PLoS ONE: Systemanalyse af ATF3 i stress-respons og Kræft afslører modsatrettede effekter på Pro-Apoptotiske Gener i p53 Pathway

Abstrakt

Stress-inducerbare transkriptionsfaktorer spille en central rolle i cellulær tilpasning til miljøet for at opretholde homeostase og integriteten af ​​genomet. Aktivering transkriptionsfaktor 3 (ATF3) induceres af en række stress- og inflammatoriske tilstande og er overudtrykt i mange former for cancerceller. Imidlertid har molekylære mekanismer bag pleiotrope funktioner ATF3 været undvigende. Her anvendes vi systemer analyse for at identificere genom-dækkende mål for ATF3, som enten induceres af et alkyleringsmiddel methylmethansulfonat (MMS) eller over-udtrykkes i en prostata tumorcellelinie LNCaP. Vi viser, at stress-induceret og kræft-associeret ATF3 rekrutteres til 5,984 og 1.423 mål, henholdsvis i det menneskelige genom, 89% er almindelige. Især er ATF3 mål højt beriget for ikke kun ATF /CRE motiver, men også bindingssteder for flere andre stress-inducerbare transkriptionsfaktorer indikerer et omfattende netværk af stress respons faktorer i transkriptionel regulering af target gener. Yderligere analyse af virkningerne af ATF3 knockdown på disse mål viste, at stress-induceret ATF3 regulerer gener i metaboliske veje, cellecyklus, apoptose, celleadhæsion og signalering herunder insulin, p53, Wnt, og VEGF veje. Kræft-associeret ATF3 er involveret i reguleringen af ​​forskellige sæt af gener i processer såsom calcium signalering, Wnt, p53 og diabetes veje. Især stress-induceret ATF3 binder sig til 40% af p53 mål og aktiverer pro-apoptotiske gener såsom TNFRSF10B /DR5 og BBC3 /PUMA. Cancerassocierede ATF3 derimod undertrykker disse pro-apoptotiske gener udover CDKN1A /p21. Tilsammen vores data afslører et omfattende netværk af stress-inducerbare transkriptionsfaktorer og vise, at ATF3 har modsatrettede, celle kontekst-afhængige virkninger på p53 target gener i DNA-skade responset og kræft udvikling

Henvisning:. Tanaka Y, Nakamura A, Morioka MS, Inoue S, Tamamori-Adachi M, Yamada K, et al. (2011) Systemanalyse af ATF3 i stress-respons og Kræft afslører modsatrettede effekter på Pro-Apoptotiske Gener i p53 Pathway. PLoS ONE 6 (10): e26848. doi: 10,1371 /journal.pone.0026848

Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: August 15, 2011; Accepteret: 4 Oktober 2011; Udgivet: 26 okt 2011

Copyright: © 2011 Tanaka et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud til SK (18012015, 18055008, og 21590302) og et tilskud til Y.T. (20510183) fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi, Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Transkriptionsfaktorer spiller vigtige roller i tidsmæssig regulering af genekspression i serum stimulering af humane celler [1], [2]. Cellular tilpasning til forskellige miljømæssige stress betingelser er også reguleret af transkriptionsfaktorer, der co-ordinately modulere ekspressionen af ​​gener involveret i vedligeholdelse af cellulær homeostase og genetiske integritet. Et sådant system spiller en vigtig rolle for ikke alene overlevelse af normale celler, men også modstand af cancerceller til metaboliske og genotoksiske belastninger. Et afgørende skridt i retning af at forstå molekylære mekanismer bag stressreaktioner er identifikationen af ​​målgener af hver transskription faktor. Studier i gær under anvendelse af genekspression profilering [3], [4] og senere systemer analyse ved kromatin immunofældning af transkriptionsfaktorer [5], har afsløret et genom-dækkende net af transkriptionsfaktorer, der regulerer ekspression af gener, der orkestrerer cellecyklus, gentranskription, proteinsyntese, og DNA-reparation som respons på MMS. I pattedyr, tumor suppressor p53 spiller en central rolle i DNA-skade responset gennem transkriptionel kontrol af flere hundrede gener [6], [7]. Vigtigere er kun en lille delmængde af p53-mål aktiveret under særlige betingelser [8], hvilket indikerer, at enten binding af p53 til targets [9] – [11] eller trans-aktivering potentiale p53-proteiner [12], [13] kan være påvirket af tilhørende molekyler.

ATF3 er medlem af ATF /CREB familie af basisk-leucin-zipper (b-Zip) type transkriptionsfaktorer [14] og er en meget alsidig stress sensor til en bred vifte af forhold herunder hypoxi, hyponutrition, oxidative stress, ER understreger og forskellige genotoksiske belastninger [15], [16] samt inflammatoriske reaktioner [17], [18]. ATF3 aktiveres også ved serumstimulering og nedstrøms for c-Myc [19], og er ofte overudtrykkes i forskellige tumorer herunder prostata [20], bryst [21] og Hodgkins lymfomer [22]. Vigtigere er det, har flere linjer af beviser angivet en tæt sammenhæng mellem ATF3 og p53 signalveje. Således er ATF3 induceret nedstrøms for p53 ved DNA-skade og fungerer som en effektor af p53-medieret celledød [6], [23] – [25]. Desuden ATF3 potenserer p53 ved direkte binding og inhibere dets ubiquitilation, hvilket betyder, at ATF3 kan modulere aktiviteten af ​​p53 [26], [27]. Endvidere ATF3 tilsyneladende medfører en negativ feedback til p53 pathway ved at nedregulere

TP53

genekspression [28], den gentog en lignende feedback regulering af inflammatoriske cytokingener af ATF3 [17]. Der bekræfter en sådan negativ feedback-model, har en nylig undersøgelse viste, at ATF3 induceres af Cyclosporin, en immun suppressor, og fremmer hudkræft ved at nedregulere

TP53

[29]. Samlet set viser disse undersøgelser antyder, at ATF3 interagerer med p53 pathway både som en nedstrøms effektor af p53-medieret celledød og som en positiv og negativ regulator af p53-signalering.

Ændring i samspil mellem ATF3 og transkriptionsfaktorer sådanne som p53 i forskellige typer af celler og /eller miljømæssige forhold kan delvist konto for forskellige effekter af ATF3 på celle skæbne (dvs. pro-apoptotiske eller vækstfremmende for ikke-transformerede celler eller malignt transformerede celler, henholdsvis) [21]. Tidligere arbejde fra vores laboratorium har også beskrevet pleiotrope funktioner i ATF3 under forskellige stress betingelser [18], [19], [25], [28], [30]. Her udføres vi ud systemanalyse af ATF3 mål og identificerede tusindvis af ATF3 bindingssteder i genomet. Vi viser, at ATF3 udgør en udstrakt overlappende genregulatorisk netværk med andre stress-inducerbare transkriptionsfaktorer og regulerer cellecyklus, celledød, adhæsion, og flere signalveje, herunder p53. Især ATF3 binder til 40% af de kendte mål af p53 og regulerer apoptotisk celledød gennem co-aktivering af en delmængde af pro-apoptotiske gener stressrespons mens undertrykke de samme mål i cancerceller konstitutivt udtrykker ATF3. Mulige skift mekanismer mellem pro-overlevelse og pro-apoptotiske ATF3 funktioner vil blive diskuteret.

Resultater

Systemanalyse identificerer tusindvis af ATF3 mål i det menneskelige genom

For at identificere genomisk mål for ATF3, blev kromatin immunpræcipitationsanalyse udført ved anvendelse HCT116 human coloncancer cellelinie stimuleret af MMS og LNCaP prostatacancer cellelinie, der konstitutivt udtrykker ATF3. Som rapporteret tidligere [24], MMS behandling af HCT116 celler induceret forbigående ekspression af ATF3 nåede et højdepunkt på 6 timer efter stimulering (Fig. 1A), hvorimod der ikke blev påvist et forhøjet indhold af ATF3 proteiner efter 3 timer og nåede et maksimalt niveau på 12 timer af stimulation (fig. 1B). Genomisk DNA blev fremstillet fra enten HCT116-celler behandlet med MMS i 6 timer eller ubehandlede LNCaP-celler, immunpræcipiteret med anti-ATF3 antistoffer og hybridiseret til NimbleGen menneskelige RefSeq HG18 promotor flisebelægning arrays. Efterfølgende blev topdetektion udført af Modelbaseret analyse af 2-farvet Arrays (MA2C) pakke [31], som afslørede et uventet stort antal ATF3 mål på en afskæring på 0,2% FDR (fig. S1A og S1B) . Vi identificerede 5,984 og 1.423 mål for ATF3 i MMS-behandlede HCT116 celler og LNCaP-celler, henholdsvis 1.269 (dvs. 89%) heraf blev klippet mellem de to modeller. (Fig. 1C). Vi har detekteret ingen mål for Y-kromosomet fra HCT116 overensstemmelse med dens kvindelige oprindelse. Vi har også med succes identificeret tretten ATF3 mål, som tidligere var blevet vist at være reguleret af ATF3 i forskellige celletyper.

(A) RT-PCR-analyse af ATF3 i HCT116 celler behandlet med 50 ng /ml MMS. (B) Western blot-analyse af ATF3 proteiner i MMS-behandlede HCT116 celler. (C) Fælles og unikke mål af ATF3 i HCT116 celler og LNCaP celler.

Motiver af stress-associeret transkriptionsfaktorer er overrepræsenteret i ATF3 mål

ATF3 kunne rekrutteres til sine mål enten ved direkte binding til en konsensus genkendelsessekvens TGACGTCA eller alternativt ved at interagere med andre transkriptionsfaktorer, herunder et stort antal b-Zip-proteiner [14], [32]. For at vurdere, om ATF /CRE motiv eller andre transkriptionsfaktor motiver er beriget blandt de potentielle ATF3 mål, blev antallet af promotorer i ATF3 mål indeholder mindst ét ​​hit af et givet motiv i TRANSFAC database analyseres af P-Match algoritme (fig. S2). Tabel 1 opsummerer berigelse af et givet motiv som repræsenteret ved antallet af promotorer i ATF3 mål indeholder motivet subtraheret med antallet af promotorer i en baggrund gensæt indeholder det samme motiv. Som forventet, ATF /CRE bindingssteder var de mest berigede motiver i ATF3 mål (

s

-værdi for HCT116-specifikke mål: 3,76 × 10

-40 til 4,34 × 10

-22,

s

-værdi for fælles mål for HCT116 og LNCaP celler: 0-4,20 × 10

-6). Desuden fysiske afstand mellem forudsagte ATF /CRE sekvenser af motivet scan og ATF3 toppe af chip-analyse var inden for et område på nogle få hundrede basepar (dvs. tæt på opløsning af chip analyse) for størstedelen af ​​ATF3 mål (Fig . 2). Derimod var der ikke sammenhæng mellem uafhængige BRCA1 og GATA1 motiver og ATF3 toppe (fig. 2). Tilsammen disse data tyder på, at størstedelen af ​​ATF3 toppe af chip-analyse kan forklares ved direkte binding af ATF3 til ATF /CRE motiver.

Fordeling af fysiske afstand mellem ATF /CRE, BRCA1 og GATA1 motiver på ATF3 mål fra ATF3 toppe identificeret ved chip-analyse. ATF3 toppe stort set sammenfaldende med ATF /CRE motiver, men viser ingen sammenhæng med uafhængige BRCA1 og GATA1 motiver.

Interessant, motivet scanningen viste også, at bindingssteder af andre stress-inducerbare transkriptionsfaktorer var meget overrepræsenteret i ATF3 mål som svar på DNA-skader (tabel 1). Disse omfattede store regulatorer af ER stress (DDIT3, NF-E1), hypoxi (HIF-1A), UV stress (USF2, RFX1), oxidativt stress (c-Ets), og DNA-skader (NF-Y, E2F, EGR- 1, FOXJ2, Sp1). Notatet medlemmer af b-Zip familie (AP-1, DDIT3, og USF2) har et potentiale til at heterodimerisere med ATF3 [33] og Sp1 er blevet rapporteret til fysisk interagere med ATF3 [34]. Det er derfor muligt, at ATF3 rekrutteres til en delmængde af sine mål indirekte gennem samarbejde med andre stress-inducerbare transkriptionsfaktorer.

ATF3 regulerer forskellige biologiske processer i stress respons og i kræft

Efter at have etableret potentielle mål for ATF3 i genomet, næste vi havde til formål at identificere de gener, som udtryk reguleres af ATF3. Til dette formål, vurderede vi virkningen af ​​ATF3 knockdown af siRNA (fig. 3A) på genekspression mønstre ved 0, 6, 12, og 24 timer efter stimulering af MMS bruger Agilent Whole Human Genome Microarray. Efter normalisering af arrays ved hjælp af en gruppe af hus holde gener (Fig. S3A), to tredjedele af de gener (dvs. 28,872 sonder ud af 43.925) blev fundet at blive udtrykt over baggrundsniveauer i HCT116 celler (Fig. S3B). Derimod blev 90% af de ATF3 mål udtrykt over baggrundsniveauer, hvilket tyder på, at ATF3 fortrinsvis forbinder med aktivt transskriberede gener. På globalt plan, sammenligning af signaler (log

2-forhold) mellem kontrol og Knockdown celler viste en begrænset effekt af ATF3 nedregulering på transkriptom (fig. S3B og S3C).

(A) HCT116 celler blev transficeret med enten siRNA for ATF3 (siATF3) eller krypteret siRNA (siControl) og behandlet med MMS til 0, 3, og 6 timer. Mængde ATF3 proteiner blev analyseret ved Western blot med β-actin som et loading kontrol. MMS inducerer ATF3 ved 3 og 6 timer efter stimulering, hvilket er væsentligt blokeret af siATF3. (B) Heat kort repræsentation af genekspression niveauer på 0, 6, 12, og 24 timer efter MMS stimulation for kendte mål for ATF3 (øverste panel) eller transkriptionsfaktorer som bindende motiver er overrepræsenteret i ATF3 mål (nederste panel). Signaler normaliseres mod dem på tidspunkt 0 af siControl og relative niveauer eller forholdet mellem siATF3 /siControl er farvekodede fra 2

-2,5 til 2

2.5.

Yderligere analyse af chip -identified mål for ATF3 indikerede, at ekspression af 6-30% gener blev påvirket af ATF3 knockdown under 0,8 gange eller over 1,2 gange på forskellige tidspunkter efter MMS stimulation. For at identificere biologiske processer, der reguleres af ATF3 blev pathway kortlægning udføres ved hjælp af DAVID [35] for en delmængde af ATF3 mål enten ned- eller op-reguleret af ATF3 knockdown (modificeret Fishers eksakte test

s

-værdi 0,1). Som opsummeret i tabel 2, blev stressinduceret ATF3 forbundet med diverse cellulære processer, såsom metaboliske veje (sukkerarter, aminosyrer, lipid), anabolske og katabolske processer (steroid og folat biosyntese, ubiquitilation, urinstofcyklus), energiproduktion (TCA cyklus , oxidativ fosforylering), cellecyklus, apoptose, vedhæftning, cytoskelettet og signalveje (ErbB, p53, insulin, Wnt, VEGF).

Næste, for at identificere potentielle mål for ATF3 i cancer-associeret ATF3, vi udført ATF3 knockdown og udtryk profilering ved hjælp LNCaP celler (fig. S4). Pathway mapping analyse af gen delmængder enten nedreguleret ( 0,8-fold) eller opreguleret ( 1,2 gange) ved knockdown af ATF3 er sammenfattet i tabel 3. udtrykkes konstitutivt ATF3 i LNCaP-celler syntes at være involveret i den biologiske processer snarere end dem, der i stressreaktioner, herunder celleadhæsion, diabetes mellitus, og signalering (ErbB, p53, Wnt, calcium) med lidt association med metaboliske processer. Taget sammen indikerer disse data, at metaboliske veje, cellecyklus, apoptose, og insulin og VEGF-signalering er unikke mål for stressinduceret ATF3, hvorimod diabetes mellitus og calcium signalering, men ikke cellecyklus og apoptose, er unikke mål for ATF3 udtrykt i cancerceller. Den mulige sammenhæng mellem ATF3 og diabetes vej som findes i vores undersøgelse er i overensstemmelse med en nylig undersøgelse viser, at ATF3 aktiveres i fede fedtceller bidrager til insulinresistens gennem nedregulering af adiponectin og en glukose transportør GLUT4 [36].

DNA-skader-induceret ATF3 aktiverer en delmængde af pro-apoptotiske gener fra p53 pathway

Identifikation af p53 vej som et potentielt mål for ATF3 bedt os at analysere reguleringen af ​​p53 målgener ved ATF3 . Først vi analyseret, hvor mange af tidligere kendte p53 mål [6] er også mål for ATF3 i vores chip assay. Vi fandt, at stress-induceret ATF3 blev rekrutteret til så mange som 40% (dvs. 97/244) af p53 mål, hvilket indebærer for første gang, at en stor del af p53 mål kan være transkriptionelt samarbejde reguleret af ATF3. Dernæst vurderede vi virkningen af ​​ATF3 knockdown på ekspressionen af ​​de fælles mål for ATF3 og p53 på forskellige tidspunkter efter stimulering af HCT116 celler via MMS. Som illustreret ved varme kortet i fig. 4A (forholdet mellem signaler i siControl og siATF3), de fleste af dem er lidt nedreguleret ved ATF3 knockdown herunder pro-apoptotiske gener såsom BBC3 /PUMA, TNFRSF10A /DR4 og TNFRSF10B /DR5.

(A) zonekort repræsentation af genekspressionsniveauer ved 0, 6, 12, og 24 timer efter MMS stimulation for fælles mål for ATF3 og p53. Signaler normaliseres mod dem på tidspunkt 0 af siControl og relative niveauer eller forholdet mellem siATF3 /siControl er farvekodede fra 2

-2,5 til 2

2.5. Gener er grupperet efter ekspressionsmønstre efter MMS stimulation: a, stærkt aktiveret; b, stærkt undertrykt, c, svagt aktiveret; d, blandet; e, svagt undertrykt. De fleste gener er svagt nedreguleret ved ATF3 knockdown, mens DNMT1 er en undtagelse, der er op-reguleret af ATF3 knockdown. (B) Kvantitativ RT-PCR-analyse af ATF3 og pro-apoptotiske mål af p53. Ekspressionsniveauer i siATF3-transficerede celler (hashed søjler) er angivet i forhold til dem i kontrol (åbne søjler). (C) Fasekontrastmikrografi af HCT116 celler efter behandling med 50 ng /ml MMS i 12 timer i nærværelse af siControl eller siATF3. (D) Antal levende HCT116 celler efter behandling med 50 ng /ml MMS i 0, 8, 12 og 24 timer i nærvær af siControl (åbne cirkler) eller siATF3 (lukkede cirkler). (E) Aktivering af caspase 3 som målt ved dets spaltede produkter. HCT116 celler blev transficeret med siControl eller siATF3 og behandles med 50 ng /ml MMS til 0, 3, 6 og 12 timer. Hele celleekstrakter blev udsat for Western blot-analyse ved hjælp af antistoffer mod ATF3, β-actin, caspase 3, og kløvet caspase 3. Arrowhead indikerer spaltet caspase 3 i den forudsagte molekylvægt.

For yderligere at vurdere funktion af ATF3 i p53 target genekspression, vi udført kvantitativ RT-PCR-analyse af pro-apoptotiske gener i MMS-stimulerede celler præ-transficeret med enten kontrol siRNA eller siATF3. Som vist i fig. 4B, ATF3 knockdown forårsagede betydeligt reduceret induktion af TNFRSF10A /DR4, TNFRSF10B /DR5, og BBC3 /PUMA via MMS behandling. Næste vi analyserede effekter af ektopisk udtrykte ATF3 på p53 målgener bruger luciferase journalister huser proksimale initiativtagere med en ATF /CRE motiv som vist i fig. 5A. Co-transfektion af HCT116 celler med luciferase- reportere og ATF3 ekspressionsvektorer resulterede i signifikant aktivering af TNFRSF10B /DR5, GADD45A, BBC3 /PUMA, og DDIT4 (fig. 5B), i overensstemmelse med microarray data, der viser, at ATF3 knockdown forårsagede svækket ekspression af disse gener (fig. 4A). Derimod vimentin genet, som blev undertrykt af MMS behandling (fig. 4A), blev ikke signifikant aktiveret ved ektopisk ekspression af ATF3 (fig. 5B).

(A) DR5-luciferase-reporterkonstruktion der indeholder en DR5 promotorfragment fra -1226 (PstI-sted) til +1 (AUG kodon), som blev subklonet ind PicaGene PGV-B2. ATF /CRE motiver (ATF) og p53 motiv (p53) er vist. (B) Dual luciferase reporter assays for TNFRSF10B /DR5, GADD45A, BBC3 /PUMA, DDIT4, og VIM. HCT116-celler blev transficeret med hver reporter og stimuleret med 50 ng /ml MMS i 12 timer. Ildflueluciferase aktivitet blev normaliseret ved CMV-Renilla luciferaseaktivitet. (C) Dual luciferase under anvendelse vildtype eller ATF3

– /-. Mus embryonale fibroblaster (MEF)

For at belyse funktionen af ​​ATF3

in vivo

, tog vi fordel af ATF3-mangel mus nylig etableret i vores laboratorium ([37]). Mus embryonale fibroblaster blev transficeret med DR5-luciferase journalister og stimuleret med MMS. Interessant, tab af ATF3 forårsagede signifikant reducerede niveauer af basal DR5 promotoraktivitet som vist i fig. 5C, hvilket antyder, at basal DR5 ekspression var afhængig af ATF3. Desuden blev MMS-induceret aktivering af DR5 promotor cirka halveret i ATF3

– /- celler sammenlignet med vildtype celler, hvilket indebærer, at DNA-skader-induceret aktivering af DR5 var delvis afhængig ATF3. Tilsammen disse underskudsgivende og få af funktion undersøgelser viser, at ATF3 aktiverer udvalgte mål for p53.

DNA-skader-induceret ATF3 sensibiliserer celler til celledød

For at vurdere biologiske betydning af cross -talk mellem ATF3 og p53, vi næste analyseret effekten af ​​ATF3 knockdown på celleviabilitet efter stimulering af MMS. Som afbildet i fig. 4C og 4D, der var et større antal HCT116 celler transficeret med siATF3 end dem transficeret med kontrol siRNA efter MMS behandling. En sådan forskel i celle nummer kunne afspejle enten øget cellevækst eller nedsat celledød. For at løse dette problem, vi analyserede aktivering af caspase 3, et kendetegn for apoptotisk celledød, ved Western blot. Som afbildet i fig. 4E, knockdown af ATF3 forårsagede reduktion i aktivering af caspase 3 som bedømt ved fremstilling af spaltede caspase 3. Disse data er i overensstemmelse med ATF3-medieret aktivering af pro-apoptotiske gener (fig. 4B, fig. 5), og antyder kraftigt, at DNA beskadigelse-induceret ATF3 bidrager til stress-induceret celledød ved co-aktivering af en delmængde af p53 målgener.

cancerassocierede ATF3 fremmer celleproliferation og inhiberer apoptose

Interessant knockdown af ATF3 i LNCaP-celler forårsaget stigning i p21-proteiner (fig. 6A) samtidig med reduktion af cellevækst (fig. 6B). Disse resultater stemmer overens med tidligere rapporter antyder en rolle ATF3 i celleproliferation i cancer [20], [22], [38] og c-myc-induceret cellevækst [19]. Desuden har aktuel analyse af ATF3-regulerede veje i LNCaP-celler (tabel 3B) viste, at så mange som 13 gener i p53 pathway kan aktiveres ved ATF3. For at vurdere effekten af ​​ATF3 på p53-medieret celledød, vi udført kvantitativ RT-PCR-analyse af pro-apoptotiske gener i p53 pathway. Som illustreret i fig. 6C, ATF3 knockdown forårsaget opregulering af FAS, TNFRSF10B /DR5, BBC3 /PUMA, og CASP10 samt CDKN1A /p21, hvilket antyder, at ATF3 negativt regulerer p53-induceret celledød og forbedrer celleproliferation ved inhibering af p21-ekspression.

(a) Western blot-analyse af ATF3 og p21 i LNCaP-celler transficeret med siControl eller siATF3 med β-actin som et loading kontrol. (B) Antal levedygtige celler ved 0, 3, og 5 dage efter transfektion med siControl (åbne cirkler) eller siATF3 (lukkede cirkler). (C) Kvantitativ RT-PCR-analyse af pro-apoptotiske gener i p53 pathway og p21 efter transfektion. Niveauer af udtryk i siATF3 (hashed søjler) i forhold til dem i siControl (åbne søjler) er angivet.

Diskussion

Vi viste, at DNA-skader-induceret ATF3 binder sig til næsten en tredjedel af de humane RefSeq promotorer. Identifikation af et så stort antal af mål er ikke enestående, da E2F1 og MYC er kendt for at blive ansat til 20.000 og 17.000 mål, henholdsvis i det menneskelige genom [39], og gær INO4 er blevet rapporteret til at binde til 1.078 mål upon MMS stimulation [5]. Antallet af mål for cancer-associeret ATF3 var mindre end for DNA-skader-induceret ATF3, hvilket måske afspejler både højere niveauer og større fold-induktion af ATF3 i MMS respons end dem, der opnås ved knockdown af ATF3 i LNCaP-celler (data ikke vist) . Alligevel assayet var bemærkelsesværdigt konstant siden 89% af mål i LNCaP-celler også blev fundet i MMS-behandlede HCT116 celler, og elleve af 41 tidligere kendte ATF3 mål, herunder EGR1 [40] og HIF-2A [30] kan identificeres. En undersøgelse af ATF3 chip-seq data fra KODE databasen (https://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/encodeDCC/wgEncodeHaibTfbs/) viser også, at en betydelig procentdel af mål ATF3, dvs. 37,6% (768/2041 ) i K562 (leukæmi), 71,9% (742/1032) i HepG2 (lever), og 76,2% (809/1062) i H1-embryonale (embryonale stamceller), deles med 2711-målene i GM12878 (lymfoblastoid), som kan betragtes som konservative tal variationer af chip-seq datakvalitet (som påvirker følsomheden af ​​top påvisning) og forskel i vævstyper.

Især bindinger steder af flere andre transkriptionsfaktorer fremkaldt af DNA-skader (NF Y, E2F, YY1 /NF-E1, FOXJ2, Sp1), UV-bestråling (USF2, RFX1), og oxidativ stress (c-Ets) var signifikant overrepræsenteret i ATF3 mål (tabel 1), hvilket indikerer et omfattende netværk af disse stress respons faktorer (fig. S6). En mulig forklaring på denne sammenfald af stressrelaterede transskriptionsfaktorer er, at ATF3 kan virke synergistisk med disse transkriptionsfaktorer til at modulere mål-genekspression. Alternativt kan ATF3 targets identificeret af Chip analysen indeholde indirekte binding af ATF3 gennem interaktion med andre stress-induceret transkriptionsfaktorer. Faktisk ATF3 er medlem af en stor familie af bzip typen transkriptionsfaktorer, herunder dem, der i den nuværende undersøgelse (dvs. AP-1, DDIT3, og USF2), der danner homo- og hetero-dimerer med forskellige affiniteter til varianter af konsensus ATF /CRE motiv [32]. Desuden Sp1 findes i den aktuelle analyse er kendt for fysisk interagerer med ATF3 [33], [34]. Yderligere undersøgelser vil være nødvendigt at foretage den rolle, stress-inducerbare transkriptionsfaktorer, især dem, der ikke vides at interagere med ATF3 før, i binding af ATF3 at målrette gener.

Den nuværende undersøgelse viser, at virkningen af ATF3 på hvert mål genekspression er ikke alt eller ingen effekt. Snarere, effekter af ATF3 på mange, men vælg gener, såsom dem involveret i cellecyklus og celledød, kollektivt udgjorde biologisk signifikant resultat som celledød for ATF3 i stress respons (fig. 4C-E) eller celle vækst for cancer-associeret ATF3 (fig. 6B). Desuden er vores knockdown undersøgelse viser, at kun 6-30% af de potentielle mål for ATF3 blev reguleret direkte af ATF3 i overensstemmelse med tidligere rapporter, der viser, at kun 25% af p53 mål [6], 26% af STAT1 mål [41], og 11% af gær transcriptionsfaktor mål påvirkes af gen knockdown [5]. er blevet foreslået adskillige mekanismer til p53 at forklare, hvorfor kun en delmængde af potentielle mål reagerer på manipulationer af p53, herunder epigenetiske tilstande af målgener, promotor belægningsprocent med RNA-polymeraser, og rekruttering af essentielle co-faktorer [42]. Lignende mekanismer kan være ansvarlig for gen-selektive effekter af ATF3. Alternativt, flere former for ATF3 komplekser, såsom hetero-dimerer med forskellige bzip proteiner, kan ligge til grund differentielle effekter af ATF3 på målgener.

I de sidste mange år, et stigende antal undersøgelser har indikeret, at ATF3 har pleiotrope funktioner afhængigt af celle kontekst. Vigtigere er det, vores undersøgelse viste, at stress-induceret ATF3 og kræft-associerede ATF3 har modsatrettede effekter på p53 og Wnt veje: p53 pathway aktiveres i stressrespons (. Fig S5) i overensstemmelse med funktionen af ​​ATF3 i p53-medieret celledød [6 ], [23] – [25], mens Wnt pathway aktiveres i kræft som tidligere rapporteret i en undersøgelse om ATF3 transgene mus udvikler brysttumorer [43]. Man kunne argumentere for, at forskellen i genetiske baggrunde og /eller vævstyper mellem HCT116 celler og LNCaP celler kunne have påvirket funktion ATF3. Faktisk ATF3 synes at spille forskellige roller i forskellige væv: ATF3 virker som en tumorsuppressor i colorektal cancer [24], [44], mens det er oncogen i prostatacancer [20], brystcancer [21], hudkræft [29] og Hodgkins lymfom [22]. Vores resultater i HCT116 celler (kolon) og LNCaP-celler (prostata) er i overensstemmelse med en sådan hypotese.

Ændringer af den regulerende funktion ATF3 fremhæves af vores fund, at ATF3 er nødvendig for både aktivering og undertrykkelse af pro -apoptotic gener såsom BBC3 /PUMA og TNFRSF10B /DR5 i stress respons og kræft. Notatet har modsatrettede effekter af ATF3 på cyklin D1 udtryk tidligere dokumenteret: ATF3 binder til AP-1 motiv og aktiverer cyklin D1 i mitogenstimulerede mus hepatomceller [45], mens det binder til ATF /CRE websted og undertrykker cyclin D1 i musefibroblaster stimuleret med serum [46]. I litteraturen er der rigelig fortilfælde af transkriptionsfaktorer, som har kontekstafhængige modsatrettede funktioner på udvikling af kræft ([47] og reference deri). KLF4 eksempelvis aktiverer p21 og undertrykker p53 begge er undertrykt af aktiverede Ras resulterer i vækststandsning i fravær af Ras eller transformerende fænotype i nærvær af Ras. Alternativt har en nylig undersøgelse vist, at Kruppel-lignende faktor 5 (KLF5) er påkrævet for MYC transskription i prolifererende epitelceller, men er afgørende for TGFb-medieret repression af MYC [48]. Differentiel binding af KLF5 til TGFp inhiberende element i nærvær eller fravær af TGFp blev foreslået som en mekanisme af de modsatte virkninger. Yderligere undersøgelser vil være forpligtet til at afgøre, om kombinationer af ATF3 og andre transkriptionsfaktorer kan skifte funktion ATF3 på specifikke mål.

Modstand af tumorceller til forskellige stress-betingelser er fortsat et vigtigt spørgsmål. Men vores viden om den rolle, cellulære stress respons machineries i kræft modstand mod hypoxi [49] eller kemoterapeutiske stoffer [50] er stadig begrænset. Vores konklusion om, at ATF3 har modsatrettede effekter på pro-apoptotiske gener tyder på, at man skal være opmærksom på enten styrke eller blokere funktionen af ​​ATF3 i en ny tilgang til kræftbehandling. Yderligere forståelse af skifte mekanisme ATF3 funktion som en transkriptionel aktivator eller repressor kan hjælpe med at udvikle strategier til selektivt at manipulere en delmængde af ATF3 målgener at hjælpe behandlingen af ​​kemoterapi-resistent kræftformer.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Alt animalsk arbejde blev godkendt og gennemført i overensstemmelse med retningslinjerne for udvalg i dyreforsøg og rekombinant DNA Forsøg af Tokyo Medical og Dental University (License No. 2010-205).

Plasmider

Luciferase reportere til DR5 [51], GADD45A [52], PUMA [53], og vimentin [54] var venlige gaver fra Dr. Toshiyuki Sakai (Kyoto Prefectural University, Japan), Dr. Kazuhiro Daino (Statens Institut for radiologiske videnskaber, Japan), Dr. Jian Yu (The Johns Hopkins Oncology center, USA), og Dr. Susan Rittling (The Forsyth Institute, USA), hhv. Den DR5 luciferase reporter blev rekonstrueret ved subkloning en DR promotor fragment fra Pst (-1226) til AUG codon i PicaGene PGV-B2 vektor (Toyo B-Net Co., Ltd, Japan). PCI-ATF3 ekspressionsvektor er tidligere beskrevet [55].

Cellekultur

Humane colorektale carcinom HCT116 celler og prostatacarcinom LNCaP-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (USA). Otteogfyrre timer før stimulering med MMS, blev dyrkningsmediet fra HCT116 celler erstattet med medium indeholdende 0,25% FCS. Fireogtyve timer senere blev HCT116-celler transficeret med enten kontrol siRNA eller siATF3 ved hjælp af X-tremeGENE siRNA transfektionsreagens. ON-TARGETplus siRNA SMART pulje fra Dharmacon blev brugt til knockdown af ATF3.