PLoS ONE: The role of Nuclear β-Catenin Ophobning i Twist2-induceret kræft i æggestokkene EMT

Abstrakt

Baggrund

Twist2 har vist sig at fremme menneskelig tumor invasion som i brystkræft og livmoderhalskræft. Men hvorvidt Twist2 fremmer menneskelig ovariecancer progression stadig, at blive belyst. Her undersøger vi rolle Twist2 i ovariecancer invasion og metastase samt de underliggende molekylære mekanismer.

Metoder Salg

Twist2 ekspression blev detekteret ved immunohistokemi (IHC) på væv microarray af human ovarie kræft med scoring procedure i henhold til farvning intensitet og mønster. Twist2 genet blev stabilt indført i Skov-3 ovariecancerceller at undersøge ændringer i cellulær morfologi, bevægelighed invasiv, og EMT molekylære markører.

Resultater

Twist2 udtryk er steget betydeligt i æggestokkene sammen med FIGO sygdom fase, hvilket indikerer, at Twist2 kan være forbundet med ovariecancer metastase. Overekspression af Twist2 inducerede EMT fænotype herunder nedregulering af E-cadherin, og opregulering af N-cadherin og β-catenin i humane ovariecancerceller, hvilket antyder, at Twist2 kunne fremme β-catenin frigivelse fra E-cadherin /β-catenin-komplekset gennem inhibering af E-cadherin. Således blev β-catenin-nedbrydning inhiberes grund af hæmning af APC, og den Wnt /β-catenin pathway blev derefter aktiveret ved nuklear β-catenin ophobning, som kan aktivere transkription af nedstrøms målgener at fremme tumorinvasion og metastase. Kollektivt, disse data viste, at β-catenin er involveret i Twist2-induceret EMT i ovariecancer.

Konklusion

Vores data indikerer, at opregulering af Twist2 er korreleret med FIGO stadium i humane ovariecancere . I denne rapport, vi viste, at nukleare β-catenin akkumuleres i Twist2-induceret EMT celler til letter kræft i æggestokkene invasion og metastase

Henvisning:. Mao Y, Xu J, Li Z, Zhang N, Yin H, Liu Z (2013) The role of Nuclear β-Catenin Ophobning i Twist2-induceret kræft i æggestokkene EMT. PLoS ONE 8 (11): e78200. doi: 10,1371 /journal.pone.0078200

Redaktør: Mechthild Hatzfeld, Martin-Luther-Universitetet Halle, Tyskland

Modtaget: Januar 15, 2013; Accepteret: 10. september 2013; Udgivet: 11. november 2013 |

Copyright: © 2013 Mao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn, nr 30.872.515, YB Mao) og grundforskning Midler til de centrale universiteterne i Kina (nr 2011121062, YB Mao), og Natural Science Foundation i Fujian-provinsen i Kina (nr 2012J01417, YB Mao). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på trods af nylige fremskridt i forståelsen af ​​æggestokkene udvikling kræft og progression, kræft i æggestokkene er stadig har den højeste tilhørende dødelighed af gynækologisk malignitet i det meste vestlige lande på grund af den avancerede stadium af sygdommen på diagnosetidspunktet (trin III-IV) . Langt størstedelen af ​​kvinder er diagnosticeret med dissemineret intraperitoneal carcinomatose [1], [2]. Nyere litteratur foreslår, at epitelial til mesenkymale overgang (EMT) spiller en kritisk rolle i progressionen af ​​ovariecarcinomer [3], [4]. EMT er defineret ved en kompleks molekylær og cellulær program, som epitelceller mister deres differentierede egenskaber såsom celle-celle-adhæsion, apikale-basal polaritet, manglende cellemotilitet og forstærkning af mesenchymal funktioner, herunder motilitet, invasionsevne og forøget resistens over for apoptose [5 ]. De tilsvarende cellulære remodeling og signalering netværk synes at være aktive under cancer metastaser [6], [7]. Det er blevet foreslået, at primær EOC kan undergå en EMT proces under lokal invasion i bughinden og fastholde mesenchymale funktioner i fremskredne tumorer.

Transskription faktorer i Twist familie (Twist1, Twist2), snegl familie (SNAI1 /snegl , SNAI2 /slug), samt ZEB familie (ZEB1, ZEB2), styrer EMT-processen i kræft [5], [8], [9]. Twist2 har vist sig at fremme tumorudvikling gennem EMT i brystcancer [10]. Twist2 er en potentiel prognostisk markør for livmoderhalskræft [11], adenoid cystisk carcinom [12], og tungen pladecellecarcinom [13]. Twist2 er også korreleret med dårlig differentiering kvalitet og korte overlevelse i hoved og hals planocellulært karcinom [14]. Men hvorvidt Twist2 fremmer menneskelig ovariecancer progression forbliver dårligt forstået. Her undersøger vi betydningen af ​​Twist2 i ovariecancer progression og de potentielle molekylære mekanismer bag den Twist2-induceret kræft invasion og metastase. Vi viste Twist2 er stærkt udtrykt i kræft i æggestokkene væv. Ektopisk udtryk for Twist2 i æggestokkene cancerceller giver en EMT fænotype. Endvidere kan β-catenin aktivering deltager i disse Twist2 inducerede EMT egenskaber.

Resultater

1. Forøget Twist2 udtryk var korreleret med FIGO stadie i primær ovariecancer

IHC analyser indikerede tilstedeværelsen af ​​høje niveauer af Twist2 i cancerceller af primære tumorer i æggestokkene på væv array (figur 1). Twist2 udtryk blev øget betydeligt i ovariecancer (70,24%, 59 i 84 tilfælde) i forhold til normalt ovarievæv (P 0,05, figur 1, tabel 1). Den positive farvning af Twist2 blev påvist både i kernen og cytoplasmaet.

Vævssnit af ovariecarcinomer og normale ovarier blev analyseret ved IHC-farvning med et specifikt monoklonalt antistof mod humant Twist2. Den positive farvning af Twist2 blev vist i brun farve. Snittene blev modfarvet med hemotoxylin at vise kerner. Repræsentative billeder af Twist2 farvning i parrede normale ovarie og epitelial ovariecarcinomer vises. Ingen udtryk for Twist2 kunne blevet set i normale voksne ovarie væv, mens positive udtryk for Twist2 hovedsageligt blev lokaliseret i cytoplasma eller kerne af serøs adenokarcinom og mucinøs adenocarcinom æggestokkene tumorceller. Magnitude × 200, × 400.

Ifølge klassificering histologisk type, blev stærkt udtryk for Twist2 fundet i 19 ud af 69 serøse carcinomer (27,54%), 1 af 8 mucinøse karcinomer (12,5% ), ingen af ​​4 endometriod carcinomer (0%), og 2 af 5 clear cell carcinomer (40%). Ingen signifikant forskel kunne påvises i forskellige tumor histologisk type (P 0,05). Udtrykket af Twist2 blev øget sammen med FIGO stadie (P 0,05), eksemplificeret som følger: 22,73% på trin I (10 i 44 tilfælde), mens 53,85% ved stadie IV (7 i 13 tilfælde). Samlet set i fase I, 31,82% (14/44) tilfælde viste Twist2 negative udtryk, 45,45% (20/44) tilfælde viste svag udtryk, og 22,73% (10/44) tilfælde viste stærkt udtryk; i den fase II, Twist2 negativ 7,69% (1/13); svag udtryk: 61,54% (8/13), og stærkt positivt: 30,77% (4/13); i den fase III, Twist2 negative udtryk: 57,14% (8/14), svag udtryk: 35,71% (5/14), og stærke udtryk: 7,14% (1/14); i den fase IV, negative udtryk: 15,38% (2/13), svag udtryk: 30,77% (4/13), stærkt udtryk:. 53,85% (7/13)

Disse data viste, at Twist2 protein forøges betydeligt i ovariecancer væv og det høje niveau af Twist2 var korreleret med FIGO sygdomsstadie, hvilket antyder, at Twist2 kan anvendes som en indikator for høj grad af malignitet og dårlig prognose i humane ovariecancer. Men der er ingen sammenhæng mellem Twist2 udtryk og tumoren histologiske type.

2. Twist2 udtryk påvirket cellemorfologi men ikke cellen spredning af SKOV-3 celler

in vitro

For at kontrollere, om Twist2 er en afgørende mediator af ovariecancer, progression, vi etablerede cellelinjer stabilt overekspression Twist2 (fig. 2A). Vi analyserede derefter Twist2 /SKOV-3 celler og deres forældre celler gennem celle morfologisk observation, flowcytometri (FCM), og MTT-analysen.

A. Ektopisk udtryk for Flag-taggedTwist2 i SKOV-3 (Twist2 /SKOV-3) æggestokkene cancerceller blev verificeret ved Western blot. Twist2 /SKOV-3 celler udtrykte både Twist2 og flag-tag sammenlignet med vektor kontrol celler. B. Twist2 farvning blev observeret ved anvendelse af laserscanning konfokal mikroskopi (Olympus) i SKOV-3-celler. Kerner blev modfarvet med DAPI (blå). Immunfluorescensfarvning af Twist2 i Twist2 /SKOV-3-celler viser celler med Twist2 (med grønt) i cellekerner sammenlignet med vektoren kontrol SKOV-3-celler. Cellerne var fra de stabilt transficerede prøver. C. Cell morfologiske former blev observeret ved anvendelse af fase mikroskopi (Olympus). Twist2 /SKOV-3-celler overtog fibroblastlignende morfologisk form, mens vektoren /SKOV-3 kontrolceller optrådte epitelcelle form.

I den indledende karakterisering af disse celler, observerede vi en distinkt morfologisk ændring i de celler, der overudtrykker Twist2 (fig. 2B). De SKOV-3 celler, der udtrykker Twist2 undergik en fænotypisk ændring og synes fibroblastlignende mesenchymale morfologisk form, mens kontrol SKOV-3-celler (Vector /SKOV-3) fremgår plane epitelcelle morfologiske form (fig. 2B). Immuno-fluorescerende farvning viste, at Twist2 er lokaliseret i kerner, hvilket var konsistent med det faktum, at Twist2 er en transkriptionsfaktor (fig. 2C).

Vi vurderede dernæst spredningen af ​​SKOV-3-celler, der udtrykker Twist2through analyser af cellecyklusfordeling og cellevæksthastigheden. Resultaterne viste ingen åbenbar virkning af Twist2 ekspression på celleproliferation (Fig. 3A, 3B). Som Akt og ERK1 /2-vigtige indikatorer involveret i celleproliferation, blev udtrykkene for disse proteiner og deres phosphorylering undersøgt ved Western blot-analyse. Konsekvent, vi ikke påvise ændringer i Akt, Erk1 /2, og deres phosphoryleringsbegivenheder former i Twist2 /SKOV-3 celler realtive til Vector /SKOV-3 kontrol celler (Fig. 3C).

A. Flowcytometri-analyse viste ingen forskel i cellecyklusfordeling mellem SKOV-3 cancerceller med eller uden Twist2 ektopisk ekspression. B. proliferationshastighed af de transficerede celler blev påvist og sammenlignet med den for vektoren kontrol gennem levedygtige celletællinger ved hjælp trypan-blå-farvning. Tredobbelte analyser blev udført i hver gruppe af celler. Data blev udtrykt som gennemsnit ± SD. Ingen indlysende indflydelse af Twist2 blev observeret på cellevækst sats. C. Expressions af Akt, Erk1 /2, og deres phosphoryleringstilstand former angivet Twist2 havde ingen virkning på spredning af Western blot. Sammenlignet med Vector /SKOV-3 celler, fandtes ingen tydelige ændringer i Akt, Erk1 /2, og deres fosforylering formularer i Twist2 /SKOV-3 celler.

3. Twist2 Expression Forbedret Migration og Invasion af SKOV-3 Kræft i æggestokkene Cells

Twist2 har vist sig at være en vigtig inducer af EMT i bryst- og livmoderhalskræft. EMT proces fremmer epitelceller vises fibroblast form, kendetegnet ved øget motilitet og invasionsevne [15]. For at bestemme om Twist2 /SKOV-3-celler har erhvervet den øgede evne til at migrere, udførte vi en sårhelende assay, hvor motilitet celler placeret på kanten af ​​såret blev evalueret på grundlag af deres evne til at kolonisere den sårede område. I nærværelse af serum (10% FBS), blev sårheling observeret hurtigere i de Twist2 /SKOV-3 celler end kontrolceller gruppe på 24 timer (fig. 4A). Da der ikke var nogen stigning i proliferation induceret af Twist2 (fig. 3C), kunne de Twist2 /SKOV-3 celler har større potentiale celle migration

in vitro

i “sårheling” assay (fig. 4A, 4B ). Disse resultater blev bekræftet ved en transwell kammer assay indeholdende en ekstracellulær matrix lag (matrigel). Som vist i figur 4C, antallet af Twist2 /SKOV-3-celler migreret gennem porerne er mere end kontrolcellerne gjorde.

A. In vitro sårheling assay af SKOV-3 cancerceller med eller uden Twist2 ektopisk ekspression. Repræsentative billeder af celler på “healing” sites på 12 og 24 timer efter skrabning er vist øget celle migration i Twist2 /SKOV-3 celler. B. analyserede migration resultater efter en måde ANNOVA test (Graphpad Prism5 software). En P-værdi på 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. De Twist2-udtrykkende SKOV-3-celler migrerede hurtigere end vektoren-transficerede kontrolceller. C. In vitro matrigel invasion assay af SKOV-3-celler med eller uden ektopisk ekspression af Twist2. Kvantificering indikerede, at Twist2-udtrykkende celler er 8-9 folder mere invasiv end vektorkontrolceller celler i in vitro matrigel invasion assay. *,

s

. 0,005

4. Nuklear β-catenin blev akkumuleret i ovariecancer celler, når Twist2 induceret EMT fænotype

Når Twist2 over-udtrykker i æggestokkene cancerceller, at kræftceller morfologi blev omdannet til fibroblast-lignende form sammen med øget motilitet og invasiv, mens ingen ændring blev fundet i celleproliferation. Vores data viste, at tvungen udtryk for Twist2 kan skubbe disse EOCs at gennemgå en epitelial-mesenkymale overgang.

EMT normalt indebærer forstyrrelser af tight junctions, adherensovergange, som bidrager til adskillelse i individuelle celler [16], [17]. For yderligere at bestemme, om ekspression af Twist2 faktisk fremmer EMT i disse ovariecancerceller undersøgte vi ekspressionen af ​​E-cadherin og N-cadherin, to veletablerede epitelial til mesenkymale beslutningstagere, i Twist2-udtrykkende og vektoren-transficerede SKOV-3 celler. Vi fandt, at ekspressionen af ​​E-cadherin (epithelial maker) bemærkelsesværdigt reduceret i Twist2-udtrykkende celler i forhold til kontrolcellerne, men ekspressionen af ​​N-cadherin (mesenchymale maker) forøget i de celler, der udtrykker Twist2 af real-time PCR ( fig. 5A, 5B). Vi bekræftede endvidere udtrykket resultaterne af E-cadherin, N-cadherin ved Western blot (fig. 5C).

A og B. Real time PCR resultater af Twist2, E-cadherin, N-cadherin, og APC mRNA udtrykkende niveauer i Twist2-udtrykkende celler og vektoren-transficerede kontrolceller (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001). C. Western blot-resultaterne af Twist2, E-cadherin, N-cadherin, β-catenin ekspression i Twist2 /SKOV-3-celler sammenlignet med vektoren /SKOV-3 kontrolceller. D. Fordeling af β-catenin i cytoplasmaet og kernen detekteret af cellen fraktionering metode. P-parental SKOV-3 cancerceller, V-vektor-transficerede kontrol celler, T-Twist2-udtrykkende SKOV-3 celler.

Som Twist2 /SKOV-3 celler viste de morfologiske ændringer (Fig. 2B), til forøget potentiale migrere (fig. 4), og EMT markører ekspression, konkluderede vi, at ektopisk ekspression af Twist2 fremmer en EMT fænotype i epiteliale ovariecarcinomaceller.

det er velkendt, at β-catenin -E-cadherin-komplekset udgør den strukturelle kerne af adherens kontakter, og hindrer β-catenin overførsel til kernen og dens transkriptionelle aktivitet [18]. β-catenin blev også opreguleret i Twist2-udtrykkende celler i forhold til kontrolcellerne med nedsat E-cadherin (fig. 5C). Figur 5D viste β-catenin fordeling af celle fraktionering metode. Nuklear β-catenin steg i Twist2 /SKOV-3-celler. Desuden APC mRNA faldt (fig. 5B).

5. TOPflash transkriptionel analyse af 293FT celler

For at detektere virkningen af ​​Twist2-induceret nuklear translokation af β-catenin på genekspression, kontrolleres vi nedstrøms target gener, såsom c-myc, cyklin-D1 i Wnt signal pathway . Begge c-myc og cyclin-D1 blev forøget med Twist2 overekspression (figur 6). Vi målte derefter TCF /LEF-afhængig transskriptionel aktivitet under anvendelse TOP /FOP flash reporterplasmider. Efter reportergener blev indført i 293FT celler i 48 timer blev transkriptionel aktivitet vurderet ved luciferase og renilla aktivitet. 293FT celler viste signifikant forhøjet LEF /TCF afhængig transskription med Twist2 co-transfektion (i forhold til vektorkontrol; N = 3; P 0,001; Figur 7).

Som c-myc og cyclin-D1 er for det meste betragtes som Wnt målgener, vi yderligere undersøgt deres udtryk ved Western blot gentages tre gange. Immunoblotanalyse der viser, at både c-myc og cyklin-D1 steget på Twist2 /SKOV-3-gruppen sammenlignet med Vector /SKOV-3 gruppe i repræsentativt tal.

For at måle TCF4 /LEF1-afhængig transskriptionel aktivitet af 293FT cellelinier, blev celler transficeret med TOP /FOP flash reporterplasmider. Efter gener transfektion i 48 timer, blev transkriptionelle aktivitet målt ved anvendelse af Dual Luciferase Reporter Assay System. Celler i FOP flash grupper viste ubetydelige niveauer af transkriptionel aktivitet. I modsætning hertil celler i TOPflash grupper cotransficeret med Twist2 viste signifikant vækst i signalet. Resultaterne er gennemsnit ± S.D. af tre forsøg (N = 3; P 0,001).

Tag sammen viser disse data, at Twist2 overekspression i SKOV-3 celler afbryder celle-celle adherens kontakter og fremmer celle migration. Med faldet E-cadherin, β-catenin frigivet fra E-cadherin /β-catenin-komplekset. I mellemtiden, β-catenin-nedbrydning reduceres yderligere ledsaget af nedsat APC, hvilket resulterede i akkumulering af fri β-catenin i cytoplasmaet og forårsagede β-catenin overførsel til kernen for at øge sin transkriptionsaktivitet. Disse data viste, at nukleare β-catenin var involveret i Twist2-induceret EMT af kræft i æggestokkene.

Diskussion

Kræft i æggestokkene er en yderst metastatisk sygdom og identifikation af molekyler og /eller signalveje involveret i cancer invasion og metastase er meget vigtig, for hvilke detektering den tidlige fase er stadig en barriere [4]. Ovariecancerceller er tilbøjelige til metastase i hele den peritoneale kavitet hovedsageligt ved intraabdominal formidling og ved lymfe formidling. Metastase er en kompleks proces, der involverer ændringer i ekstracellulær matrix og celle-celle vejkryds. Epiteliale-til-mesenkymale overgang (EMT) er et nødvendigt skridt i retning af metastatisk tumor progression under frigørelse af tumorceller fra den primære tumor og tilknytning til metastatiske steder. Kun få studier har undersøgt de faktorer, der fremmer EMT af epitelial kræft i æggestokkene (EOC) celler [4], [19].

Flere EMT-fremkaldende regulatorer undertrykke E-cadherin transskription,

via

interaktion med specifikke E-kasser af den proximale E-cadherin promotor [20]. Mest relevant er sneglen (SNAI1 og SLUG) [21], [22], ZEB (ZEB1 og ZEB2) [23] og grundlæggende helixloop-helix (bHLH) (Twist1 [24]) transskription faktor familier. Først for nylig, viste overbevisende dokumentation for, at Twist2 overekspression var signifikant forbundet med livmoderhalskræft progression [25], [26]. Twist2 aktiverer EMT programmer og fremmer en cancer stamcelle-fænotype i brystcancer [10]. Imidlertid har den biologiske funktion af Twist2 i tumor forblev det meste ukendt.

I denne undersøgelse, giver vi den første bevis på, at Twist2 udtryk er forbundet med høj FIGO stadium i kræft i æggestokkene. Det kan forventes, at Twist2 spiller tilsvarende EMT funktioner i kræft i æggestokkene. Til dette formål, vi introducerede

twist2

i SKOV-3 æggestokkræft cellelinje og undersøgte celler biologiske adfærd, herunder proliferation, migration og invasion. Vi fandt, at overekspression af Twist2 havde ingen virkning på cellevækst og Akt, ERK1 /2-aktivering. Interessant, de Twist2 /SKOV-3 celler forøgede migration og invasion af æggestokkene cancerceller, som vurderet ved scratch-sår assay og invasion assay. Som EMT resulterer i forbedret celle motilitet og invasion, vi yderligere kontrolleret EMT markører. Et skifte fra E-cadherin til N-cadherin er også et centralt element i EMT i ovariecancer [4]. Overekspression af Twist2 faldt betydeligt E-cadherin og øget N-cadherinekspression på både mRNA og protein niveauer hhv.

E-cadherin er et transmembrant glycoprotein af type I-cadherin superfamilien. Dens cytoplasmatiske del er knyttet til actincytoskelettet via catenins [27]. Canonical Wnt /β-catenin signalering har stor indflydelse på EMT under kræft progression [28], [29]. Wnt signaler inhiberer GSK3p kinaseaktivitet at stoppe nedbrydning og tvinge en hurtig stigning i niveauerne af fri, cytosolisk β-catenin, og meget snart derefter, translokerer ind i kernen, hvor den binder til TCF /LEF transskriptionsfaktorer [30], [31] . En reduktion i E-cadherin niveauer ofte frigiver β-catenin fra adheren junction, hvilket resulterer i ophobning nukleare β-catenin, og den deraf følgende transaktivering af et panel af målgener, blandt dem de specificerer flere EMT-inducerende faktorer [18], [28 ].

en nylig offentliggjort undersøgelse om tidlig kraniel dermal udvikling angivet en konsekvent rolle for Wnt /β-catenin signalering via Twist2 i dermal specifikation i forskellige regioner af embryo [32]. Twist2 kan være en direkte transskription mål og kan mediere funktionelle rolle Wnt signalering i dermale forstadier. I vort eksperiment Twist2 øget nuklear β-catenin. Endvidere er opløselige og nonsoluble cytosoliske former af β-catenin strengt reguleret af proteosom /ubiquitinering system, der består af GSK3p, axin, og adenomatøs polyposis coli (APC) protein [25]. Grundet nedregulering af APC, var β-catenin-nedbrydning også undertrykt. Når i kernen, vil β-catenin medierer aktivering af specifikke mesenkymale gener. Vi viste en stigning af c-Myc og cyclin-D1 i Wnt /β-catenin signalvej (fig. 6). Fordi β-catenin var nødvendig for ekspression af mesenchymale gener, vi kontrolleret, om den transkriptionelle aktivitet af dette protein var påvirket af ektopisk Twist2. Som vist i fig. 7, blev aktiviteten af ​​TCF4 /LEF1-afhængig promotor (TOP) opreguleret (to folder) i celler transficeret med Twist2. Derfor indikerer disse resultater, at ekspressionen af ​​mesenchymale gener er under kontrol af β-catenin gennem TCF4 /LEF1-afhængige komplekser. Bekræftet ved vist i fig resultat. 5D, distribution nuklear β-catenin blev forøget i Twist2 /SKOV-3-celler. Således kan Twist2 øge TCF4 /LEF1-afhængige β-catenin transkriptionel aktivitet.

I denne undersøgelse, giver vi dokumentation for, at Twist2 påvirker cellulære adfærd i Skov-3 celler, herunder ændringer i morfologi og motilitet. På molekylært niveau, Twist2 inducerer signifikant ændring af EMT markører. Endvidere Twist2 fremmes cellemigration og invasion af SKOV-3-celler. Derfor Twist2 fremmet β-catenin-frigivelse fra E-cadherin /β-catenin-komplekset ved inhibering af E-cadherin. Med ophobning nukleare β-catenin blev Wnt /β-catenin vej aktiveres derefter for at fremme en EMT fænotype.

Så vidt vi ved, vi viser for første gang, at Wnt aktivering i Twist2-induceret EMT fremskridt i kræft i æggestokkene, der giver ny indsigt i deres metastaser.

konklusioner

Vores data tyder på, at opregulering af Twist2 er korreleret med FIGO stadie i humane ovariecancer. Selv om der ikke er nogen korrelation mellem Twist2 ekspression og tumoren histologisk type, Twist2 er en mulig indikator for høj grad af malignitet og dårlig prognose i klinisk ovariecancer. Overekspression af Twist2 inducerede de EMT fænotyper i humane ovariecancerceller

in vitro

. Nedregulering af E-cadherin og APC samt opregulering af N-cadherin og β-catenin (i cellekerne), antyder, at Twist2 fremmer β-catenin-frigivelse fra E-cadherin /β-catenin gennem hæmning af E-cadherin. Desuden, på grund af nedregulering af APC, var β-catenin-nedbrydning undertrykt. Derfor blev kanoniske Wnt /β-catenin pathway aktiveres derefter ved akkumulering nuklear β-catenin, således fremkaldt transskription af nedstrøms målgener at fremme tumorinvasion og metastase. Kollektivt, disse data viste, at β-catenin er involveret i Twist2-induceret EMT i kræft i æggestokkene.

Materialer og metoder

Materialer

Mouse anti-Twist2 antistof blev købt fra Abnova Bioteknologi. Muse anti-Flag, anti-β-actin, og anti-Akt antistoffer blev anskaffet fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Kanin anti-E-cadherin, gede-anti-N-cadherin, kanin-anti-IKB-α, kanin-anti-β-catenin, Mouse anti-Oct-1, kanin-anti-cyclin-D1, kanin-anti-c-myc, Mouse anti-kanin IgG, blev anti-muse IgG antistoffer købt hos Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)

Rabbit anti-phospho-Akt (Ser473) antistof blev indkøbt fra R 10%, 0; 10% -20%, 1. ; 20% -50%, 2; 50%, blev 3. intensiteten besluttede ved at sammenligne farvningen af ​​tumorceller: ingen farvning eller tvetydige farvning, 0; svag farvning, 1; medium-farvning, 2; stærk farvning, blev 3. De to scoringer ganget at kategorisere farvningen: 0-1, negativ (-), 2-4, positiv (+) ≥5, stærk positiv (++)

Generation. af Twist2-overekspression Stabil ovariecancerceller

Den menneskelige ovariecancer cellelinje SKOV-3 blev opnået fra ATCC. Cellerne blev holdt i McCoys 5A-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og penicillin /streptomycin. Flag-Twist2-udtrykkende plasmid blev konstrueret i vores tidligere undersøgelse [25]. Flag-Twist2-udtrykkende plasmid og pBabe-puromycin-vektor blev co-transficeret ind SKOV-3 ovariecancerceller hjælp af lipofectamin 2000

TM transfektionsreagens (Invitrogen) ifølge producentens anvisninger. De Twist2-udtrykkende stabile kloner og vektor kontrol kloner blev opnået henholdsvis gennem selektion med puromycin. De Twist2 ekspressionsniveauerne i de udvalgte stabile kloner blev derefter verificeret gennem immun-blot-analyse med Twist2 og flag antistoffer.

Cell Morfologisk Observation og Konfokal immunfluorescensfarvning

Cell morfologiske former blev observeret ved hjælp af fase mikroskopi (Olympus). Immunhistokemisk farvning blev udført på Twist2 /SKOV-3 og Vector /SKOV-3 ovariecancerceller som tidligere beskrevet [25]. Den farvning af Twist2- og vektor-transficerede SKOV-3 celler blev observeret og analyseret ved hjælp af laserscanning konfokal mikroskopi (Olympus).

Cell Growth Assay

Cellerne blev udsået i normal medium, indtil høstet. Cellevækst blev vurderet via MTT-assay som tidligere beskrevet [34]. Proliferationshastigheden af ​​de transficerede celler blev påvist og sammenlignet med den for vektoren kontrol gennem levedygtige celletællinger ved hjælp trypan-blå-farvning. Tredobbelte analyser blev udført i hver gruppe af celler. Data blev udtrykt som gennemsnit ± SD. Cellen proliferationshastighed (%) blev beregnet som følger: antal celler i forsøgsgruppen /antal kontrolgruppen × 100%

sårheling assay

Celler blev podet på seks-. godt plader (1 × 10

5 celler /skål), og da de nåede over 90% sammenløb, blev en ridse foretaget tværs cellemonolaget med spidsen. Celler blev forsigtigt vasket med PBS i 3 gange og opretholdes i frisk medium. Celler blev inkuberet i 24 timer og fotograferet under anvendelse af et inverteret vævskultur mikroskop ved × 100 forstørrelse. Assays blev udført mindst tre gange, og data blev præsenteret som middelværdier ± SD. Potentialet vandring mellem Twist2-udtrykkende celler og kontrolcellerne blev sammenlignet ved relativ hul afstand. Og vi analyserede resultaterne med en måde ANNOVA test (Prism5 software). En P-værdi på p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Cell Invasion Assay

For invasion assay, 5 × 10

3-celler blev podet på Matrigelcoatede membran indsatser (BD. Bioscience). Bundkammeret indeholdt 0,75 ml McCoys 5A suppleret med 10% føtalt bovint serum som en kemoattraktant. Celler blev inkuberet i 24 timer blev cellerne forblive inde i indsatsen fjernes med en vatpind og celler, der var trængt Matrigel at invadere til den nedre overflade af membranen blev fikseret i methanol og farvet med H & E. Efter lufttørring af membranen, blev cellerne talt ved × 100 forstørrelse i 10 tilfældige synsfelter under et mikroskop. Tre uafhængige forsøg blev udført i hvert enkelt tilfælde.

cellecyklus-analyse via flowcytometri

Cell cykling blev identificeret via flowcytometri analyse som tidligere beskrevet [34]. Kort fortalt blev cellerne udsået i 24 timer, derefter blev høstet, vasket to gange med PBS og fikseret i 70% ethanol ved 4 ° C natten over. Cellepellets blev suspenderet i propidiumiodidfarvning opløsning (20 ug /ml propidiumiodid og 0,2 mg /ml RNase i PBS) og inkuberet i 30 minutter ved 37 ° C. Prøverne blev derefter analyseret gennem flowcytometri.

Isolering af Subcellulære Brøker, og Western Blot-analyse

Cell fraktionering og Western blot-analyse blev udført som vores tidligere publikationer [34], [35]. Nærmere oplysninger om celle fraktionering er som følgende: Whole-celleekstrakter blev fremstillet ved at skrabe cellerne fra petriskåle, vask cellepellets to gange i PBS, og derefter resuspendering pellets i to-hæmatokrit volumener RIPA buffer [150 mM NaCI /50 mM Tris · HCI, pH 7,5 /0,25% (vægt /ol) deoxycholat /1% Nonidet P-40/5 mM natriumorthovanadat /2 mM natriumfluorid /inhibitor-blanding protease]. Nukleare og cytoplasmiske ekstrakter blev isoleret ved vask cellepellets i puffer A (10 mM Hepes, pH 7,5 /10 mM KCI /1,5 mM Mg

2Cl /0,5 mM NaF /1 mM glycerolphosphat /protease-blanding), så Lysis i puffer a + B (buffer a plus 0,5% Nonidet P-40) i et 02:01 mix.