PLoS ONE: Genistein opregulerer tumorsuppressor MicroRNA-574-3p i prostata Cancer

Abstrakt

Genistein er blevet vist at inhibere kræft både in vitro og in vivo, ved at ændre ekspressionen af ​​adskillige microRNA (miRNA ). I denne undersøgelse har vi fokuseret på tumor suppressor miRNA reguleret af genistein og undersøgt deres funktion i prostatakræft (PCA) og mål veje. Brug af miRNA microarray analyse og real-time RT-PCR observerede vi, at MIR-574-3p var signifikant opreguleret i PCA celler behandlet med genistein sammenlignet med vehikelkontrol. Ekspressionen af ​​MIR-574-3p var signifikant lavere i PCA-cellelinjer og kliniske PCA væv sammenlignet med normale prostataceller (RWPE-1) og tilstødende normalt væv. Lavt udtryk niveau af miR-574-3p var korreleret med avanceret tumor stadie og højere Gleason score i PCA prøver. Re-ekspressionen af ​​miR-574-3p i PCA celler signifikant hæmmede celleproliferation, migration og invasion in vitro og in vivo. MIR-574-3p restaurering apoptose ved at reducere Bd-XL og aktivering caspase-9 og caspase-3. Brug GeneCodis software analyse blev flere veje ramt af miR-574-3p identificeret, såsom ‘Veje i kræft «,» Jak-STAT-signalvejen “, og” Wnt signalvej «. Luciferase reporter assays viste, at MIR-574-3p direkte binder til 3’UTR af adskillige målgener (såsom Rac1, EGFR og EP300), som er komponenter af “Veje i kræft«. Kvantitativ realtids-PCR og Western-analyse viste, at mRNA og protein ekspressionsniveauer af de tre målgener i PCA-celler var markant nedreguleret med MIR-574-3p. Tab-af-funktion-studier har vist, at de tre målgener signifikant påvirker celleproliferation, migration og invasion i PCA-cellelinier. Vores resultater viser, at genistein opregulerer tumorsuppressor MIR-574-3p ekspression målretning flere celle signalveje. Disse fund øge forståelsen af, hvordan genistein regulerer med miRNA i PCa

Henvisning:. Chiyomaru T, Yamamura S, Fukuhara S, Hidaka H, ​​Majid S, Saini S, et al. (2013) Genistein opregulerer tumorsuppressor MicroRNA-574-3p i prostatakræft. PLoS ONE 8 (3): e58929. doi: 10,1371 /journal.pone.0058929

Redaktør: Burton B. Yang, University of Toronto, Canada

Modtaget: 16 oktober, 2012; Accepteret: 8. februar 2013; Udgivet: 12 Marts 2013

Copyright: © 2013 Chiyomaru et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af National center for Research Resources af National Institutes of Health gennem tilskud Numbers R01CA160079, R01CA138642, T32DK007790 og VA Merit anmeldelse og VA Program Project. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Medforfatter Rajvir Dahiya er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Den mest almindeligt diagnosticeret type kræft blandt mænd i 2012 er prostatacancer (PSA) der forventes at tegne sig for 29% (241.740) af alle nye kræfttilfælde. PCa andenpladsen til lungekræft i kræftrelaterede dødsfald og forventes at udgøre 9% (28.170) af alle mandlige kræftdødsfald i 2012 [1]. Metastatisk PCa er ikke helbredes, og er fortsat den største årsag til kræftdødsfald [2]. Palliation kan opnås ved hormon deprivationsbehandling dog efter et fremragende initial respons, i ca. 2 til 3 år fleste af disse PSA vil tilbagefald til kastration resistente form af sygdommen [3] med døden sædvanligvis forekommer inden for flere år [4]. Der er ingen vellykkede behandlinger for androgen-uafhængig PCa. En bedre forståelse af biologiske mekanismer af androgen-uafhængige PCa kan føre til nye tilgange til behandling reagerer PCa mere held.

Udvikling af kemoterapeutiske stoffer med lav patient toksicitet øjeblikket undersøgt af mange forskere. Mange af disse midler er afledt af naturlige planteprodukter. Genistein er en phytoestrogenic isoflavonoid der har pleiotrope biologiske virkninger i en lang række forskellige cancere uden synlige toksicitet for normale celler [5]. Genistein er et protein tyrosinkinasehæmmer og påvirker celleproliferation, apoptose, tumor angiogenese, metastase og dæmper multiresistens involverer centrale elementer i signaltransduktionsveje [6], [7], [8].

microRNA’er (miRNA ) er små ikke-kodende RNA’er (21-23 nucleotider), der primært binder ufuldstændigt til den 3 ‘utranslaterede region (UTR) af target mRNA’er og negativt regulerer genekspression post-transkriptionelt af translationel undertrykkelse og nedbrydning af mål-mRNA [9], [ ,,,0],10]. Da identifikation af miRNA i 1993 over 1500 menneskelige miRNA er blevet registreret i miRBase databasen (https://microrna.sanger.ac.uk/). Bioinformatik viser, at mere end 60% af protein-kodende gener kan blive ramt af miRNA [11]. miRNA spiller en vigtig rolle i mange biologiske processer, såsom udvikling, differentiering, proliferation, apoptose, angiogenese og metabolisme. Desuden er de nøgleregulatorer i mange sygdomme, herunder cancer [12] og miRNA kan fungere som onkogener eller tumorsuppressorgener [13], [14]. Virkningerne af genistein om regulering af flere miRNA er blevet rapporteret [15], [16], [17]. Vores laboratorium har vist, at genistein hæmmer kræft cellevækst rettet mod onkogene miRNA som miR-21, miR-151, miR-221 og miR-222. I denne undersøgelse har vi fokuseret på tumor suppressor miR-574-3p der er reguleret af genistein og undersøgt sin funktion i PCA og mål veje.

Resultater

Genistein Behandling Øger miR-574-3p Expression der nedreguleres i PCa

for at bestemme relative ekspressionsniveauer af miR-574-3p i prostata celler, vi udførte kvantitativ real-time PCR ved hjælp PC3 og DU145 cellelinjer og sammenlignet dem med normale prostata epitelceller (RWPE-1). Vi observerede, MIR-574-3p ekspression var betydeligt nedreguleret i PCA cellelinjer sammenlignet med RWPE-1-celler (PC3 0,68-fold, DU145 0,65 gange) (fig. 1A).

(A) ekspression af mIR-574-3p i PCA-cellelinier (DU145 og PC3) og normale prostata-epitelceller (RWPE-1). Real-time PCR viste, at ekspressionsniveauer af MIR-574-3p blev nedreguleret i PCA cellelinjer (DU145 og PC3). miR-574-3p udtryk blev normaliseret til RNU48. Data er præsenteret som gennemsnit ± SE. *, P 0,05. (B) Ekspressionsniveauer af MIR-574-3p efter behandling med genistein (25 um og 50 uM). miR-574-3p udtryk steget med 30-50% i genistein behandlede celler sammenlignet med kontroller. *, P 0,05. (C) MIR-574-3p ekspression i kliniske prøver (Tilstødende normalt væv, n = 48; PCa, n = 48). miR-574-3p udtryk blev bestemt ved real-time PCR og normaliseret til RNU48. P 0,0001. (D) Real-time PCR viser korrelation af klinisk-patologiske karakteristika med miR-574-3p udtryk.

For at identificere miRNA reguleret af genistein, gennemførte vi en miRNA microarray hjælp PC3 celler efter genistein behandling (tabel 1 ). Udtrykket af 33 miRNA var signifikant opreguleret ved hjælp af to koncentrationer af genistein (25 uM og 50 uM) med miR-574-3p bliver hårdest ramt. Tidligere miRNA udtryk undersøgelser fra vores laboratorium viste også, at miR-574-3p var signifikant nedreguleret i PCA prøver sammenlignet med ikke-kræft prostata væv [18]. For at bekræfte ekspression af MIR-574-3p udførte vi TaqMan kvantitativ real-time PCR-analyse og bemærkede, at MIR-574-3p ekspression var signifikant opreguleret med genistein behandling (1,31 til 1,50 gange) (fig. 1B).

miR-574-3p er Markant nedreguleret i PCa vævsprøver

Vi evaluerede ekspressionsniveauer af miR-574-3p i humane PCA væv (n = 48) og tilstødende ikke -cancerous væv (n = 48). Ekspressionsniveauet af MIR-574-3p var signifikant lavere i PCa sammenlignet med normale væv (P 0,0001;. Figur 1C). At afgøre, om niveauerne af MIR-574-3p i tumorvæv korrelerer med klinik-patologiske faktorer, analyserede vi MIR-574-3p ekspressionsniveauer i humane tumorprøver. Kliniske demografi af undersøgelsesgruppen er opsummeret i tabel 2. Korrelation af 574-3p ekspression med klinisk-patologiske variabler såsom patologisk stadium (PT) og Gleason score er vist i fig. 1D. Disse resultater viser, at sager med lav miR-574-3p udtryk stigning fra lav kvalitet, lav patologisk stadium til høj kvalitet og høj patologisk stadium. Disse resultater tyder på, at miR-574-3p er signifikant nedreguleret i PCa og kan være en formodet tumor suppressor i PSA.

Effekt af miR-574-3p Over-udtryk på celleproliferation, migration og invasion i PCa cellelinier in vitro og in vivo

for at undersøge de funktionelle roller miR-574-3p, vi udførte gain-of-funktion studier ved brug af en præ-miR-574-3p miRNA forløber transficeret i PC3 og DU145 celler. Udtrykket af miR-574-3p var markant opreguleret i Pre-miR miRNA precursor transfektanter (figur 2A;. PC3 316,8 gange, DU145 307,5 ​​gange). Celleproliferationsassay (MTS) og sårheling assay viste signifikant inhibering i MIR-574-3p transfektanter i både PC3 og DU145 celler sammenlignet med kontroltransfektanter (fig. 2B og 2C). Invasion assay (Matrigel) viste også, at antallet af invaderende celler blev signifikant reduceret i MIR-574-3p transfektanter sammenlignet med deres modparter (fig. 2D). For at bekræfte effekten af ​​miR-574-3p på tumorgenicitet in vivo blev miR-574-3p og miR-kontrol-transfekterede DU145 celler subkutant injiceret i nøgne mus. Vi observerede, at miR-574-3p overekspression hæmmede DU145 celle tumordannelse in vivo (fig. 2E). Disse resultater antyder, MIR-574-3p spiller en vigtig rolle i tumor celle progression.

(A) MIR-574-3p ekspressionsniveauer i PCA cellelinier (PC3 og DU145) blev bestemt ved real-time PCR ved 72 timer efter transfektion af Pre-miR miRNA precursor. miR-574-3p udtryk blev normaliseret til RNU48. Data er præsenteret som gennemsnit ± SE. (B) Overekspression af MIR-574-3p inhiberer cellernes levedygtighed signifikant. Cellelevedygtighed blev analyseret ved MTS celleproliferationsassay 1, 2 og 4 dage efter transient transfektion. *, P 0,05. (C) Over-ekspressionen af ​​miR-574-3p hæmmer cellemigration betydeligt. Efter transfektion (48 timer), blev et sår dannet ved skrabning og måles efter 6, 12 og 24 timer. Repræsentative billeder af sårheling assay er vist ved 200 ganges forstørrelse. **, P 0,0001. *, P 0,005. (D) Over-ekspressionen af ​​miR-574-3p faldt betydeligt celle invasion. Repræsentative billeder af invasion assay er vist ved 200 ganges forstørrelse. *, P 0,005. (E) Repræsentative billeder af tumorer i nøgne mus 5 uger efter subkutan injektion af transfekterede miR-574-3p DU145 cellelinier eller kontrol cellelinjer og tidsforløbet af tumorvækst.

miR-574-3p påvirkninger Cellular apoptose i PCA Celler

Siden miR-574-3p restaurering signifikant hæmmede celleproliferation i PCA-cellelinjer, vi hypotese, at dets restaurering kan inducere apoptose. Fig. 3A og 3B viste, at de apoptotiske og tidlig apoptotiske fraktioner (øverste højre og nederste højre i kvadrant billeder, henholdsvis) var højere hos miR-574-3p transfektanter sammenlignet med kontrol. Dette peger på en pro-apoptotisk rolle for miR-574-3p og foreslår, at det påvirker apoptotiske veje og regulerer tumorigenicitet. Derfor undersøgt vi ekspressionen af ​​forskellige apoptotiske proteiner ved Western blot-analyse og fandt, at MIR-574-3p re-ekspression forårsager Bd-XL nedregulering (fig. 3C). Også, kløvet caspase-9 og -3 opreguleret (fig. 3C), hvilket yderligere understøtter, at MIR-574-3p er et pro-apoptotisk miRNA.

(A) Apoptose assay under anvendelse af flowcytometri . Repræsentative kvadrant figurer af miR-kontrol og miR-574-3p transfektanter i PC3 (øvre) og DU145 (lavere) celler. (B) Søjlediagrammet angiver forholdet mellem apoptotiske celle fraktioner (tidlige apoptotiske plus apoptotiske celler) i MIR-574-3p transfektanter sammenlignet med kontroller. Data for de apoptotiske cellefraktioner er udtrykt som den relative værdi for den gennemsnitlige ekspression af MIR-kontrol transfektant. *, P 0,05. (C) Immunoblots analyse for apoptotiske markører i miR-kontrol og miR-574-3p transfekterede DU145 celler. GAPDH blev anvendt som en belastning kontrol.

Søg efter miR-574-3p Target Gener ved i silico Analyse

For at søge efter formodede målgener af miR-574-3p, vi anvendes Targetscan databasen. Dette program viste, at MIR-574-3p har 437 forudsagt målgener. Vi brugte i silico analyse for at identificere de biologiske processer eller veje potentielt reguleret af miR-574-3p. Ansøgerlandene målgener blev tildelt til veje ved hjælp GeneCodis software analyse (https://genecodis.cnb.csic.es) [19], [20], [21], og statistisk berigede veje blev identificeret som “Veje i kræft ‘ , ‘Jak-STAT-signalvejen “og” Wnt signalering pathway “(P 0,05, tabel 3). Vi derefter udførte genekspression analyser for alle kandidat target gener involveret i hver af de 9 veje ved hjælp af microarray udtryk data, som blev godkendt af Gene Expression Omnibus (GEO) og fokuseret på de “Pathways i kræft ‘. Fra denne analyse blev identificeret flere afgørende gen mål, herunder tropomyosin 3 (TPM3), vingeløse-typen MMTV integration hjemmeside familie, medlem 5A (WNT5A), ras-relaterede C3 botulinumtoksin substrat 1 (rho familie, lille GTP-bindende protein Rac1) (Rac1), epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), retinoid X receptor, alpha (RXRA), v-akt murine thymoma viral onkogen homolog 2 (AKT2) og E1A bindende protein p300 (EP300).

Luciferase Reporter assays under anvendelse af vektorer, der indeholder 3’UTR-bindingssteder af formodede målgener

for at bekræfte bindingen af ​​mIR-574-3p til 3’UTR af disse 7 målgener, udførte vi luciferase reporter assays. Hvert mål er en forudsagt bindingssted for MIR-574-3p (fig. 4A). Vi klonede de putative MIR-574-3p 3’UTRs målrette til et luciferase reporter assay vektor. Luciferase reporter assays viste, at MIR-574-3p faldt de relative luciferaseaktiviteter af Rac1, EGFR og EP300 (fig. 4B) med undtagelse af fire andre gener. Mutation af den formodede miR-574-3p bindingssteder i disse 3’UTRs faldt svaret på miR-574-3p indikerer, at miR-574-3p binder direkte til 3’UTRs af Rac1, EGFR og EP300.

(A) Formodede miR-574-3p bindende og muterede steder i 3’UTR af target gener. (B) Luciferase reporter assays anvendelse af vektorer, der koder formodede 3’UTR bindingssteder. PC3 og DU145 celler blev transient transficeret med Pre-miR miRNA precursor eller negativ kontrol, efterfulgt af forbigående transfektion med basisk vektor eller vildtype-3’UTR reporterplasmider eller muterede 3’UTR plasmider til 24 timer. 3’UTR reporter aktivitet blev målt ved luciferaseanalyse og normaliseret til aktiviteten af ​​Renilla luciferase. Data er præsenteret som gennemsnit ± SE. *, P 0,05. (C). MRNA-niveauerne for de tre målgener af MIR-574-3p blev bestemt ved kvantitativ realtids-PCR-analyser efter transfektion med MIR-574-3p efterligner og negativ kontrol i PCA-cellelinier (PC3 og DU145). *, P 0,05. (D) Immunblotanalyse for målgener i miR-kontrol og miR-574-3p transfekterede PC3 celler. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol.

Regulering af målgenekspression i PCA cellelinier ved MIR-574-3p

Kvantitativ realtids-PCR-analyse viste, at mRNA-ekspressionsniveauer af de tre målgener i PC3 og DU145 blev undertrykt i miR-574-3p transfektanter sammenlignet med kontroller (fig. 4C). De protein ekspressionsniveauerne af de tre målgener blev også faldet i de miR-574-3p transfektanter sammenlignet med kontrollerne (Fig. 4D).

Effekt af Target Gene siRNA Knockdown på celleproliferation, migration og invasion Aktivitet i PCA cellelinier

for at undersøge den funktionelle rolle målgener, vi udførte tab-of-funktion studier med si-RNA knockdown med PC3 og DU145 celler. MRNA og protein ekspression af Rac1, EGFR og EP300 blev markant undertrykt i si-RNA transfektanter sammenlignet med kontroller (Fig. 5A og 5B). Celleproliferationsassay (MTS) og sårheling assay viste signifikant inhibering i si-Rac1, si-EGFR og si-EP300 transfektanter i begge PC3 og DU145 celler sammenlignet med kontroltransfektanter (fig. 5C og 5D). Invasion assay (Matrigel) viste også, at antallet af invaderende celler blev signifikant reduceret i si-Rac1, si-EGFR og si-EP300 transfektanterne sammenlignet med deres kontrol modparter (fig. 5E).

(A) Mål genekspression niveauer i PCA cellelinier (PC3 og DU145) blev bestemt ved realtids-PCR på 72 timer efter transfektion af siRNA. Target genekspression blev normaliseret til GAPDH. Data er præsenteret som gennemsnit ± SE. *, P 0,05. (B) Målgenekspression i PC3-cellelinjer blev bestemt ved immunoblotanalyse ved 72 timer efter transfektion af siRNA. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. (C) Knockdown af Rac1, EGFR og EP300 inhiberer cellernes levedygtighed signifikant. Cellelevedygtighed blev analyseret ved MTS celleproliferationsassay 1, 2 og 4 dage efter transient transfektion. (D) Knockdown af Rac1, EGFR og EP300 inhiberer cellemigrering betydeligt. Efter transfektion (48 timer), blev et sår dannet ved skrabning og måles efter 6, 12 og 24 timer. Repræsentative billeder af sårheling assay er vist ved 200 ganges forstørrelse. (E) Knockdown af Rac1, EGFR og EP300 signifikant nedsat celle invasion. Repræsentative billeder af invasion assay er vist ved 200 ganges forstørrelse. **, P. 0,0001

Diskussion

Mange undersøgelser har vist, at genistein regulerer kræft celleproliferation, invasion, angiogenese og metastase ved at målrette flere gener og signalveje [6], [7], [22]. For eksempel genistein inhiberede celleinvasion reducere ekspression af MMP2 og MMP9 i human prostata epitel- og metastatiske celler, hvor tumorudvikling er positivt korreleret med ekspressionen af ​​MMP [23], [24], [25]. Vi har tidligere vist, at genistein nedregulerer ekspressionen af ​​MCM2 ved at øge MIR-1296 ekspression i PCA-celler [26]. Vi har også rapporteret, at genistein nedreguleret MIR-221/222 ekspression i PCA-celler resulterer i øget ekspression af tumorsuppressorgen Arhi som er målet for MIR-221/222 [16]. Genistein er også blevet rapporteret at inhibere PCa angiogenese ved suppression af VEGF-medieret autokrin og parakrin signalveje mellem tumorceller og vaskulære endotelceller [27]. Den EP300-genet er blevet identificeret som en co-aktivator af HIF1A og spiller en rolle i stimulering af hypoxi-induceret gener, såsom VEGF [28]. Rac1 er også en vigtig regulator af VEGF-medieret angiogenese [29] og MIR-151 har et onkogent funktion regulere aktivering af Rac1 ved at målrette ARHGDIA [30]. Vi har også for nylig vist, at genistein hæmmede PCa celle migration og opreguleret flere tumorsuppressorgener herunder ARHGDIA ramt af miR-151. I denne undersøgelse fandt vi, at genistein opreguleres MIR-574-3p ekspression i PCA-celler. In silico analyse og luciferase reporter assays viste, at Rac1 og EP300 var putative målgener for MIR-574-3p. Kvantitativ realtids-PCR og Western-analyse viste, at mRNA og protein ekspressionsniveauer af Rac1 og EP300 i PCA-celler var markant nedreguleres af MIR-574-3p. Derfor genistein kan nedregulere Rac1 og EP300 ved opregulering MIR-574-3p.

Over-ekspression af Notch1 fører til induktion af EMT fænotype og forøget ekspression af MIR-21 [31]. Genistein har vist sig at inaktivere Notch og hedgehog signalering [31], [32], og vi tidligere rapporteret, at genistein inhiberede tumorcellevækst ved at reducere MIR-21 ekspression i renalcellecarcinom [15]. Således genistein har en tumorsuppressorfunktion, regulering ‘Notch signalering’ ved nedregulering af MIR-21. Genistein kan også reducere celledeling ved at regulere “Wnt signalering” [33], [34], [35] gennem miR-574-3p i kræft. I denne undersøgelse EGFR, et formodet målgen for miR-574-3p, var opreguleret i PCa og steg i fremskreden kræft [36], [37]. EGFR blev korreleret med en høj Gleason score, sygdomstilbagefald og hormon-refraktær status [37], [38]. Forskere har rapporteret, at EGFR er reguleret af flere miRNA som miR-7, miR-128b, miR-133, miR-145, miR146a, miR-146b-5p, miR-331-3p, miR-542-5p [39] – [47]. Genistein opreguleret miR-146a udtryk i bugspytkirtelkræftceller og funktioner som en tumor suppressor i kastrationsresistent PCa [44], [45]. Genistein kan nedreguleret EGFR niveauer ved opregulering miR-574-3p.

Genistein inducerer apoptose ved at regulere indre og ydre signalveje. Pro- og anti-apoptotiske Bcl-2-familien proteiner spiller en afgørende rolle i reguleringen af ​​mitokondriske apoptotiske vej [48] og nedregulering af Bd-XL ved genistein inducerer apoptose i PCA-celler [49]. I denne pathway aktiveret caspase-9 accelererer bøddel caspaseaktivering, herunder caspase-3, og successivt spalter signalmolekyler og cellulære proteiner [49], [50]. I vores undersøgelse MIR-574-3p induceret apoptose og reguleret ekspression af Bd-XL, caspase-9 og caspase-3. denne undersøgelse viser derfor, at genistein induceret apoptose i PCA celler sker ved øget miR-574-3p udtryk.

I denne undersøgelse har vi fokuseret på miR-574-3p der blev opreguleret af genistein og var en markant nedreguleres miRNA specifik PCA i miRNA profil [18]. Vores tidligere undersøgelser viste, at miR-574-3p kan være en tumor suppressor miRNA i PCa og blærekræft [18], [51], [52]. MIR-574-3p er lokaliseret på kromosom 4p14, et hyppigt deleteret kromosomale region i PCa og blære cancercellelinier [51], [53]. Su et al rapporterede, at ekspressionen af ​​MIR-574-3p blev reduceret i gastrisk cancer og celleproliferation, migration og invasion blev hæmmet betydeligt i MIR-574-3p-transficerede gastriske cancerceller [54]. De fandt den CUL2 genet at være et mål for miR-574-3p hjælp af beregningsmæssige forudsigelse og eksperimentel validering. Vores tidligere undersøgelse viste, at miR-574-3p har tumorsuppressorfunktion og at onkogene MESDC1 genet er målrettet efter miR-574-3p i blærekræft [52]. I denne undersøgelse har vi vist, at MIR-574-3p nedreguleres i kliniske PCA prøver og androgen-uafhængige PCA cellelinier (PC3 og DU145). Nedregulering af MIR-574-3p ekspression i tumorer er relateret til høj tumor stadium og Gleason score indikerer, at MIR-574-3p kan anvendes som en biomarkør for tumorudvikling i PSA.

Afslutningsvis vores resultaterne viser, at genistein opregulerer mIR-574-3p udtryk, der er rettet mod flere celle signalveje. Disse resultater øge vores forståelse af, hvordan genistein regulerer miRNA udtryk i PSA.

Materialer og metoder

Klinisk Prostata Prøver

Alle væv slides blev anmeldt af en bestyrelse certificeret patolog for identifikation af PCa foci samt tilstødende normale kirtelepitel. Alle kræftpatienter havde forhøjede niveauer af prostata specifikt antigen (PSA) og havde gennemgået radikal prostatektomi fra 1998 til 2004. patientens demografi er vist i tabel 2. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, og undersøgelsen blev godkendt af UCSF Udvalg på menneskelige forskningspotentiale (Godkendelsesnr: H9058-35751-01).

Cell Culture

Menneskelig PCA cellelinjer, PC3 og DU145 og en ikke-malign epithel prostata-cellelinje, RWPE-1, blev erhvervet fra The American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). PCA-cellelinier blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) i en fugtig atmosfære af 5% CO2 og 95% luft ved 37 ° C. RWPE-1-celler blev dyrket i keratinocyt-vækstmedium suppleret med 5 ng /ml human rekombinant epidermal vækstfaktor og 0,05 mg /ml bovin hypofyse (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Subsammenflydende celler (60% -70% konfluente) blev behandlet med genistein (25 pmol /L og 50 pmol /l; Sigma, St. Louis, MO, USA) opløst i dimethylsulfoxid og celler behandlet med vehikel (dimethylsulfoxid) tjente som kontrol. Medier og genistein blev ændret hver dag og cellerne blev dyrket i 4 dage.

RNA Extraction

RNA blev ekstraheret fra FFPE humane prøver ved hjælp af en miRNeasy formalin-fikseret paraffinindlejret (Qiagen, Valencia , CA, USA) efter mikrodissektion. For at fordøje DNA blev Qiagen RNase-Free DNase kit anvendes. Totalt RNA blev også udvundet fra PCA cellelinjer og en ikke-malign epitelial prostata cellelinje ved hjælp af en miRNeasy mini kit (Qiagen) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

microRNA Microarray

For miRNA microarray, total RNA blev ekstraheret fra PC3 celler behandlet med genistein anvendelse af en miRNeasy Mini Kit. Den miRNA microarray analyse blev udført og analyseret af et kommercielt selskab (falanks Biotech, Belmont, CA, USA) ved hjælp af menneskelige v3 miRNA OneArray platform, der er designet til at indeholde 100% af miRBase Sequence Database Slip 17.0.

kvantitativ realtids-PCR

Ekstraherede totalt RNA blev revers transkriberet til enkeltstrenget cDNA ved anvendelse af en iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og en TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kvantitativ realtids-PCR-analyse blev udført med en Applied Biosystems Prism7500 Fast Sequence Detection System ved hjælp TaqMan universal PCR Master Mix ifølge fabrikantens protokol (Applied Biosystems). Niveauer af RNA-ekspression blev bestemt under anvendelse af 7500 Fast System SDS softwareversion 1.3.1 (Applied Biosystems). PCR parametre for cykling var som følger: 95 ° C i 20 sekunder, 40 cykler af PCR ved 95 ° C i 3 sekunder, og 60 ° C i 30 sekunder. Alle reaktioner blev udført i en 10-pi reaktionsvolumen i tre eksemplarer. Data blev analyseret med delta-delta Ct metode til beregning af fold-change. TaqMan prober og primere til Rac1 (assay ID: Hs01902432_s1), EGFR (assay ID: Hs01076078_m1), EP300 (assay ID: Hs00914223_m1), GAPDH (assay ID: Hs02758991_g1), miR-574-3p (assay ID: 002.349), RNU48 (Assay ID: 001.006) blev opnået fra Applied Biosystems. GAPDH og RNU48 blev anvendt som intern kontrol.

Western Analysis

72 timer efter transfektion blev cellerne lyseret med RIPA-buffer (Pierce, Brebieres, Frankrig) indeholdende proteaseinhibitorer (Sigma). Protein kvantificering blev udført under anvendelse af et BCA protein assay kit (Pierce). Protein lysat (30 ug) blev separeret på 4% til 20% SDS-polyacrylamidgeler og overført til en PVDF-membran. Antistoffer mod EP300 og Bd-XL blev erhvervet fra Invitrogen og Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Antistoffer mod Rac1, EGFR og GAPDH blev erhvervet fra GeneTex (Irvine, CA, USA) hhv. Antistoffer mod spaltet caspase-3, -9 og caspase-3, -9 blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Efter inkubation med primært antistof blev membranen vasket og derefter inkuberet med sekundære antistoffer konjugeret til peberrodsperoxidase (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Specifikke komplekser blev visualiseret med en echochemiluminescence (ECL) detektionssystem (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Membranen blev fjernet under anvendelse ReBlot Plus Strong Antibody Stripping Solution (Millipore, Billerica, MA, USA). Ekspressionsniveauet af gener blev derefter evalueret ved hjælp af ImageJ software (ver 1,43;. https://rsbweb.nih.gov/ij/index.html).

transfektion

Pre-miR miRNA precursor og negativ kontrol (Applied Biosystems) blev anvendt i gain-of-function eksperimenter. Rac1, EGFR og EP300 siRNA (Sigma) og negativ kontrol siRNA (D-001.810-10; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) blev anvendt i tab-af-funktion eksperimenter. PC3 og DU145 celler blev forbigående transficeret ved hjælp af Lipofectamine 2000 transfektion reagens (Invitrogen), i henhold til producentens anbefalinger.

Cell Proliferation, migration og invasion Analyser

Cell proliferation blev målt ved hjælp af en CellTiter 96 vandige Solution Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega, Madison, WI, USA) udført ifølge producentens anvisninger. Celleproliferation blev bestemt ved absorbansmålinger ved 490 nm ved anvendelse SpectraMAX 190 (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA). Cellemigration aktivitet blev evalueret af en sårhelende assay. Celler blev udpladet i seks-brønds skåle, og cellemonolagene blev skrabet ved anvendelse af en P-20 mikropipettespids. Bredden af ​​den oprindelige spalte (0 h) og residualt 6, 12 og 24 timer efter sårdannelse blev beregnet ud fra mikrofotografier. En celle invasion assay blev udført under anvendelse af modificeret Boyden Chambers bestående af Transwell-præcoatede Matrigel membran filterindsatse med otte micron porer i 24-brønds vævskulturplader (BD Biosciences, Bedford, MA, USA). Minimum essentielt medium indeholdende 10% FBS i det nedre kammer tjente som kemoattraktant, som tidligere [55] beskrevne. Alle forsøg blev udført tre gange.

In vivo tumorvækst

Alle dyr pleje blev i overensstemmelse med retningslinjerne i San Francisco Veterans Affairs Medical Center og undersøgelsen blev godkendt af San Francisco VA IACUC (protokol nummer: 11-008-01). Animal brugere har gennemført uddannelsesprogrammer for at håndtere og arbejde med mus gennem AALAS (American Association for Laboratory Animal Science) før dyreforsøg. Efter subkutan xenotransplantat musemodel, DU145-celler (2,5 x 10

6), som blev kortvarigt transficeret med MIR-574-3p eller MIR-kontrol blev suspenderet i 50 pi RPMI 1640-medium og blev subkutant injiceret i nøgne hunmus (stamme BALB /c nu /nu; Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA, USA, 5 uger gamle). I alt 8 nøgne mus (4-MIR-574-3p, 4-MIR-kontrol) blev anvendt og tumorvækst blev undersøgt i løbet af 35 dage. Tumor volumen blev beregnet på grundlag af bredden (x) og længde (y):. X

2y /2, hvor x y

apoptoseassays

Fluorescens-aktiveret celle- (FACS) analyse for apoptose blev udført 96 timer efter transfektion under anvendelse af Annexin V-FITC /7-AAD Kit (Beckman Coulter, Brea, CA, USA), ifølge fabrikantens protokol. Farvede celler blev straks analyseret med et flowcytometer (Cell Lab Quanta SC, Beckman Coulter).

Identifikation af miR-574-3p Reguleret Target Gener og Bioinformatik Analyse

For at søge efter gener, der reguleres af miR-574-3p, brugte vi Targetscan algoritme (frigive 6,2, https://www.targetscan.org/). For at identificere de biologiske processer eller veje potentielt reguleret af miR-574-3p, vi udførte GeneCodis analyse (https://genecodis.dacya.ucm.es/) ved hjælp af alle de kandidatgener.