PLoS ONE: Undersøgelse af en MMP-2 Activity-Dependent Opankring Probe for Nuclear Imaging of Cancer

Abstrakt

Formål

Siden matrixmetalloproteinase-2 (MMP-2) er en vigtig markør for tumor malignitet, udviklede vi en oprindelige stof designstrategi, MMP-2 aktivitet afhængig forankring sonder (MDAP), til brug i MMP-2 aktivitet imaging, og vurderet nytten af ​​denne sonde i

in vitro

og

in vivo

eksperimenter.

Metoder

Vi har designet og syntetiseret MDAP

1000, MDAP

3000, og MDAP

5000, som består af 4 uafhængige dele: RI enhed (

111In hydrofile chelat), MMP-2 substrat enhed ( kort peptid), forankring enhed (alkylkæde), og forankring hæmning enhed (polyethylenglycol (PEGn; hvor n repræsenterer den omtrentlige molekylvægt, n = 1000, 3000, og 5000). probespaltning blev bedømt ved kromatografi efter MMP-2 behandling . Cellulær optagelse af sonderne blev derefter målt. Radioaktivitet ophobning i tumorxenoplantater blev evalueret efter intravenøs injektion af sonderne, og sonde spaltning blev evalueret i tumor homogenater.

Resultater

MDAP

1000, MDAP

3000, og MDAP

5000 blev spaltet med MMP-2 i en koncentrationsafhængig måde. MDAP

3000 forbehandlet med MMP-2 udviste større akkumulation i tumorceller, og blev fuldstændig blokeret af yderligere behandling med en MMP-inhibitor. MDAP

3000 udstillet hurtig blod clearance og en høj tumor ophobning efter intravenøs injektion i en gnaver-model. Desuden farmakokinetisk analyse viste, at MDAP

3000 udviste et betydeligt langsom udvaskning sats fra tumorer til blod. En vis del af kløvet MDAP

3000 fandtes i tumorxenoplantater

in vivo

.

Konklusioner

Resultaterne indikerer den mulige nytte af vores MDAP strategi for tumor billeddannelse.

Henvisning: Temma T, Hanaoka H, ​​Yonezawa A, Kondo N, Sano K, Sakamoto T, et al. (2014) Undersøgelse af en MMP-2 Activity-Dependent forankring Probe for nuklear Imaging of Cancer. PLoS ONE 9 (7): e102180. doi: 10,1371 /journal.pone.0102180

Redaktør: Dominique Heymann, Faculté de médecine de Nantes, Frankrig

Modtaget: Februar 21, 2014 Accepteret: 16 Juni 2014; Udgivet: 10. juli 2014

Copyright: © 2014 Temma et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af JSP’er KAKENHI Grant Number 22791189. En del af denne undersøgelse blev støttet af den Nye Energi og Industrial Technology Development Organization (NEDO), Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

tumormetastase opstår, når en delmængde af tumorceller erhverver evnen til at bryde gennem basalmembranen og invadere gennem tætte net af interstitielle ekstracellulære matrix (ECM) proteiner [1]. Matrixmetalloproteinaser (MMP’er) udgør den største familie af enzymer, der er ansvarlige for at nedbryde disse forskellige ECM komponenter. Eftersom MMP-2 er i øjeblikket anerkendt som subtype der har den bedste etablerede association med tumor malignitet [2],

in vivo

billeddannelse af dets aktivitet bør være nyttige til tumordiagnose. Således har vi til formål at udvikle en ny nuklear billeddannelse sonde i stand til at estimere

in vivo

MMP-2-aktivitet med Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT).

Vi oprindeligt udviklet en ny sonde designstrategi der bruger en MMP-2-aktivitet afhængig forankring probe (MDAP) (fig. 1) for at detektere MMP-2-aktivitet effektivt. Efter denne MDAP strategi, blev proben forventes at blive spaltet af MMP-2 enzymatisk aktivitet i nærheden af ​​tumoren, og effektivt fanget i proksimale tumorceller. Således kunne radioaktiviteten niveau detekteres af SPECT korreleres med MMP-2-aktivitet i tumorer. I denne undersøgelse har vi specielt designet og syntetiseret MDAP

1000, MDAP

3000, og MDAP

5000, der består af en RI enhed (

111In DTPA), en MMP-2 substrat enhed (kort peptid ) [3], en forankrende enhed (alkylkæder) [4], og en forankring hæmning enhed (polyethylenglycol (PEGn; hvor n angiver det omtrentlige molekylvægt, n = 1000, 3000, og 5000). (tabel 1) MDAP

CV, som mangler PEG-delen, tjente som kontrol. Vi vurderede mulighederne for dette stof designstrategi og nytten af ​​sonderne

in vitro

in vivo

.

Materialer og metoder

Etik erklæring

blev udført de dyreforsøg i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer og godkendt af Kyoto University Animal Care udvalg (Permit Number :. 2012-49, 2013-33) alle operation blev udført under isofluran anæstesi, og blev gjort alt for at minimere lidelse

Generelt

aminosyrederivater blev købt fra Watanabe Chemical Industries (. Hiroshima, Japan) og Iris Biotech GmbH (Marktredwitz, Tyskland). Matrix Assisted Laser Desorption /Ionisering-massespektrometri (MALDI-MS) blev udført med en AXIMA-CFR Plus apparat (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan). Omvendt fase højtryksvæskekromatografi (RP-HPLC) blev udført under anvendelse af et Shimadzu-HPLC-gradientsystem (LC-20AD, Shimadzu Corporation) udstyret med en Cosmosil 5C18-AR-II-søjle (10 x 250 mm, Nacalai Tesque, Inc. , Kyoto, Japan). Produkter blev elueret med en lineær gradient, der starter ved 50% opløsningsmiddel B, som steg til 80% i løbet af 15 min (Opløsningsmiddel A: 0,1% trifluoreddikesyre i vand [v /v]; opløsningsmiddel B: 0,1% trifluoreddikesyre i acetonitril [v /v ]) ved en strømningshastighed på 4,0 ml /min. For tumor metabolit analyse blev produkter elueret med en lineær gradient, der starter ved 50% opløsningsmiddel B, som steg til 80% i løbet af 30 minutter ved en strømningshastighed på 2,0 ml /min.

Fremstilling af prober (tabel 1)

Fmoc-Dap (Boc) -10-Adc-Gly-Pro-Leu-Gly-Wang-harpiks (Dap: 2,3-diamino propionsyre, 10 ADC: 10-amino-decansyre) blev syntetiseret ved en Fmoc-fastfase-peptidsyntese under anvendelse af en peptidsynthesizer (PSSM-8; Shimadzu Corporation) med

N

,

N ‘

-diisopropylcarbodiimide (1,2 ækv),

N

,

N

diisopropylethylamin (1,0 ækv), og 1-hydroxylbenzotriazole (1,0 ækv) som reagenser [5]. Efter Fmoc-gruppe fjernet med 20% piperidin i

N

,

N

dimethylformamid, palmitinsyre blev omsat på lignende måde ovenfor til opnåelse palmitoyl-Dap (Boc) -10-Adc-Gly -Pro-Leu-Gly-Wang-harpiks. Palmitoyl-Dap (Boc) -10-Adc-Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg (PBF) -Gly-Lys (ivDde) ​​-PEG

n-amid harpiks (n = 1000, 3000, eller 5000 ) blev leveret af Scrum Inc. (Tokyo, Japan). Peptid afbeskyttelse og spaltning fra harpiksen blev samtidigt udført ved anvendelse af trifluoreddikesyre /ethandithiol /vand /triisopropylsilan (95 /2,5 /2,5 /1, vol /vol). De rå peptider blev oprenset ved RP-HPLC, efterfulgt af lyofilisering. Den rensede forbindelse blev reageret med

s

-SCN-Bn-DTPA (2 ækvivalenter) i

N

,

N

dimethylformamid (1 ml) og

N

,

N

diisopropylethylamin (20-100 pi) for at indstille pH af en opløsning (pH 6), og inkuberet ved stuetemperatur natten over. Radiomærkningen forstadier blev oprenset ved RP-HPLC og karakteriseret ved massespektrometri. [

111In] Incl

3 (5,55 MBq i 100 pi HCI-opløsning, Nihon Medi-Physics Co., Ltd., Japan) blev tilsat til hvert oprenset precursor (2 nmol) i 0,1 M acetatpuffer (pH 6,0, 50 pi), og blandingen blev inkuberet ved stuetemperatur i 30 min. Radiokemiske renhed blev bedømt ved RP-HPLC udstyret med en radioaktivitet-detektor.

Måling af fordelingskoefficienter

eksperimentel bestemmelse af probe fordelingskoefficienter (log P-værdier) blev udført i 1-octanol og 0,02 M phosphatpuffer pH 7,4, hvor de to faser blev præ-mættet med hinanden. 1-Octanol (200 pi) og phosphatpuffer (200 pi) blev pipetteret ind i LoBind Eppendorf-rør indeholdende 0,37 MBq prober. Røret blev hvirvelbehandlet i 10 sekunder og centrifugeret (5 min, 4000 x

g

). Prøver (50 pi) fra 1-octanol og puffersystemer faser blev overført til to reagensglas til radioaktivitetstælling med en NaI well-typen scintillationstæller (1470 WIZARD, Perkin Elmer, Kanagawa, Japan). Fordelingskoefficienten blev beregnet under anvendelse af ligningen P = (tællinger /pl i 1-octanol) /(tællinger /pl i buffer).

spaltningsbestemmelse

Menneske-rekombinant MMP-2 protein ( 902-MP-010, R 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Udarbejdelse af sonder

MDAP

1000, MDAP

3000, MDAP

5000 og MDAP

CV blev opnået med mere end 95%, 97%, 95% og 98% radiokemisk renhed, (fig. 2). Den specifikke radioaktivitet af proberne blev anslået til 2,8 MBq /nmol, som var afhængig af radioaktiviteten af ​​[

111In] Incl

3 anvendes til radioaktiv mærkning procedure. Log P-værdier for MDAP

1000, MDAP

3000, MDAP

5000 og MDAP

CV var -0,56 ± 0,13, -0,95 ± 0,12, -1,04 ± 0,16 og 0,29 ± 0,07 hhv.

RI diagrammer af (a) MDAP

1000, (b) MDAP

3000, (c) MDAP

5000, og (d) MDAP

cv vises med UV diagrammer af tilsvarende radioaktive stoffer.

In vitro-undersøgelse

Som vist i fig. 3a, MDAP viste

1000 høj radioaktivitet ophobning i tumorceller og niveauer, der var magen til MDAP

CV, mens MDAP

3000 og MDAP

5000 viste signifikant lavere radioaktivitet. MMP-2 spaltes MDAP

1000, MDAP

3000 og MDAP

5000 i en koncentrationsafhængig måde (fig. 3b). MDAP

3000 forbehandlet med MMP-2 akkumuleret i celler til højere niveauer, mens yderligere behandling med en MMP inhibitor fuldstændig blokeret denne øgede optagelse (fig. 3c).

(a) Cellular ophobning af MDAP

1000, MDAP

3000, MDAP

5000 og MDAP

CV anslået af radioaktivitet tælling. (B) spaltning (%) af MDAP

1000, MDAP

3000, og MDAP

5000 som følge af MMP-2 behandling. Værdier blev anslået ved omvendt fase HPLC. (C) Cellulær ophobning af MDAP

3000 med eller uden MMP-2-protein og MMP-inhibitor (GM6001).

In vivo studie

Radioaktivitet fordeling profiler efter intravenøs administration af MDAP

1000, MDAP

3000 og MDAP

CV er vist i tabel 2, 3 og 4, hhv. At sammenligne probe farmakokinetik, er ændringer i radioaktivitet i blodet og tumor afbildet som en funktion af tiden efter administration (fig. 4a, b), og som tumor til blod-forhold (fig. 4C). MDAP

3000 udviste hurtig blodclearance (fig. 4a) og høj tumorakkumulering (fig. 4b). Således blandt proberne MDAP

3000 opnåede signifikant højere tumor til blod-forhold (2,74 ± 0,89 ved 24 timer, tabel 3 og fig. 4c). MDAP

1000 udviste også hurtig blodclearance (fig. 4a), men udviste lav tumorakkumulering (fig. 4b). I mellemtiden, MDAP

CV viste en langsom blod clearance (fig. 4a) og laveste tumor blod-forhold over forsøgsperioden (0,30 ± 0,02 ved 24 timer, tabel 4 og fig. 4c). Farmakokinetiske analyser på hele kroppen (tabel 5) og tumorer (tabel 6) viste ovennævnte punkter mere klart angivet af biodistribution data. Som vist i tabel 5, MDAP

3000 og MDAP

CV viste lignende fordeling mængder mens MDAP

CV viste langsommere total clearance samt længere halveringstid og betyde opholdstid end MDAP

3000. Tabel 6 viser en ca. syv gange langsommere udvaskning på MDAP

3000 fra tumoren (k2 = 1,2 × 10

-3 min

-1) sammenlignet med MDAP

CV (k2 = 8,6 × 10

-3 min

-1). Desuden HPLC-analyse af tumorer udskåret 3, 6 og 24 timer efter intravenøs injektion af MDAP viste

3000 en vis brøkdel af MDAP

CV fandtes i tumoren (fig. 5, hvid pil). Det intakte form af MDAP

3000 angivet ved den sorte pil forsvandt med tiden som vist på HPLC diagrammet. En vis del af MDAP

CV var også til stede inde i tumoren efter intratumoral injektion af MDAP

3000, der kunne blokeres af inhibitor behandling (fig. 6). Andre toppe observeret omkring 5-10 min kunne repræsentere yderligere metabolitter, der produceres inde i cellerne. MMP-2 enzymatiske aktivitet af tumor homogenatet blev bekræftet ved zymografi (fig. 7). Den effektive dosis af MDAP

3000 estimeret fra biodistribution data var 5,08 x 10

-2 mSv /MBq.

(a) Time radioaktivitet kurver i blodet. (B) Tid radioaktivitet kurver i tumorer. (C) Tumor til blod radioaktivitet nøgletal.

Sorte og hvide pile angiver de intakte og spaltede spidser, hhv.

Vejviser

diskussion

i denne undersøgelse testede vi gennemførligheden og nytten af ​​vores nye lægemiddelkandidat designstrategi hvor MMP-2-aktivitet-afhængige forankring sonde MDAP bruges til MMP-2 aktivitet billeddannelse i kræft. Begge

in vitro

og

in vivo

forsøg viste, at MDAP

3000 viste cellemembranen forankring egenskaber efter substrat spaltning af MMP-2 i tumorer, hvilket førte til en noget langsommere udvaskning af radioaktivitet fra tumorer. Som sådan, vi med succes demonstreret en eventuel anvendelse af vores MDAP strategi for tumor billeddannelse.

I de indledende faser af sonde design, valgte vi en dobbelt alkylkæde som forankring enhed baseret på en tidligere rapport indikerer, at dobbelt alkyl kæder var overlegen i forhold til enkelt-alkylkæder til cellemembranen forankring. Længden af ​​den dobbelte alkylkæden (palmitoylgruppe og 10-amino-decansyre i sonden strukturer) blev udvalgt baseret på resultater fra en foreløbig celle bindingsforsøg. Vi derefter kombineret andre dele til at opfylde kravene til MDAP. Specifikt

111In blev udvalgt til radioaktiv mærkning på grund af sin enkle og hurtige radiosynthesis med en hydrofil chelateringsmiddel (DTPA) -konjugeret precursor under milde betingelser [9]. Blandt tidligere rapporterede MMP-2 substratpeptider, Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly blev valgt således, at den aminoterminale ende rester (Pro-Leu-Gly) bevarer deres radioaktivitet efter spaltning og ikke inhiberer forankring egenskab af dobbelt alkylkæde [10]. PEG blev valgt på grund af hydrofili og steriske hindring, der ville gøre det muligt at fungere som en inhibitor af MDAP prober og tre PEG-molekyle typer (MW: 1000, 3000, og 5000) blev testet for at bestemme den optimale molekylvægt både med hensyn til inhiberende kapacitet på forankring og modstandsdygtighed over for MMP-2-spaltning. Som et resultat, vi med succes opnået radiomærkede MDAP sonder med et højt radiokemisk udbytte og renhed, der tillod deres anvendelse i

in vitro

in vivo

eksperimenter uden yderligere rensning.

PEG er ofte anvendt til at modificere molekylære prober til at ændre deres hydrofilicitet og farmakokinetik [11], [12]. Derfor forventede vi både hydrofilicitet og steriske hindring af PEG til at ændre egenskaberne af MDAP. Cellular ophobning resultater klart opdelt sonderne i en høj akkumulation gruppe (MDAP

1000 og MDAP

CV) og lav ophobning gruppe (MDAP

3000 og MDAP

5000), hvor sonden hydrofilicitet gradvist steget med molekylvægt af PEG, som vist i de opnåede log P-værdierne. Som sådan er den steriske hindring snarere end hydrofiliciteten bibringes af PEG fungerede som en inhibitor af forankringen probe del. Mens MDAP

1000, MDAP

3000, og MDAP

5000 blev spaltet med MMP-2 som forventet, evnen til spaltning af MDAP var

5000 ret lav, hvilket indikerede, at PEG placeret omkring sonden hæmmede dens interaktioner med andre molekyler, herunder MMP-2 protein. Således viste

in vitro

eksperimenter, at MDAP

3000 blev anerkendt som en mulig egnet sonde til videre

in vivo

evaluering.

in vivo

biodistribution undersøgelse afslørede en hurtig blod clearance og høj tumor optagelse af MDAP

3000 efter intravenøs injektion, mens MDAP

CV viste høj radioaktivitet i både blod og tumorer. Således er en signifikant højere tumor til blod radioaktivitet ratio (T /B-forhold), et billeddannende indeks [9] blev opnået for MDAP

3000 gruppe, hvilket viser de overlegne egenskaber ved MDAP som et billeddannende middel

3000

in vivo

. Den effektive dosis af MDAP

3000 anslået fra biofordelingen data var acceptabel for brugen af ​​MDAP

3000 som et billeddannende middel [13]. På den anden side, MDAP

CV viste forblev i blodet høj radioaktivitet, der indebar ikke-specifik binding med serumproteiner og /eller blodceller. Dette resultat antydede, at intravenøst ​​indgivet MDAP

CV kan binde med serumproteiner og eksistere inden det interstitielle rum af tumorer som den komplekse formular. Denne mulighed blev også indikeret ved MDAP

CV har de laveste T /B-forhold (mindre end 0,3) over forsøgsperioden. De MDAP

CV biofordeling resultater viste, at MDAP

cv genereret i andre væv efter systemisk MDAP administration ville være mindre hyppigt omfordeles til tumorer. Således tumor ophobning af MDAP

3000 blev ikke stammer fra omfordeling af kløvet MDAP

CV siden MDAP viste

3000 hurtig blod clearance og forøgelse af T /B-forholdet med tiden efter intravenøs administration. Alligevel var der en målelig procentdel af MDAP

CV eksisterende i tumorer efter intravenøs og intratumorale injektioner af MDAP

3000, og MDAP

CV følge af intratumoral injektion af MDAP

3000 var noget nedsat med MMP inhibitor. MDAP

CV kan genereres i tumoren som følge af MDAP

3000 spaltning med MMP-2. HPLC analyser på udskårne tumorer viser også ophobning og fastholdelse af MDAP

3000 efterfulgt af en gradvis nedbrydning til hydrofile metabolitter i tumorer. Det er ganske rimeligt fra MDAP strategi, farmakokinetisk forudsat en betydeligt langsommere udvaskning sats (k2 værdi) for MDAP fordi den langsommere udvaskning sats for MDAP angiver

3000 i forhold til MDAP

CV,

3000 MDAP

3000 radioaktivitet indfangning i tumorer. Hvad angår begrænsningerne ved denne undersøgelse blev direkte bevis for, at MDAP

3000 var forankret i cellemembranen efter MMP-2-aktivering i tumorvæv ikke opnået. At vurdere, om MDAP proben er forankret i cellemembranen efter MMP-2-aktivering mere præcist, yderligere undersøgelser såsom HPLC-analyse af membranfraktioner fra tumorcellerne alene eller konfokal mikroskopi nærmer anvendelse af en passende fluorophor indført i MDAP

3000 er havde brug for. Men den

in vitro

in vivo

undersøgelser viste, MMP-2 afhængig probespaltning, fastholdelse af radioaktivitet i tumorvæv og langsom udvaskning fra tumorvæv, hvilket indikerer en eventuel anvendelse af MDAP . strategi

Selvom fluorescens aktiverbare sonder er blevet rapporteret for MMP imaging [14] – [17], nuklear medicinsk billedbehandling har et stort potentiale for

in vivo

applikationer, fordi det kvantitativt kan opfange signaler fra væv dybt i kroppen, men også kan anvendes til anvendelse i cancer-terapier, der involverer a, p eller snegl elektronemittere [18], [19]. Da MDAP

3000 kan tillade selektiv udlæsning af det aktiverede MMP-2 subpopulation grund signalforstærkning sammenlignet med MMP-bindende prober, MDAP

3000 kunne være en potentiel lead forbindelse til anvendelse i fremtidige ansøgninger. Yderligere undersøgelser for at sammenligne MDAP

3000 med andre radioaktivt mærkede MMP billeddiagnostiske sonder er således berettiget [20], [21].