i 20,5% af tumorer. Den reducerede mRNA-ekspression skyldtes delvis en reduceret frekvens af tumorceller præsenterer PHB immunreaktivitet, som fremhæver heterogenitet blandt tumor celle kloner.

Liu et al. [21] beskrevne reduceret mRNA-ekspression i fire gastriske tumorer sammenlignet med deres tilsvarende normale væv, hvilket til dels bekræfter vore resultater. Støtte en anti-tumorigen rolle, PHB blokerer indrejse i S-fasen [27]. Hertil kommer, at vildtype-rs6917

PHB

3’UTR alene er i stand til at hæmme cellecyklus progression [11], [28] og tumorvækst [12] samt reducere celle mobilitet [29]. Endvidere PHB spiller en rolle i opretholdelsen af ​​normal mitochondriel funktion og morfologi [30]. Det er blevet foreslået, at tabet af mitokondriel PHB ekspression (cytoplasmatisk lokalisering, som observeret i vores prøver) kan føre til accelereret proteolyse af membranproteiner og forringer funktionen af ​​den mitokondriske respiratoriske kæde [10]. Vores tidligere proteom undersøgelse viste, at adskillige proteiner, der er involveret i energistofskiftet pathways (mitokondriel dysfunktion, pyruvat metabolisme, oxidativ phosphorylering, citrat cirkel, glycolyse /glukoneogenese) blev dereguleret [31] og foreslog, at fremtrædende mitokondrielle funktioner kan ændres, flytte energiproduktionen i GC celler og tyder på Warburg effekten [32].

Til vores viden, få studier har vurderet den mulige sammenhæng mellem

PHB

mRNA-niveauer og rs6917 polymorfi. I en undersøgelse, Tang et al. ikke observere en signifikant sammenhæng mellem den rs6917 polymorfi og mRNA-ekspression i lymfoblastoidcellelinier inkluderet i HapMap databasen [33]. Imidlertid rapporterede disse forfattere, at T-allelen var forbundet med en forøget risiko for brystcancer. I den foreliggende undersøgelse, vi vist, at tilstedeværelsen af ​​T-allelen i rs6917 polymorfisme var forbundet med reduceret

PHB

udtryk i ikke-neoplastiske og neoplastiske gastriske celler. Den rs6917 polymorfisme er placeret i 3’UTR og er kun til stede i isoform 1 af PHB, som blev påvist i den foreliggende undersøgelse ved cDNA-sekventering og et TaqMan assay. Den 3’UTR indeholder flere

cis

– og

trans

-elementer, og disse strukturer har en udbredt indflydelse på mRNA oversættelse, stabilitet og subcellulære lokalisering [34], [35], [36 ]. T variant skaber et potentielt bindingssted for microRNA har-miR-1292 og har-886-5p (https://snpinfo.niehs.nih.gov/cgi-bin/snpinfo/mirna.cgi?2_rs6917), der kan ændre genekspression ved enten mRNA henfald eller translation. Andre microRNA var tidligere forbundet med reguleringen af ​​

PHB

udtryk i GC. Liu et al. [21] har rapporteret, at

PHB

reguleres af MIR-27a, som er almindeligt opreguleret i GC. Forfatterne foreslog, at nedregulering af

PHB

af denne microRNA kan forklare, hvorfor undertrykkelse af miR-27a kan hæmme GC cellevækst. Derudover 3’UTR af

PHB

koder for en antisense-RNA (Gene ENSG00000250186; HAVANA https://www.sanger.ac.uk/). Tilstedeværelsen af ​​sjældne allel i antisense RNA kan ændre den sekundære struktur og formindske kcal /mol sammenlignet med sekvensen wide-type, der anvender CLC RNA Workbench 4.0 software (data ikke vist). Derfor kan rs6917 polymorfi føre til

PHB

nedregulering ved at skabe nye microRNA target websteder eller gennem dens regulering af antisense RNA i mavens celler og dermed bidrage til gastrisk carcinogenese.

I vores prøver, de fleste af de heterozygote patienter præsenteres forøget ekspression af T-allelen i forhold til C-allel. Forskellen i de relative mRNA-niveauer for de to alleler kunne være resultatet af forskelle i transkription eller mRNA-stabilitet, og de viser, at denne polymorfi præsenterer en

cis

virkning i gastriske celler. Til vores viden, er dette den første undersøgelse for at vurdere forskellen

PHB

allel-specifik ekspression i tumorprøver. Tidligere undersøgelser har vist, at en

PHB

variant med T-allelen i position 1630 in 3’UTR mangler antiproliferative og tumorvækst undertrykkelse evner in vitro og i dyremodeller [29]. Derfor er tilstedeværelsen af ​​T-allelen, især når det præsenterer forhøjet ekspression i forhold til C-allel, kan inducere en “svamp effekt” til post-transkriptionelle regulatorer såsom miRNA og bidrager til gastrisk celleproliferation, prædisponerende heterozygote individer end GC.

den mulige effekt af

PHB

nedregulering – på grund af rs6917 polymorfi, for eksempel – på GC risiko er i overensstemmelse med de associationer mellem reduceret

PHB

mRNA og lavere invasion, manglende lymfeknude metastaser og tidlige fase GC. Til vores viden, er der ikke tidligere undersøgelse i litteraturen vurderet den mulige sammenhæng mellem

PHB

udtryk og GC prognostiske faktorer. Disse resultater tyder på, at

kan være påkrævet PHB

nedregulering for tumor initiering.

Imidlertid har tidligere proteomiske undersøgelser rapporteret PHB opregulering i gastriske tumorer [15], [16], [17] . Derudover Kang et al. [18] har rapporteret overekspression af PHB protein og mRNA i GC (sammenlignet med tilstødende normale gastriske væv) i asiatiske individer. I vores stikprøve, 20,5% af tumorer også præsenteret øget

PHB

udtryk. PHB synes at spille en rolle i celleproliferation, adhæsion og migration, og derfor i udviklingen af ​​malign transformation gennem RAS-RAF signalering [37]. Vi hypotesen, at en øget

PHB

mRNA-niveau er nødvendig for GC progression. Evalueringen af ​​humane prøver kun tillader undersøgelse af et enkelt tidspunkt (på tidspunktet for kirurgisk reparation); således kan vi ikke at evaluere den dynamiske regulering af genekspression. Men

PHB

udtryk er sandsynligvis relateret til den cellulære kontekst og molekylær baggrund af gastriske celler.

Kang et al. [18] har rapporteret, at PHB-protein og mRNA-ekspression varierer mellem moderat og dårligt differentieret GC og at kun ringe differentierede tumorer foreliggende PHB overekspression sammenlignet med ikke-neoplastiske prøver. I vores stikprøve, blev nogle tumorer klassificeres i henhold til graden af ​​differentiering. observerede vi dog, at både dårligt og moderat differentierede tumorer præsenteres reduceret

PHB

udtryk sammenlignet med ikke-neoplastiske prøver, og at

PHB

mRNA-niveauer var lavere i de dårligt differentierede tumorer. Derfor, i vores prøver,

PHB

udtryk syntes at falde med tumor dedifferentiation. Yderligere undersøgelser er nødvendige for en bedre forståelse af PHB rolle i differentiering proces i normale og neoplastiske gastriske celler.

I denne undersøgelse har vi observeret, at 34,2% af tumorer fået kopier af

PHB

. Ændringer i kromosom 17 er blevet forbundet med tumorprogression og maligne potentiale i primær GC [38], [39]. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse at anvende en nøjagtig og robust teknik til at evaluere

PHB

kopiantal i GC-prøver. Vi observerede en sammenhæng mellem

PHB

kopi nummer og mRNA-niveauer, afslører en cis-dosis effekt af CNV på genekspressionsniveauer. Derfor er vores resultater tyder på, at CNV er et vigtigt element i kørsel nedstrøms

PHB

transskription i nogle gastriske tumorer. Denne genetiske mekanisme, primært observeret i slutningen debuterende GC, kan bidrage til

PHB

rolle som onkogen. Dette fund også fremhæve, at flere mekanismer kan føre til

PHB

deregulering i GC celler.

Stigningen i

PHB

kopi nummer var forbundet med sent debuterende GC. Klinisk-patologisk forskelle mellem tidlig debut og sent debuterende GC er blevet beskrevet [40], [41], [42], men lidt er kendt om de genetiske ændringer, der er forbundet med en alder af debut af GC [2]. Buffart et al. [43] tidligere vist, at unge og gamle patienter tilhører grupper med forskellige genomiske profiler. Forstærkningen af ​​

PHB

locus fremhæver heterogenitet GC.

Den vigtigste begrænsning af denne undersøgelse er dens relativt lille stikprøve. Derfor præsenteres nogle statistisk analyse reduceret magt til at detektere signifikante forskelle mellem grupperne sandsynligvis på grund af den store heterogenitet blandt prøver. Derfor kan falsk-negative resultater er forekommet. Yderligere evalueringer er stadig nødvendigt at vurdere den rolle,

PHB

i gastrisk carcinogenese og transkriptionel regulering.

Det kan konkluderes, både nedregulering og opregulering af

PHB

kan observeres i GC. Reduktionen af ​​

PHB

udtryk synes at være involveret i tumor dedifferentiation proces og cancer indvielse. T-allelen i

PHB

rs6917 polymorfi kan bidrage til den observerede reduktion i

PHB

mRNA-niveauer og derfor bidrage til GC risiko. Men

PHB

opregulering synes, at være reguleret af gen-kopi nummer. Differentiel udtryk for rs6917 polymorfi i gastrisk prøver blev rapporteret for første gang, og denne variation kan spille en rolle i reguleringen af ​​

PHB

udtryk.