PLoS ONE: MicroRNA-338 Hæmmer vækst, invasion og metastase af Gastric Cancer ved målretning NRP1 Expression

Abstrakt

NRP1 som multifunktionelle ikke-tyrosin-kinase receptorer spiller kritiske roller i tumor progression. MikroRNA’er (miRNA) er en vigtig klasse af pervasive gener, som er involveret i en række biologiske funktioner, især cancer. Det er fortsat uklart, om miRNA kan regulere ekspressionen af ​​NRP1. Målet med denne undersøgelse var at identificere miRNA, der kan inhiberer væksten, invasion og metastase af mavecancer ved at målrette NRP1 ekspression. Vi fandt, at MIR-338-ekspression blev reduceret i gastrisk cancer-cellelinjer og i gastrisk cancer væv. Desuden fandt vi, at miR-338 hæmmede mavekræft celle migration, invasion, spredning og fremmet apoptose ved at målrette NRP1 udtryk. Som en opstrøms regulator af NRP1, miR-338 direkte henvender NRP1. Den tvungne ekspression af MIR-338 inhiberede phosphorylering af ERK1 /2-, P38 MAPK og Akt; imidlertid blev ekspressionen af ​​phosphoryleret ERK1 /2-, P38 MAPK og Akt restaureret af overekspression af NRP1. I AGS celler inficeret med MIR-338 eller transficeret med SiNRP1 blev proteinniveauer af fibronectin, vimentin, N-cadherin og SNAIL faldt, men ekspressionen af ​​E-cadherin blev forøget. Ekspressionen af ​​mesenchymale markører i MIR-338-udtrykkende celler blev gendannet til normale niveauer ved restitution af NRP1 ekspression.

In vivo

, miR-338 også faldet tumorvækst og undertrykte D-MVA ved at målrette NRP1. Derfor konkluderer vi, at miR-338 fungerer som en ny tumorsuppressorgen i mavekræft. MIR-338 kan falde vandrende, invasive, proliferative og apoptotiske adfærd samt gastrisk cancer EMT, ved at dæmpe ekspressionen af ​​NRP1

Henvisning:. Peng Y, Liu YM, Li LC, Wang LL, Wu XL (2014) MicroRNA-338 Hæmmer vækst, invasion og metastase af Gastric Cancer ved målretning NRP1 Expression. PLoS ONE 9 (4): e94422. doi: 10,1371 /journal.pone.0094422

Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, Taiwan

Modtaget: 18 oktober, 2013; Accepteret: 16 Marts 2014; Udgivet 15. april, 2014

Copyright: © 2014 Peng, et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af projektet for Videnskab og Teknologi udvalg i Shapingba distriktet i Chongqing (201302). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Neuropilins, herunder neuropilin1 (NRP1) og neuropilin2 (NRP2), er multifunktionelle ikke-tyrosin-kinase receptorer, der først blev identificeret baseret på deres kritiske roller i udviklingslandene nervøs [1] system. Nrp1 og Nrp2 har 44% homologi og deler mange strukturelle og biologiske egenskaber. NRP1 eksisterer hovedsageligt i bloodvesselendothelia, og NRP2 hovedsageligt findes i lymfekar [2], [3]. Efterfølgende undersøgelser identificeret NRP-1 som en receptor for vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) -A isoform VEGF-165 i både endotelceller og visse tumorceller [4], [5]. Forskning har vist, at NRP1 er opreguleret i flere forskellige tumortyper og udtrykkes i forskellige tumor vaskulaturerne [3], [6], hvilket antyder, at NRP1 spiller en kritisk rolle i tumorudvikling. Tidlig forskning viste, at NRP1 kunne påvirke væksten af ​​tumorer som en co-receptor af VEGFR [5]. Forskere fandt senere, at NRP1 kunne sætte skub tumorangiogenesis, accelerere tumorvækst og bremse tumor apoptose uden VEGFR [7]. NRP1 kan være en co-receptor af andre vækstfaktorer, der belyser hvorfor VEGF kan signalere gennem neuropilins i fravær af VEGFR-1 eller VEGFR-2 [8], [9]. Som co-receptor af TβRI /TβRII kan NRP1 bremse tumor apoptose og accelerere tumorvækst via både kanoniske og ikke-kanonisk signalering [10]. NRP1, som co-receptor af PDGFR /cMet, kan øge tumorangiogenesis via P38MAPK og ERK-signalering [11].

Som opstrøms regulatoriske gener af NRP1, de transkriptionsfaktorer SP1 /3 og AP1 kan regulere ekspressionen af ​​NRP1 [ ,,,0],12]. Nogle undersøgelser har vist, at butyrat undertrykker udtryk for neuropilin jeg i kolorektale cellelinjer gennem hæmning af Sp1 transaktiveringsfunktion [13].

MikroRNA’er (miRNA) er ikke-kodende RNA-molekyler ca. 21-23 nukleotider i længde, der regulere genekspression på post-transkriptionelle niveau [14], [15], [16]. miRNA udtryk profilering analyser har afsløret en global nedregulering af modent miRNA niveauer i primære humane tumorer i forhold til normale væv [17], [18]. Således kan miRNA fungere som tumor undertrykkere eller onkogener og dysreguleret miRNA udtryk kan bidrage til tumorcellemetastase. Det er fortsat uklart, om miRNA kan regulere ekspressionen af ​​NRP1; derfor, vi havde til formål at bestemme målet miRNA i NRP1. Yderligere funktioner af NRP1 kan blive opdaget ved at studere målet miRNA i NRP1.

Materialer og metoder

Menneskelig vævsprøver og cellelinier

Denne undersøgelse udnyttet friske væv, herunder 41 humane mavekræft prøver og 24 prøver af tilstødende normale slimhinde væv stammer fra 41 patienter, som gennemgik kirurgi på det andet Tilknyttede Hospital i Chongqing Medical University mellem 2012 og 2013. Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med den “Biomedical Research med menneskelige etisk gennemgang (Foreløbig) “regulering af Ministeriet for Sundhed og Helsinki-erklæringen om etiske principper for medicinsk forskning med mennesker. Alle prøver blev opnået med informeret samtykke fra patienterne og forsøgene blev godkendt af Institutional Review Board af Anden Affiliated Hospital i Chongqing Medical University. Alle deltagere forudsat skriftligt informeret samtykke til at deltage i denne undersøgelse

SGC-7901, HGC-27, AGS, MKN-45 og N87 cellelinjer blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC,. Manassas, VA , USA), og GES-1 cellelinje blev købt fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Cellelinierne blev dyrket i RPMI1640 (Hyclone, Logan Utah USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og blev inkuberet ved 37 ° C med 5% CO2.

Primere, RNA Isolation og miRNA Detection

de primere for miR-338-3p og U6 blev produceret ved hjælp af miScript Primer Assay (Qiagen Düsseldorf Tyskland). Sekvenserne for de miRNA anvendt i denne undersøgelse var som følger: miR-338-3p: UCCAGCAUC- AGUGAUUUUGUUG og U6: CGCAAGGAUGACACGCAAAUUCGUGAA- GCGUUCCAUAUUUUU. De reverse primere blev også anvendt i revers transkription-trinnet. Mængder miRNA blev ekstraheret fra dyrkede celler og humane vævsprøver under anvendelse RNAiso for små RNA (Takara Bio, Otsu, Japan) ifølge producentens instruktioner. Poly-A-haler blev sat til MIR-338 og U6 med miRNA Reaction Buffer Mix (Takara Bio), og derefter cDNA blev syntetiseret ud fra 5 ng totalt RNA under anvendelse af miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix (Takara Bio). Real-time PCR blev udført i en CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) med SYBR Premix Ex Taq II (Takara Bio). PCR-betingelserne var 95 ° C i 30 s, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 30 s. Dataene blev normaliseret mod U6 snRNA. Efter amplifikation blev udført en smeltekurveanalyse at bekræfte specificiteten af ​​produkterne.

pcDNA ekspressionsplasmider og plasmidtransfektion

ORF sekvens af NRP1 blev amplificeret fra genomisk DNA isoleret fra AGS celle linje, og ORF regionen af ​​NRP1 cDNA blev derefter subklonet i GV230 vektoren (GeneChem Corporation, Shanghai, Kina) .Den plasmid blev transficeret ind AGS og MKN45 celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) .Twenty-fire timer efter transfektion den celler blev anvendt til redning eksperiment. AGS-celler, der blev stabilt transficeret med NRP1 blev udvalgt ved hjælp af 2 ug /ul puromycin (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Frankrig) 48 timer efter transfektion.

miRNA Gene Kloning og Ektopisk Expression

human mIR-338-genet blev PCR-amplificeret fra normal genomisk DNA og klonet ind i en lentiviral vektor. De lentivirus blev genereret af cotransfektion af HEK293T celler med plasmider pGC-LV, pHelper 1,0 og pHelper 2.0 anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Vira blev høstet 48 timer efter transfektion, og de infektioner blev udført i nærvær af 2 mg /ml polybren (GeneChem Corporation). Kontrol miRNA viruse blev købt fra GeneChem Corporation (Shanghai, Kina). AGS celler, der blev stabilt inficeret med miR-338 blev udvalgt ved hjælp af 2 ug /ul puromycin (Invitrogen) 48 timer efter infektionen.

Gene Expression knockdown af RNA-interferens

NRP1 udtryk ved AGS celler blev stille ved transfektion følgende målrettede siRNA-sekvenser (Sangon Biotech, Shanghai, Kina) med Lipofectamine 2000 (Invitrogen); # 1: agatcgacgttagctccaa; # 2: aacacctagtggagtgata; # 3: CAATCACGTGCAGGCTCAA (hvor der ikke er specificeret, blev siRNA # 3 anvendes). Kontrol siRNA’er (sic) blev genereret ved at indføre 4 basesubstitutioner i NRP1 targeting sekvens (GATAGGTCATGACTGCCC). Otteogfyrre timer efter transfektion blev NRP1 udtryk undersøgt ved immunblotting.

Luciferase Reporter Assay

En PsicheckTM-2 Dual-Luciferase miRNA target ekspressionsvektor blev brugt til 3’UTR luciferaseassays (Sangon Biotech, Shanghai, Kina). Målet onkogen af ​​miRNA-338 blev udvalgt på grundlag af online microRNA måldatabasen https://www.microrna.org/microrna/home.do. Primersekvenserne for vildtype-3’UTR var som følger: fremad: 5′- CCGCTCGAG CAAAGGAC- GGAAGTGGAAGG 3 ‘og revers 5′-ATTTGCGGCCGC GGAGTTCACAAGCACGAGG- TT-3’. Fordi der er to bindingssites i NRP1 3’UTR, vi designet to primersekvenser for mutanten 3’UTR. For én mutant 3’UTR, primersekvenserne var følgende: fremad: 5’GAAT- AATCAGGCATCTTTGTTGAGACCAAGTATGATT-3 ‘og omvendt: 5’GGTCTCAACAAAG- ATGCCTGATTATTCAAATGAAACC-3’. For den anden mutant 3’UTR, primersekvenserne var som følger: fremad: 5′- GCGAAATCCAAGGCATCTTCACCAAGCGTATTCCGTGT-3 ‘og revers: 5′- GCTTGGTGAAGATGCCTTGGATTTCGCTCAGTTTCC-3’. For luciferase assayet blev lipofectamin 2000 til at registrere cotransfektion MKN45 celler med HSA-MIR-338 og PsicheckTM-2 Dual-Luciferase miRNA target ekspressionsvektorer indeholdende vild-type eller mutante målsekvenser. Ildflue luciferase-aktiviteten blev målt ved anvendelse af Dual Luciferase Assay (Promega, Madison, WI, USA) 18 timer efter transfektion, og resultaterne blev normaliseret mod Renilla luciferase. Hver reporterplasmid blev transficeret mindst tre gange (på forskellige dage), og hver prøve blev analyseret tredobbelt.

cellelevedygtighed og Clonability Assays Salg

De transficerede celler blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 1 x 10

4 celler /brønd. En MTT-opløsning (20 ul 5 mg /ml MTT) blev tilsat til kulturerne (for et samlet volumen på 200 ul) og inkuberet i 4 hat 37 ° C. Efter fjernelse af dyrkningsmediet, blev de resterende krystaller opløst i DMSO, og absorbansen ved 570 nm blev målt. For kolonidannelse assayet blev cellerne podet ved en lav densitet (1000 celler /plade) og fik lov at vokse, indtil synlige kolonier fremkom. Cellerne blev derefter farvet med Giemsa, og kolonierne blev talt.

Migration og invasion assays Salg

I Transwell migration assays, 10 × 10

4 celler blev udpladet i det øverste kammer med en ikke-coatet membran (24 brønde insert; 8 mm porestørrelse, BD Biosciences). For invasionen assays, 2 × 10

5-celler blev udpladet i det øverste kammer med en Matrigel-coatede membran (24 brønde insert; 8 mm porestørrelse, BD Biosciences). For begge assays blev cellerne udpladet i et serum-frit medium, og et medium suppleret med 10% serum blev anvendt som en kemoattraktant i det nedre kammer. Cellerne blev inkuberet i 16 timer ved 37 ° C og 5% CO2 i en vævskultur-inkubator. Efter 16 timer blev de ikke-migrerede /ikke-invaderende celler fjernet fra de øvre sider af Transwell membran filterindsatse hjælp bomuld tippes svaberprøver. De migrerede /invaderede celler på de nederste sider af inserterne blev farvet med Giemsa, og cellerne blev talt.

Antistoffer Salg

Antistoffer mod fibronectin, vimentin, N-cadherin, E-cadherin, Sneglen og GAPDH blev erhvervet fra Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Phospho-Erk1 /2, phospho-Akt, og phospho-P38MAPK blev købt fra Abcam (Cambridge, UK), og total Erk1 /2, Akt, og P38MAPK var fra BD Biosciences (USA). Et antistof mod NRP1 blev indkøbt fra R anti-vimentin, anti-E-cadherin og anti-N-cadherin, 1:1200; anti-Sneglen og anti-GAPDH, 1:500; anti-phospho-ERK1 /2-, anti-phospho-Akt, og anti-phospho-P38MAPK, 1:2000; anti-NRP1, 1:600; anti-total ERK1 /2-, anti-Akt, og anti-P38MAPK, 1:500; og HRP-konjugeret IgG, 1:7000.

xenograft Eksperimenter

Mand athymiske nøgne mus 6 til 8 ugers alderen blev indhentet fra Animal Experimental Center i Chongqing Medical University og blev akklimatiseret til 2 uger. Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne fra Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr i Chongqing Medical University. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg i Chongqing Medical University. Alle operationer blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Lige mange AGS celler (10

6) med tvungen ekspression af MIR-338 eller cont-Mir med eller uden NRP1 restaurering, blev suspenderet i 100 pi PBS og injiceret subkutant i den højre bageste flanke af hver mus (10 mus per gruppe) .Tumor væksten blev overvåget dagligt i hver gruppe. Tumorvolumenet blev beregnet ved anvendelse af formlen V = 1/2 x b2, hvor a er den længste tumor akse, og b er den korteste tumor akse. Musene blev aflivet 5 uger senere og tumorerne blev opdelt i to dele. Den ene del blev fikseret i formol til efterfølgende immunhistokemisk analyse, og den anden side blev bevaret i liquidnitrogen til western blotting eller QRT-PCR.

Immunhistokemi

Tumorer bevaret i formalin blev placeret i paraffinblokke og sektioneret på positivt ladede objektglas. Snittene blev afparaffiniseret i xylen, hydratiseres i gradueret alkohol, og forbehandlet i antigen-genvinding i citratbuffer i 20 minutter i en 98 ° C damper (CD34 og NRP1). Sektionerne blev inkuberet ved 4 ° C natten over med CD34 (1:200, Santa Cruz Biotechnology) og NRP1 (1:100 R . E for at vurdere morfologi

Kvantificering af immunhistokemisk Stain Intensitet

For at bestemme tumor mikrokardensitet tæthed, fem tilfældigt udvalgte lysfelt mikroskopiske billeder (forstørrelse 40 ×; området 0,89 mm

2) per prøve blev opnået som beskrevet ovenfor, og de positivt farvede mikrokar blev talt under anvendelse af ImageJ programmet. Den røde kanal, der svarer til CD34-farvning, blev isoleret og digitaliseret til et binært billede, med sort angiver farvede skibe og hvid indikerer ingen farvning. Fartøjer med lumen blev digitalt fyldt, og en sammensat D-MVA blev kvantificeret. Ved hjælp af ImageJ programmet blev brune-farvede billeder specifikke for DAB farvning udvindes ved en farve deconvolution makro. Alle intensitetsværdierne inden for samme koncern blev midlet til at beregne forholdet mellem forskellige grupper.

Statistisk analyse

SPSS 17,0 software blev anvendt til den statistiske analyse. Dataene er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (s.d.). Gruppe sammenligninger blev udført under anvendelse af t-test. Forskelle blev betragtet som signifikante ved p. 0,05

Resultater

MIR Selection

For at blive inkluderet i vores efterfølgende analyse, protein mål for NRP1 havde at være samstemmende forudsagt af mindst tre af de følgende fire forudsigelsesværktøjer: Miranda (https://www.microrna.org), PicTar (https://pictar.bio.nyu.edu/), Targetscan (https://genes.mit.edu/targetscan /index.html) og miRDB (mirdb.org/miRDB/). Baseret på version januar 2012 fandt vi 11 microRNA som potentielt målrettede NRP1. Vi havde tidligere identificeret flere miRNA unormalt udtrykt i gastrisk karcinom ved hjælp af en gen-chip [19] (Tabel 1). Baseret på de to ovennævnte, vi forudsagde en opstrøms miRNA af NRP1: miR-338

miR-338 nedreguleres i Gastric Cancer væv og cellelinier

For at udforske. roller miR-338 i human gastrisk udvikling af kræft, vi målte sine niveauer af ekspression i 41 humane gastrisk kræft prøver og 24 tilstødende normale slimhinde prøver. Ifølge en QRT-PCR-analyse, blev niveauet af MIR-338-ekspression betydeligt reduceret i tumorvæv sammenlignet med de hosliggende normale mucosa væv (fig. 1A). Desuden blev miR-338-ekspression faldet i de gastriske cancer cellelinier (SGC7901, HGC27, AGS, MKN45 og N87) sammenlignet med den normale maveslimhinden cellelinje (GES1) (Fig 1B). Disse resultater tyder på, at miR-338 er nedreguleret i gastriske kræftceller, en konstatering af, at kunne være relevante for menneskelig gastrisk udvikling af kræft.

(A) Ekspressionsniveauerne for modent miR-338 i gastrisk kræft (n = 41) og tilstødende normale mucosa væv (n = 24) blev bestemt ved brug af kvantitativ PCR. Både gastrisk cancer og tilstødende normale mucosa-prøver blev frisk dissekeret. Ekspressionsniveauet af modent MIR-338 i de gastrisk cancer væv var signifikant lavere end i de tilstødende normale slimhinde væv. Dataene fra cellelinjer og humane prøver vises separat. * P 0,01 (B) miR-338 blev reduceret i mavens kræft cellelinier (SGC7901, HGC27, AGS, MKN45 og N87) sammenlignet med den normale maveslimhinden cellelinje (GES1). Dataene repræsenterer gennemsnittet ± s.d. (N = 3) af cellelinierne. ** P. 0,01

miR-338 Direkte Mål oncogen NRP1

NRP1 er blevet rapporteret til at være en vigtig molekyle, der driver mavekræft migration og invasion. Brug forudsigelsesværktøjer, vi forudsagde, at målet miRNA af NRP1 var miR-338. For yderligere at bekræfte, at miR-338 direkte henvender onkogen NRP1, vi udførte luciferase reporter analyser at undersøge, om miR-338 interagerer direkte med sit mål onkogen NRP1. Vi identificerede to potentielle bindingssteder for MIR-338 på 3’UTR af NRP1 mRNA. For at bestemme om NRP1 reguleres af MIR-338 gennem direkte binding til 3’UTR af NRP1 konstruerede vi en serie af 3’UTR-fragmenter, herunder fuldlængde vildtype NRP1 3’UTR, et bindingssted 1 mutanten og et bindingssted 2 mutant (fig. 2A). Disse fragmenter blev derefter indsat i psiCHECK2 luciferasereporterplasmid. Vi fandt, at co-transfektion af MIR-338 og vildtype-NRP1 3’UTR forårsagede et signifikant fald i luciferaseenheder sammenlignet med kontrollerne. Men den co-transfektion af MIR-338 og mutanten NRP13’UTR ikke forårsage et fald i luciferaseenheder (fig. 2B). Disse resultater antyder, MIR-338 mål NRP1 direkte.

(A) Luciferase reporter plasmider blev konstrueret ved insertion af fuldlængde NRP1 3’UTR til en region umiddelbart nedstrøms for luciferasegenet. Sekvenserne af to forudsagte MIR-338 bindende sites inden for NRP1 3’UTR, herunder thefull-længde vildtype-UTR og en mutant bindingssted, er vist. (B) Den relative luciferaseaktivitet blev analyseret efter ovennævnte reporter plasmider eller en kontrol reporterplasmid blev cotransficeret med MIR-338 efterligner eller kontrol efterligner til MKN45 celler. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± standardafvigelse .; * P 0,01, ** p . 0,05

miR-338 inhiberer Gastric Cancer Cell Migration, Invasion og spredning og Fremmer Apoptose af NRP1

For at undersøge den funktionelle betydning af miR -338 overekspression i mavekræft, vi smittet mavens kræft cellelinjer AGS og MKN45 med LV-HSA-mir-338. Sammenlignet med ekspressionen af ​​cont-miR blev MIR-338 signifikant overudtrykt i AGS og MKN45 cellelinier efter infektion med LV-HSA-mir-338 (figur 3A). Vi fandt også, at sammenlignet med cont-Mir ekspressionen af ​​NRP1 var signifikant nedreguleret i AGS og MKN45 cellelinier efter infektion med LV-HSA-mir-338 (figur 3B). Cellerne med tvungen ekspression af MIR-338 udviste signifikant nedsat proliferation sammenlignet med cellerne med tvungen ekspression af cont-miR (figur 3C). MIR-338-inficerede celler udviste også reduceret kolonidannelse evne: antallet af foci i Mir-338-udtrykkende celler blev nedsat i forhold til de cont-MIR-inficerede celler (Figur 3D). Transwell migration og Matrigel invasion analyser viste, at miR-338 væsentligt reduceret migrationen og invasion kapacitet den årlige vækstundersøgelse og MKN45 celler (Figur 3E). Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) -analyse viste, at den tvungne ekspression af MIR-338 fører til gastrisk cancercellelinie apoptose. Den procentdel af de samlede apoptotiske celler (tidlig apoptotisk + sen apoptotiske) steg betydeligt med 11% som reaktion på miR-338 overekspression sammenlignet med cont-miR overekspression i AGS celler. En stigning i antallet af apoptotiske celler 10% blev observeret i MKN45 celler med MIR-338 overekspression sammenlignet med cont-miR (figur 3F). miR-338 kunne regulere ekspressionen af ​​NRP1 ved direkte at hæmme NRP1 afskrift eller andre indirekte kredsløb, så vi næste undersøgt, om reduktionen af ​​NRP1 udtryk kunne forklare hæmning af mavekræft celle migration, invasion og spredning observeret efter den tvungne udtryk for miR- 338. Vi tvunget derfor ekspressionen af ​​MIR-338 i AGS celler sammen med en konstruktion indeholdende NRP1 kodende sekvens, men mangler 3’UTR af NRP1 mRNA. Som følge heraf denne konstruktion gav en NRP1 mRNA, som var resistent over for MIR-338. Vi fandt, at mavekræft celle migration, invasion, proliferation og apoptose blev restaureret i AGS-cellelinje med tvungen miR-338 udtryk og NRP1 restaurering (figur 3G-3J). Disse resultater viser, at miR-338 hæmmer mavekræft celle migration, invasion og spredning og fremmer apoptose ved at målrette NRP1.

(A) miR-338-ekspression blev øget betydeligt i gastriske kræftceller efter infektion med LV-HSA -mir-338. (B) Den NRP1 ekspression blev signifikant reduceret i gastrisk cancer celler efter infektion med LV-HSA-mir-338. (C) Gastrisk cancercelleproliferation var signifikant reduceret efter LV-HSA-mir-338-infektion sammenlignet med cont-miR infektion. (D) MIR-338 overekspression inhiberede signifikant kolonidannende evne gastriske cancerceller. (E) miR-338 overekspression betydeligt reduceret migrationen og invasion kapacitet AGS og MKN45 celler sammenlignet med kontrollerne. (F) MIR-338 overekspression signifikant øget gastrisk cancercellelinie apoptose. (G-J) Gastrisk kræft celle migration, invasion, proliferation og apoptose er genoprettet efter NRP1 restaurering. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± standardafvigelse .; * P 0,001, ** p 0,05, *** p. 0,01

Effekt af miR-338 på signalveje i AGS celler

Som en ikke-tyrosin- kinase receptor, kan NRP1 moderat forøge ekspressionen af ​​phosphorylering af ERK1 /2-, Akt, og P38MAPK at fremme tumorcelleproliferation og metastase samt at bremse apoptose og immunresponser. Fordi NRP1 er en nedstrømsmål af MIR-338, antog vi, at MIR-338 kunne formindske ekspressionen af ​​phosphoryleringen af ​​ERK1 /2-, Akt, og P38MAPK. Vi fandt, at den tvungne ekspression af MIR-338 inhiberede phosphorylering af ERK1 /2-, men den relative ekspression niveauet af total Erk1 /2 blev ikke signifikant. MIR-338 kunne også mindske phosphorylering af p38 MAPK og Akt (Fig 4A). miR-338 kunne binde 3’UTR af NRP1 mRNA at regulere phosphorylering af ERK1 /2, Akt og P38MAPK; Men vi vidste ikke, om miR-338 kunne binde de 3’UTRs af andre gener for at opnå en lige effekt. Så rednings forsøg blev udført, og genoprettelse af NRP1 udtryk blev bekræftet gennem en immunoblotanalyse (figur 4B). Vi fandt, at phosphoryleringsniveauerne af ERK1 /2-, Akt og P38MAPK blev ikke ændret signifikant i AGS celler med tvungen MIR-338-ekspression og NRP1 restaurering (Fig 4C). Vi konkluderer derfor, at MIR-338 regulerer phosphorylering af ERK1 /2, P38 MAPK og Akt via NRP1.

(A) phosphorylering og total ekspressionsniveauer af ERK1 /2, Akt og P38MAPK i AGS celler inficeret med LV-HSA-mir-338 eller cont-miR. (B) En immunoblotanalyse af NRP1 ekspression i AGS celler inficeret med LV-HSA-mir-338 eller cont-Mir med eller uden NRP1 restaurering. (C) Den phosphorylering og total ekspressionsniveauer af ERK1 /2, Akt og P38MAPK i AGS celler inficeret med LV-HSA-mir-338 eller cont-Mir med eller uden NRP1 restaurering. Ekspressionsniveauerne af de phosphorylerede proteiner blev normaliseret til de af de respektive totale proteiner. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± standardafvigelse .; * P. 0,01

miR-338 Bestemmer Epithelial Fænotype af mavekræft

EMT er en vigtig mekanisme i forbindelse med kræft invasiv og metastase. Fænomenet EMT defineres som overgangen af ​​epitelceller til fibroblastoid- eller mesenchymal-lignende celler. EMT er karakteriseret ved tab af epitel markører og erhvervelse af mesenkymale komponenter. E-cadherin, occludin og cytokeratin er nedreguleres under EMT, mens N-cadherin, vimentin, fibronektin og SNEGLEN opreguleres. NRP1 øger signalering via tre store veje, der er blevet knyttet til EMT, dvs., TGF-β, Hh og HGF /cMet. At finde den rolle NRP1 i opretholdelsen af ​​mesenkymale fænotype af gastriske celler, vi bankede ned ekspressionen af ​​NRP1 ved RNA-interferens (RNAi) (fig. 5A) og undersøgt ekspressionen af ​​mesenchymale markører, såsom fibronectin, vimentin, N-cadherin og SNAIL samt epitel markør E-cadherin, i AGS celler. Vi fandt, at ekspressionsniveauerne af fibronectin, vimentin, N-cadherin og SNAIL blev reduceret, men ekspression af E-cadherin blev forøget i NRP1-udtømte tumorceller (fig. 5B). Resultatet viser, at NRP1 kan køre EMT proces i gastrisk cancer. Fordi NRP1 er en downstream mål for miR-338, antog vi, at miR-338 kunne bestemme den epitel fænotype af mavekræft. For at bestemme om de molekylære ændringer er typiske for en reduceret EMT forekom i MIR-338-udtrykkende celler undersøgte vi ekspressionen af ​​mesenchymale og epiteliale markører i AGS-celler. Den immunoblotanalyse viste, at ekspressionsniveauerne af fibronectin, vimentin, N-cadherin og SNAIL reduceredes i AGS celler med tvungen ekspression af MIR-338. Desuden tvungen ekspressionen af ​​miR-338 forøgede ekspression af E-cadherin i AGS-cellelinje, mens kontrol-inficerede celler forblev E-cadherin negative. Vi fandt, at MIR-338 regulerede phosphoryleringen af ​​ERK1 /2, P38 MAPK og Akt via NRP1; Derfor var det nødvendigt at undersøge, om miR-338 kunne regulere EMT via NRP1. Den immunoblot-analyse viste, at ekspressionen af ​​de ovennævnte mesenchymal markører i Mir-338-udtrykkende celler blev genoprettet til det normale niveau ved restitution af NRP1 ekspression (fig. 5C). Tilsammen viste disse resultater, at MIR-338 kunne inhibere EMT via NRP1 i gastriske cancerceller

(A) Højre panel:. NRP1 ekspression blev påvist ved western blot i AGS celler efter behandling med 3 uafhængige siRNA-sekvenser (siNRP1 ) eller en kontrol (sic). Venstre panel: Relativ ekspression af NRP1 blev vist i histogrammet. (B) Højre panelet: Et immunoblotanalyse N cadherin, vimentin fibronectin, E cadherin og SNAIL på AGS celler var transficeret med eller siNRP1 SiC. Venstre panel: Relativ ekspression af proteiner blev vist i histogrammet. (C) En immunoblotanalyse af N-cadherin, vimentin, fibronectin, E-cadherin og SNAIL i AGS celler inficeret med LV-HSA-mir-338 eller cont-Mir med eller uden NRP1 restaurering. Protein- ekspressionsniveauer blev normaliseret til GAPDH. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± standardafvigelse .; * P. 0,01

miR-338 Mindsker tumorvækst og undertrykker D-MVA ved målretning NRP1

In Vivo

På baggrund af de observerede fald i vandrende, invasive og proliferative adfærd i AGS og MKN45 celler inficeret med LV-HSA-mir-338, Derefter undersøgte vi, hvilken rolle MIR-338 i vækst in vivo. Vi subkutant inokuleret nøgne mus med lige numre (1 × 10

6 celler per mus) af AGS celler med tvungen ekspression af MIR-338 eller cont-Mir med eller uden NRP1 restaurering. Tumorincidens blev vurderet hver anden uge, og tumorer optrådte i alle musene. MIR-338-ekspression i den nøgne mus tumorer blev målt under anvendelse QRT-PCR, og vi fandt, at MIR-338-ekspression steget væsentligt i de tumorer, der overudtrykkes MIR-338 (figur 6A). Den tvungne ekspression af MIR-338 inhiberede signifikant tumorvækst in vivo, men overekspression af NRP1 kan genoprette tumorvækst (figur 6B). Dernæst undersøgte vi NRP1 ekspression i den nøgne mus tumorer ved Western blot og immunohistokemi. Vi fandt, at NRP1 udtryk faldt betydeligt i de tumorer, der overudtrykt miR-338; dog var NRP1 udtryk restaureret i tumorer, der overudtrykt NRP1 (figur 6C, 4D). , Udledte således vi, at miR-338 hæmmede tumorvækst ved bremse NRP1 udtryk in vivo. NRP1 kan øge tumorangiogenesis; derfor, vi hypotese, at den tvungne ekspressionen af ​​miR-338 ville hæmme tumorangiogenesis via Npr1.