PLoS ONE: Osteopontin-Enhanced Nedsat Metastase af kolorektal cancer Cells

Abstrakt

levermetastaser er en væsentlig årsag til dødelighed fra kolorektal cancer (CRC). Imidlertid mekanismer bag denne proces er stort set ukendte. Osteopontin (OPN) er en udskilles phosphoryleret glycoprotein, der er involveret i tumor migration og metastase. Rolle OPN i cancer er endnu uklart. I denne undersøgelse blev OPN mRNA undersøgt i væv fra CRC, tilstødende normale slimhinde og lever metastatiske læsioner under anvendelse af kvantitativ realtids-PCR-analyse. Proteinet ekspression af OPN og dets receptorer (integrin av og CD44 v6) blev detekteret ved anvendelse af en immunhistokemisk (

IHC

) metode. Rolle OPN i levermetastaser blev undersøgt i etablerede coloncancer Colo-205 og SW-480 cellelinjer transficeret med sense- eller antisense-OPN eukaryot ekspressionsplasmider ved flowcytometri og celleadhæsionsassay. Fluorescens omfordeling efter fotoblegning (FRAP) blev anvendt til at undersøge kampen funktionelle intercellulær kommunikation (GJIC) blandt OPN-transficerede celler. Det konstateredes, at OPN blev højt udtrykt i metastatiske leverlæsioner fra CRC sammenlignet med primær CRC væv og tilstødende normale slimhinde. Ekspressionen af ​​OPN-mRNA i tumorvæv var signifikant relateret til CRC stadier. OPN-ekspression blev også påvist i normale hepatocytter omgivende CRC metastatiske læsioner. To kendte receptorer af OPN, integrin av og CD44v6-proteiner, var stærkt udtrykt i hepatocytter fra normal lever. CRC celler med tvang OPN udtryk udstillet øget heterotypisk vedhæftning med endothelceller og svækket intercellulære kommunikation. OPN spiller en væsentlig rolle i CRC metastaser til leveren gennem interaktion med dets receptorer i hepatocytter, nedsat homotypisk vedhæftning og forbedret heterotypisk vedhæftning

Henvisning:. Huang J, Pan C, Hu H, Zheng S, Ding L ( 2012) Osteopontin-Enhanced Nedsat Metastase af kolorektal kræftceller. PLoS ONE 7 (10): e47901. doi: 10,1371 /journal.pone.0047901

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: Maj 11, 2012; Accepteret: September 18, 2012; Udgivet: 24 oktober, 2012 |

Copyright: © 2012 Huang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en Natural Science Foundation of China (81102012, https://www.nsfc.gov.cn/), Zhejiang Qianjiang talenter projekt (2011R10029, https://kjt.zj.gov.cn/), og Zhejiang medicin videnskabelig forskning finansiere projekter (2010ZB073; https://www.zjtcm.gov.cn/) til LD. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er fortsat den næststørste årsag til kræft dødsfald i USA [1]. Ca. 50% af CRC patienter har metastaser i leveren, men kun 10% -20% af disse patienter kan undergå kirurgisk resektion. Den 5-årige overlevelsesrate efter kirurgisk resektion af metastatisk tumor er kun 30% -40% [2], [3] .De molekylære mekanismer bag CRC metastaser er ikke helt forstået, men de seneste beviser tyder på, at osteopontin (OPN) spiller en rolle i regulering tyktarmskræft celle metastaser [4].

OPN er en phosphoglycoprotein som oprindeligt isoleret fra mineraliseret knogle matrix [5], også ofte udskilles af forskellige typer af kræftceller, essentielle for vækst og metastase af brystkræft [ ,,,0],6], prostata [7], [8], hepatisk [9], melanom [10], og andre tumorer [11]. OPN signaler via celleadhæsionsmolekyler, såsom integriner og CD44 [12], [13]. Gen-profilering undersøgelser har identificeret en sammenhæng mellem avancerede og metastatisk kolorektal tumorer og høj ekspression af OPN [14]. En større indflydelse OPN på metastatisk potentiale er gennem cellulær vedhæftning og migration på tværs ekstracellulær matrix proteins22. Imidlertid har de funktionelle roller og underliggende mekanismer i OPN i kolorektal metastaser ikke fastslået.

Her undersøgte vi rolle OPN i colon metastase til leveren og de mekanismer, hvormed OPN fremmer tyktarmskræft metastatisk aktivitet.

Materialer og metoder

patienter

Tumor prøver fra 44 tilfælde af CRC og 20 patienter med levermetastaser på det andet Tilknyttede Hospital i Zhejiang University blev opnået frisk fra kirurgiske resektioner med forudgående samtykke. Den mediane alder af patienterne var 57 år ved drift, der spænder fra 25 til 84. Patologiske karakteristika, herunder tumor placering, fase, og differentiering blev registreret. Denne undersøgelse har fået menneskelig forskningsetik godkendelse fra den etiske komité af Anden Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University.

Cell Kultur

To kolorektale adenocarcinom cellelinjer Colo-205 og SW480 celler blev opnået fra Cancer Institute of Zhejiang University og vedligeholdes i RMPI-1640 med 10% kalveserum ved 37 ° C med 5% CO

2.

kvantitativ real-time PCR

vævsprøver blev lynfrosset umiddelbart efter kirurgisk resektion. Den totale RNA blev isoleret under anvendelse af Trizol (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. RNA integritet blev undersøgt ved gelelektroforese med 1% formaldehyd gel. 2,0 pg totalt RNA blev omvendt transskriberet med SUPER SCRIPT II RTPCR (Invitrogen). Real-time PCR blev udført i et slutvolumen på 50 pi indeholdende 1 pi RT-transkript, 5 pM af hver primer, 0,5 enhed af AmpliTaq DNA-polymerase (Invitrogen). Som en indre positiv kontrol blev real-time PCR-analyse udført på GAPDH genet parallelt. Følgende primere blev anvendt: OPN fremadrettet primer 5′-CAA ATACCCAGATGCTGTGGC-3 ‘; OPN revers primer 5’-TCCTGGCTGTCCACATGGTC-3 ‘; GAPDH fremadrettet primer 5’-CTTAGCACCCCTCCCCAAG-3 ‘; GAPDH revers primer 5’- GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3 ‘. OPN TaqMan probe 5’-TGACCCTACTCAGAAGCAGAATCTCCTAGCC-3 ‘; GAPDH TaqMan probe 5’-CATGCCATCACTGCCACCCAGAAGA-3 ‘. PCR-amplifikationer blev udført i en 96-brønds reaktionsplade formatet og fluorescenssignaler blev påvist med et PE Applied Biosystems 7700 Sequence Detector (Perkin-Elmer). Fluorescenssignalerne blev oversat til C

T-værdier (mindst cyklus svarende til den cyklus telefonnummer, hvor en betydelig stigning i fluorescenssignalet først blev detekteret). Niveauet af mRNA-ekspression af OPN = OPN C

T-værdi /GAPDH C

T-værdi.

PCR-produkter blev elektroforesebehandlet på agarosegeler og farvet med ethidiumbromid og fotograferet. PCR-produkter af den forventede størrelse blev klonet ind i en pGEM-T-Easy vektor (Promega) og sekvenserne af de resulterende plasmider blev bekræftet.

antisense- og Sense-OPN eukaryote ekspressionssystemer Plasmider Salg

at obtainan anti-sense OPN ekspressionsplasmid, genereret vi et 201 bp cDNA-fragment (fra 210 til 368) ved anvendelse af PCR med OPN primere som nævnt ovenfor. cDNA-fragmentet blev derefter klonet ind i

EcoR

I-stedet af pcDNA 3.1 (+). Den modsatte retning af det klonede cDNA blev bekræftet ved DNA-sekventering (Vektoren betegnet OPN-antisense).

Den åbne læseramme (ORF) af OPN blev opnået ved RT-PCR. OPN primer F: 5’CCG ACC AAG GAA AAC TCA CT – 3 ‘, R: 5’CTC CTT TTA ATT GAC CTC AG – 3’. PCR-produkterne 974 bp blev klonet ind i en pGEM-T-Easy vektor og sekventeret på begge strenge under anvendelse af ABI PRISM ™ 377 DNA Sequencer (Perkin-Elmer). ORF’en af ​​OPN blev derefter klonet ind i en eukaryot ekspressionsvektor pcDNA 3.1 (+) til generering af pcDNA 3.1-OPN (ORF). (Vektoren betegnet OPN-sense).

Stabil Expression cellelinier

De plasmider af OPN-antisense, OPN-sense og pcDNA3.1 (+) blev linearlized med

Bgl ?

fordøjelse i 4 timer. DNA-transfektion blev udført under anvendelse af Superfect Transfection Reagent (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. Efter 48 timer blev transficerede celler udvælges med G418 i 3 dage. Udvalgte kloner blev samlet og udvidet. De etablerede cellelinjer blev bekræftet med RT-PCR og Western bolt-analyse.

In Situ

mRNA hybridisering (

ISH

)

specifikke prober komplementære til OPN mRNA blev udformet baseret på GenBank J04765 (human osteopontin mRNA, komplet cds). Disse oligonucleotid-sekvenser har 100% homologi med OPN-genet og minimal homologi med andre pattedyr-gensekvenser som søgte i GenBank ved eksplosionen. DIG RNA Label Kit (SP6 /T7) (Roche) blev anvendt til at generere både sense og antisense. Paraffinindlejrede væv blev snittet ved 4 μ m. Objektglassene blev afparaffiniseret og behandlet med 0,2% M. HCI i 20 min. Efter fordøjet med proteinase K blev objektglassene inkuberet med præ-hybridiseringsopløsning (indeholdende 500 ug /ml poly (A)) ved 42 ° C i 30 minutter i et fugtighedskammer. Opløsningen blev erstattet af hybridiseringsopløsning (indeholdende 0,3 ug /ml sense eller anti-sense RNA enkeltstrenget probe henholdsvis 50% formamid, 10% dextransulfat, og 2 x SSC) og hybridiseret ved 42 ° C natten over. Efter vasket med 2 x SSC og 1 x SSC i 15 minutter succession blev objektglassene blokeret med PBS indeholdende 5% bovint serumalbumin i 10 minutter, inkuberet med biotin-mærket muse-anti-digoxin-antistof i 30 minutter og derefter med alkalisk phosphoesterase -affinitin i 30 min. NBT-BCIP blev anvendt til at farve objektglassene i pH 10 substratbuffer. Efter dehydrering blev objektglassene monteret med vandig montering medier (Sigma).

Immunhistokemi Analyse

Rotte anti-humant osteopontin monoklonalt antistof (Chemicon, Billerica, MA) blev anvendt til

IHC

. Alle sektioner (5 um tykke) fra formalin-fikserede paraffin-embedded tissue blokke blev monteret på gelatineovertrukne objektglas. Kan forbedre antigeneksponering blev objektglassene behandlet med 1 × EDTA ved 98 ° C i 10 minutter for antigen hente. Objektglassene blev inkuberet med endogen peroxidase blokerende opløsning for at inhibere endogen peroxidase, derefter inkuberet med det primære antistof (enten anti-OPN-monoklonalt museantistof (Akm2A1; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ved en fortynding på 1:200, eller integrin av monoklonalt antistof (P2W7; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ved en fortynding på 1:200 eller CD44v6 monoklonalt antistof (MAB-0038; Maixin, Fujian, Kina) ved en fortynding på 1:100) ved stuetemperatur i 60 min. Efter skyllet med Tris-bufret saltvand blev objektglassene inkuberet i 15 minutter med biotin-konjugeret sekundært antistof, vaskes og inkuberes derefter med enzymkonjugat HRP (peberrodsperoxidase) -streptavidin. Frisk fremstillet DAB (Zymed, South San Francisco, CA) blev anvendt som substrat til påvisning HRP. Endelig blev slides kontrastfarvet med hæmatoxylin og monteret med vandig montering medier.

celleadhæsionsassayet

Monolagskulturer Colo-205 celler og SW-480 celler blev opretholdt i Ø 35 mm skåle og normal medium, indtil 70% -80% konfluens. Vedhæftede celler blev derefter overlejret på monolagcellerne, blandet godt og inkuberet i forskellige perioder.

Flydende celler blev opsamlet efter inkubation i 10 min, 20 min, 30 min og 40 min, og antallet blev talt anvendelse af et hæmocytometer. Celleadhæsion-forholdet blev derefter beregnet: friktion ratio = (sum af celler added- suspenderede celler) /sum af prøveceller. Homotypisk adhæsion assay blev udført med samme cellelinier, hver af dem mellem navlen fartøj endothelceller ECV 304 celler blev anvendt henholdsvis i heterotypisk adhæsion assay.

flowcytometrianalyse

1 × 10

6 /ml celleprøver blev suspenderet grundigt i PBS, blandet med 20 pi CD44-FITC-antistof, kontrolleret med 20 pi IgG1 /2a-antistof, celle inkuberet med Ab ved stuetemperatur i 20 min. Skyllet med PBS, blandet med 1% paraformal-dehyde, derefter opdaget med FAC Scan (BD selskab, Cell Quest TM Version 3.3 software).

Gap-fluorescens Omfordeling Efter Fotoblegning (Gap-FRAP) Metode

Celler af 80% sammenløb blev undersøgt for fluorescens omfordeling efter fotoblegning. Cellerne skyllet med Hanks (Ca

+, Mg2

2+), inkuberet 15 min med 10 pg /ml 5 (6) -carboxyfluorescein (CFDA) i 37 ° C, 5% CO

2 . Efter skylles af PBS, blev en celle ved siden af ​​andre celler udvalgt og dens fluorescens blev Lysblegede under LEICA TCS-SP laser co-fokus mikroskop (Argon ion laserstråle, 518 nM, Time /lampse program til fotoblegning og scanne, Fysiologi software til billedbehandling og data). Digitale billeder af fluorescensemissionen ophidset af svage laserimpulser blev registreret med regelmæssige intervaller i 12 minutter (scanning perioden 1 minut, før og efter fotoblegning) og opbevaret til efterfølgende analyse. I hvert forsøg blev en mærket, isoleret celle efterladt ubleget som reference for tab af fluorescens på grund af gentagen scanning og farvestof lækage, og en isoleret, bleget celle tjente som kontrol.

Statistisk analyse

data er udtrykt som middelværdi ± SEM. Forbundne-prøver

t

test, uafhængige-prøver

t

test og envejs ANOVA blev anvendt. Beregninger blev udført under anvendelse af SPSS 13.0 software.

P

værdier mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante.

Resultater

OPN Expression i Primary CRC, CRC metastaselæsioner i Lever, og normalt væv

Baseret på kvantitativ real-time PCR, C

T-værdier er omvendt proportional med den logaritmiske værdi af de oprindelige kopi antal målsekvens. Vi fandt, at OPN-mRNA blev udtrykt i 44 tilfælde af CRC væv, men på forskellige niveauer; den maksimale C

T-værdi var 1,47 og den mindste værdi var 0,85, ±

s

= 1,15 ± 0,14. Når parret med tilstødende normale prøver, den maksimale C

T-værdi var 1,75 og den mindste værdi var 0,94, ±

s

= 1,32 ± 0,18. (Parrede-prøver

t

test,

t

= 5,81,

P

= 0,000). Den OPN mRNA-ekspression blev øget betydeligt i primær CRC væv i forhold til de omkringliggende normale væv.

I

ISH

, den positive plet præsenterer blå-lilla under mikroskop. OPN mRNA, hvilket indikerer et positivt signal, blev fundet i cytoplasma af CRC-celler i de primære læsioner (× 400). b Pletten i tilstødende normale kolorektale væv var negativ (× 400). C blev OPN mRNA fundet i cytoplasmaet i CRC celler lever metastatisk væv. Tilstødende normale levervæv pletter negativ (× 100).

I 20 af undersøgte lever metastatisk væv fra CRC, den maksimale C

T-værdi var 1,30 og den mindste værdi var 0,92, ±

s

= 1,07 ± 0,10. I forhold til den primære kræft, den OPN mRNA-ekspression i leveren metastatisk væv var højere (uafhængige-prøver

t

test,

t

= 2,12,

P

= 0,038).

Baseret på Dukes scenen, syv af de samlede 44 CRC patienter på trin A og OPN mRNA betyder C

T-værdi var 1,49 ± 0,38, 1,21 ± 0,28 for fase B (17 patienter), 1,11 ± 0,29 for trin C (18 patienter), og 0,92 ± 0,32 for trin D (2 patienter). Udtrykket niveau af OPN mRNA i CRC væv ved tidlig fase var signifikant højere end som på fremskreden (envejs ANOVA,

P

= 0,031).

Vi brugte derefter

ISH

analyse for yderligere at vurdere OPN mRNA-ekspression og lokalisering. I denne analyse vises den positive blåviolet under mikroskopet. OPN-mRNA, som synes signal farvning, blev fundet i cytoplasmaet i CRC-celler i både de primære læsioner og lever metastatisk væv. Farvningen signal blev ikke påvist i tilstødende normal kolorektal og normale levervæv (

Fig. 1

).

Brug en immunhistokemisk metode, vi yderligere bekræftet, at OPN protein blev udtrykt i cytoplasmaet i CRC celler i både den primære læsion og metastatiske væv. De brune positive pletter blev også fundet i normale hepatocytter omkring metastatisk væv. Tilstødende normale colorektale væv udviste noget signal. Som kontrol OPN proteiner pletter i normale levervæv uden CRC metastaser

(

Fig. 2

)

.

I

IHC

, OPN proteiner (brun positiv farvning) blev lokaliseret i cytoplasmaet af CRC-celler i de primære læsioner (x200). b tilstødende normale kolorektale væv var negative (x200). c Positiv farvning blev fundet både i CRC-celler og tilstødende normale hepatocytter i leveren metastatiske væv (x100). d Som kontroller, OPN proteiner pletter i normale levervæv uden CRC metastaser var negativ (x100).

Angivelse af OPN receptorer-integrin av og CD44v6 farvning i Normal Hepatocytter

OPN har blevet vist at interagere med en række forskellige integriner via RGD-sekvensen, herunder avp3, αvβ1 og αvβ5. CD44v6 er en splejsningsvariant af CD44 (CD44v) også kunne binde til OPN og sandsynligvis fremmer kræftcelle adhærens til vaskulære endotel og basen membraner, derefter øger invasion og metastase af colon carcinomer. For at verificere disse receptorer i normal lever, vi analyseret for integrin αvβ1 og CD44v6 ved IHC. Vi fandt, at både integrin αvβ1 og CD44v6 blev farvet positivt i hepatocytter i normale levervæv

(

Fig. 3

).

I

IHC

, integrin av proteiner (brun positiv farvning) blev lokaliseret i cytoplasmaet af hepatocytter (× 400). b, blev CD44v6 proteiner (brun positive pletter) lokaliseret i cytoplasma af hepatocytter (× 400).

Angivelse af CD44 på cellemembranen ved flowcytometri

CD44 spiller en stor rolle i celle-celle-adhæsion, celle-substrat interaktion, lymfocytmålsøgning, og tumormetastase. Nylige undersøgelser har vist, at høj ekspression af CD44 i visse typer tumorer er forbundet med hematogenic spredning af cancerceller.

Vi har registreret CD44-ekspression i overførte cellelinjer under anvendelse af flowcytometri. Vi fandt, at efter nedregulering af OPN-ekspression, CD44-ekspression på Colo-205-OPN-antisense cellemembraner blev reduceret fra 54,28 ± 0,11 til 35,35 ± 0,24 i Colo-205,

P

0,01. I modsætning hertil blev værdien steget i SW-480- OPN-sense celler, hvor OPN udtryk opreguleret fra 2,65 ± 0,21 til 33,12 ± 0,15,

P

. 0,01

homotypisk og Heterotypisk Cell Adhesion

Cell vedhæftning er en vigtig faktor i kræft metastaser. Den detachement af kræftceller fra deres forældre tumorer er en indledende begivenhed i metastase og er relateret til homotypisk vedhæftning faldende. Når tumorceller undslippe fra den primære tumor, de interagerer med det forud eksisterende vært basalmembraner på et mangfoldigt stadier under den metastatiske kaskade. Heterotypisk vedhæftning hjælper kræftceller komplet hele denne proces.

Vi opdaget homotypiske og heterotypisk vedhæftning evne i Colo-205-OPN-antisense og SW-480-OPN-sense separat. Navle fartøj endothelceller ECV 304 blev anvendt som målceller i heterotypisk adhæsion. Homotypisk vedhæftning evne blev forbedret efter OPN-antisense transfektion i Colo-205, men blev svækket i SW-480-OPN-sense. I modsætning hertil blev heterotypisk vedhæftning evne svækket i Colo-205-OPN-antisense, men blev forbedret i SW-480-OPN-sense.

(data ikke vist)

.

Gap junktion intercellulær kommunikation (GJIC) med Gap-FRAP

GJIC består af intercellulære udveksling af molekyler med lav molekylvægt, og er den eneste organer til direkte kontakt mellem cytoplasmaer af tilstødende dyreceller. Forstyrrelser af GJIC er blevet forbundet med mange patologiske tilstande, såsom carcinogenese eller arvelig sygdom [15], kan også lette frigivelse af en potentielt neoplastisk celle fra styringen af ​​det omgivende væv, hvilket fører til tumorpromotion [16].

Vi anvendte gap-FRAP at måle GJIC i OPN transficerede celler (SW-480-pcDNA3.1 (+) – OPN) mens Colo-205 var semi-suspensionsceller, som ikke blev bevilget til denne metode. Cell signal udveksling blev svækket og GJIC funktion blev hæmmet. Sammenlignet med kontrol celler (vektor transficerede SW-480-OPN celler, SW-480-pcDNA3.1 (+)), fluorescens blev ikke omfordelt godt i SW-480-OPN-sense celler efter både 5 minutter og 10 minutter af fotoblegning. Efter 5 minutters fotoblegning, hvor stor en procentdel af fluorescens omfordeling efter fotoblegning (FRAP%) blev 24,65 ± 4,08% i SW-480-pcDNA3.1 (+) – OPN sammenlignet 44,74 ± 6,23% i SW-480-pcDNA3.1 (+ ) (

t

= 17,07,

P

0,001), og efter 10 minutter blev FRAP% stadig hæmmes ved 25,98 ± 4,48% i SW-480-pcDNA3.1 ( +) – OPN mens det blev omfordelt til 64,92% ± 5,39% i SW-480-pcDNA3.1 (+) celler (

t

= 35,16,

P

0,001) (

fig. 4

). Disse resultater indikerer, at OPN kan hæmme GJIC funktion og forringet signal udveksling mellem disse transficerede SW-480-celler.

ensartet fluorescensintensitet før fotoblegning i SW-480-pcDNA3.1 (+). a2, svækket fluorescensintensitet efter fotoblegning i SW-480-pcDNA3.1 (+). a3, fluorescens omfordeling efter 10 minutter i SW-480-pcDNA3.1 (+). b1, ensartet fluorescensintensitet før fotoblegning SW-480-pcDNA3.1 (+) OPN celler. b2, svækket fluorescensintensitet efter fotoblegning SW-480-pcDNA3.1 (+) OPN celler. b3, svag fluorescens omfordeling efter 10 minutter SW-480-pcDNA3.1 (+) OPN celler. c, Procentdelen af ​​fluorescens omfordeling efter fotoblegning (FRAP%) i SW-480-pcDNA3.1 (+) og SW-480-pcDNA3.1 (+) OPN celler. Efter 5 minutters fotoblegning, hvor stor en procentdel af fluorescens omfordeling efter fotoblegning (FRAP%) 24,65 ± 4,08% i SW-480-pcDNA3.1 (+) -OPN sammenlignet 44,74 ± 6,23% i SW-480-pcDNA3.1 (+) (

t

= 17,07,

P

0,001), og efter 10 minutter blev FRAP% stadig hæmmes ved 25,98 ± 4,48% i SW-480-pcDNA3.1 (+ ) -OPN mens det blev omfordelt til 64,92% ± 5,39% i SW-480-pcDNA3.1 (+) celler (

t

= 35,16,

P

. 0,001)

diskussion

Menneskelig tyktarmskræft berører næsten 150.000 patienter og 60.000 dødsfald i USA hvert år. Leveren er det primære ekstra colon site for CRC metastaser og repræsenterer den mest almindelige placering og klinisk præsentation for tilbagevendende sygdom hos patienter, der ikke locoregioal terapi [17]. Der er kun få tumormarkører, der har kliniske anvendelighed i forvaltningen af ​​CRC metastaser. Selv anvendelsen af ​​den mest udbredte markør, carcinoembryoni antigen (CEA), er for nylig blevet sat spørgsmålstegn [18]. OPN er en kandidat gen af ​​metastaser i CRC. Med anvendelsen af ​​genekspression profilering teknologi og samleprøve udtryk profilering [19], [20], er OPN blevet identificeret som den førende kandidat klinisk markør for CRC progression. Vi undersøgte derfor rolle OPN i reguleringen hepatisk slutorganet metastase.

Brug kvantitativ real-time, vi bekræftet, at OPN blev højt udtrykt i metastatiske leverlæsioner fra CRC sammenlignet med primær CRC væv og tilstødende normale slimhinde. Endvidere blev ekspressionen af ​​OPN-mRNA i tumorvæv signifikant relateret med CRC stadier. Disse resultater implicerer, at OPN er en potentiel markør for tumorinvasion og hepatisk metastase af CRC.

Især OPN-mRNA blev fundet i cytoplasmaet i CRC-celler ved

in situ

hybridisering, men ikke i deres tilstødende normale væv eller i de omkringliggende normale væv af lever. Immunhistokemisk analyse viste, at OPN proteinet eksisterer naturligvis også i cytoplasmaet af tilstødende normale hepatocytter omgivende CRC væv, og at ekspressionen af ​​OPN-protein i normalt levervæv er negativ. Men vi opdaget to receptorer af OPN, integrinαv og CD44v6, i normalt levervæv. Vi derfor hypotesen, at når CRC tumorceller afvige fra primære læsioner, portåren hvilket er en nødvendig circumfluence vene, tillader cancercellerne at passere gennem leveren. Tumorcellerne indeholdende OPN kunne ophobes i leveren gennem en interaktion mellem en ligand og en receptor.

Vi undersøgte to forskellige cellelinier til at undersøge den rolle, OPN i regulering metastase. Colo-205-cellelinien blev transficeret med en OPN-antisense eukaryot plasmid til at inhibere OPN proteinekspression i denne cellelinie. SW-480-celler blev transficeret med en OPN-sense eukaryot plasmid, således at OPN proteinet udtrykkes i denne cellelinje.

Efter celletransfektion, Colo-205-OPN-antisense-transficerede celler klynger (data ikke vist ), homotypisk adhæsion var forøget i disse celler sammenlignet med Colo-205-pcDNA3.1 (+). vedhæftningen evne blev imidlertid svækket i SW-480-OPN-sense-celler, og mobilitet var forøget i disse celler udtrykker OPN (data ikke vist). Samtidig undersøgte vi heterotypiske adhæsion med ECV304 som målceller, heterotypisk adhæsion evne blev svækket i Colo-205-OPN-antisense-celler og var forøget i SW480-OPN-sense-celler. Disse resultater antyder, at OPN nedsætter homotypiske adhæsion blandt CRC celler og øger heterotypisk adhæsion evne mellem CRC-celler og endothelceller.

Invasion og metastase er vigtige egenskaber ved maligne tumorer. Hele processen med metastase indbefatter angiogenese adhæsion, nedbrydning, bevægelse og refiksation [21]. Adhæsionsfaktorer væsentlige involveret i processen. OPN er formentlig en af ​​talrige prognostiske faktorer relateret metastase af CRC.

På grund af OPN, er homotypisk vedhæftning evne svækket i CRC celler og cellerne til at afvige fra primærtumor lettere, og indtast blodcirkulationen. Det første skridt i metastaser er debut. Imidlertid CRC celler er lettere at invadere ECM (den ekstracellulær matrix), når heterotypisk adhæsion forøges. Disse to trin er vigtige for metastase i malign cancer.

GJIC er blevet spekuleret at være en nødvendig, hvis ikke tilstrækkeligt, biologiske funktion af metazo celler i reguleringen af ​​vækstkontrol, differentiering og apoptose af normale progenitorceller [22 ]. Intercellulær kommunikation i mange organer opretholdes via intercellulære gap junction kanaler sammensat af connexiner, et stort protein familie med en række isoformer. Denne GJIC muliggør udbredelsen af ​​aktionspotentialer (for eksempel i hjernen, hjerte), og overførslen af ​​små molekyler, som kan regulere cellevækst, differentiering og funktion. Sidstnævnte har vist at være involveret i cancervækst: reduceret GJIC ofte er forbundet med forøget tumorvækst eller med fremgangsmåden ifølge de-differentiering. Fluorescens omfordeling efter fotoblegning (FRAP) blev vedtaget for at observere inddrivelse af fluorescens intensitet i de blegede celler og derfor at estimere intercellulære kommunikation ved gap junctions.

I vores undersøgelse fluorescens omfordeling efter fotoblegning blev svækket i SW-480 – OPN-sense-celler. GJIC funktion blev hæmmet og signal udveksling blev forringet, Så disse tumorceller lettere løsrevet fra primære læsioner at indlede det første trin i metastase Tilfældigvis.

Baseret på undersøgelser af korrelerede mekanismer mellem ekspressionen af ​​OPN og metastase i kombination med de relevante litteratur, konkluderede vi, at en potentiel mekanisme af OPN fremme CRC levermetastaser er som følger: CRC celler udtrykker OPN, homogeniteten adhærens evne reduceres, funktionen af ​​GJIC inhiberes, er evnen til invasion og bevægelse forøges, hvilket gør det nemt for CRC celler til at afvige fra den primære læsion, kommer i omløb og indlede proceduren for metastaser. Samtidig, på grund af OPN, ekspressionen af ​​CD44, en metastase-relateret faktor, øges også. Den heterotypisk adhæsion mellem CRC-celler, ECM og vaskulær endotelcelle forstærkes. I løbet af portalen vene refluence, OPN tillader kræftceller at invadere perifere kar, som bosætter sig ned og beplantning i leveren. Desuden blev receptorerne af OPN, CD44v6 og integrin av findes i lever. Samspillet mellem ligander og receptorer kunne forklare leveren-cling af CRC-celler.

Disse resultater antyder, at OPN er en af ​​de vigtige faktorer i tumor infiltration og metastase. Effekten på homotypisk og heterotypisk vedhæftning i CRC celler OPN er afgørende i processen med levermetastaser.

Tak

Vi er taknemmelige for Dr. Jiaping Peng og Dr. Xiaoming Fang for deres uvurderlige videnskabelig rådgivning i løbet af undersøgelsen.