PLoS ONE: Apoptose inducerende effekt af plumbagin på coloncancer celler afhænger af ekspression af COX-2

Abstrakte

plumbagin, en quinonoid findes i planter af blyrod-familien, har medicinske egenskaber. I dette studie undersøgte vi den antiproliferativ og apoptotiske aktivitet af plumbagin ved anvendelse af to humane colon cancer cellelinjer, HT29 og HCT15. IC50 på plumbagin for HCT15 og HT29-celler (22,5 uM og 62,5 uM henholdsvis) var signifikant forskellige. For at undersøge reaktionen af ​​cancerceller under behandlingsstrategier blev celler behandlet med to forskellige koncentrationer, 15 uM, 30 uM for HCT15 og 50 pM, 75 pM for HT29-celler. Selvom aktivering af NFKB, Caspaser-3, forhøjede niveauer af

TNF-α

, cytosolisk cytochrom C blev set i både HCT15 celler HT29 behandlet med plumbagin, afvigende apoptose med nedsat niveau af pEGFR, Pakt, pGsk-3β, PCNA og cyclin D1was kun observeret i 15 uM og 30 uM plumbagin behandlet HCT15 og 75 uM plumbagin behandlede HT29-celler. Dette antyder, at plumbagin inducerer apoptose i både HCT15-celler og HT29 behandlet, hvorimod proliferation blev inhiberet kun i 15 uM og 30 uM plumbagin behandlede HCT15 og 75 uM plumbagin behandlede HT29-celler, men ikke i 50 uM plumbagin behandlede HT29-celler. Ekspression af COX-2 blev reduceret i 75 pM plumbagin behandlede HT29-celler i sammenligning med 50 pM plumbagin behandlede HT29-celler, hvorimod HCT15 celler mangler COX. Deraf observerede resistens over for induktion af apoptose i 50 pM plumbagin behandlede HT29-celler tilskrives ekspressionen af ​​COX-2. Afslutningsvis plumbagin inducerer apoptose i colon cancerceller gennem TNF-α medieret vej afhængig ekspression af COX-2-ekspression

Henvisning:. Subramaniya BR, Srinivasan G, Mohammed Sadullah SS, Davis N, Baddi Reddi Subhadara L , Halagowder D, et al. (2011) Apoptosis inducerende effekt af plumbagin på coloncancer celler afhænger af ekspression af COX-2. PLoS ONE 6 (4): e18695. doi: 10,1371 /journal.pone.0018695

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: 17. december, 2010; Accepteret: 9 Marts 2011; Udgivet: 29 April, 2011

Copyright: © 2011 Subaramaniya et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra National Lægeplanter Board, Indiens regering, til Dr. S. Niranjali Devaraj. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en primær bekymring for folkesundheden til menneskeheden og er den tredje mest almindelige kræftform i USA [1]. De seneste data om kolorektal cancer er alarmerende med en anslået 153,760 tilfælde af CRC herunder 52,180 dødsfald i 2007 [1], [2]. Progression fra normale colon-epitelceller i et colorektalt carcinom er en flertrinsproces. Selvom der mange faktorer såsom tab eller mutation i tumorsuppressorgener, epigenetiske ændringer styrer celleoverlevelse, celleproliferation og angiogenese, inflammation spiller en afgørende rolle i CRC udvikling og progression [3] – [8].

NF-KB er en vigtig inflammatorisk mediator involveret i initiering, progression og metastase af CRC [9]. En række kræftfremkaldende stoffer og tumorpromotorer er blevet vist at aktivere NF-KB og konstitutiv ekspression af NF-KB findes hyppigt i tumorceller. Adskillige gener involveret i tumor initiering, promotion, og metastase reguleres af NF-KB samt aktivering af NF-KB undertrykker apoptose og fremmer spredning. Derfor midler, der kan nedregulere aktiveringen af ​​NF-KB ville derfor have potentiale til at hæmme udviklingen af ​​cancer.

plumbagin (5-hydroxy-2-methyl-1,4-naphthoquinon), en quinonoid, findes i planter af blyrod-familien, Droseraceae, Ancestrocladaceae, og Dioncophyllaceae familier. Chief kilde plumbagin er roden til

Plumbago zeylanica

L. (også kendt som “Chitrak”). Plumbagin er blevet vist at udøve antikarcinogene, anti-aterosklerotiske og antimikrobielle virkninger [10] – [13]. Roden af ​​

P. zeylanica

L. har været brugt i indisk medicin i ~2,750 år, og dens komponent besidder antiatherogenic, cardiotonisk, leverbeskyttende og neurobeskyttende egenskaber [11].

Sugie et al. [14] har vist, at plumbagin signifikant inhiberede azoxymethan-induceret intestinal carcinogenese hos rotter, tyder kemoforebyggende aktivitet. Plumbagin har også vist sig at inducere S-G2 /M cellecyklusstandsning gennem induktionen af ​​p21 (en inhibitor af cyclin-afhængig kinase) [15]. Nylige undersøgelser viste, at plumbagin inducerer apoptose gennem hæmning af NF-KB i forskellige cancercellelinier, herunder menneskers kronisk myeloid leukæmi, humant multipelt myelom, humane embryonale nyre carcinom og Brystcancerceller [16], [17]. I denne undersøgelse undersøgte vi anti-proliferative og apoptotiske aktivitet af plumbagin af

in vitro

forsøgsmodeller bruger to humane colon cancer cellelinjer, HT29 og HCT15. Endvidere blev den mekanisme for anticancer aktivitet af plumbagin oprettet ved at analysere cellecyklus regulering og signalmolekyler relateret til celle overlevelse og apoptose.

Materialer og metoder

Cell kultur og vedligeholdelse

human colon tumorcellelinier HT29 og HCT15 blev opnået fra NCC’erne Pune. Celler blev dyrket i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM, GIBCO BRL, Tyskland) suppleret med 10% FBS (Sigma, USA), 100 enheder /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 10-20 pg /ml fungisone (Himedia, Indien ), pH 7,4 i 25 cm

2, vævskulturkolber (Himedia, Indien) ved 37 ° C under 5% CO

2 og 95% luft.

Behandling

plumbagin blev indkøbt fra Sigma. En 100 mM opløsning af plumbagin blev fremstillet i dimethylsulfoxid (DMSO), lagret som små alikvoter ved -20 ° C og derefter fortyndet efter behov i celledyrkningsmedium. Dosis-respons-undersøgelser blev udført for at bestemme den passende dosis til inhibering af cellevækst og induktion af apoptose.

MTT assay

Følsomhed af HT29 og HCT15 celler til plumbagin blev bestemt ved MTT kolorimetrisk assay [18]. Celler (1 x 10

3 pr brønd) blev podet i en fladbundet plade med 96 brønde og inkuberet i 24 timer ved 37 ° C og i 5% CO2. Begge cellelinier blev udsat for plumbagin (1, 2,5 og 5 uM i 24 timer). Opløsningsmidlet DMSO behandlede celler tjente som kontrol. Celler blev derefter behandlet med MTT-reagens (10 pl /brønd) i 4 timer ved 37 ° C og derefter isopropanol (100 pi) blev tilsat til hver brønd for at opløse formazan-krystallerne. Den optiske densitet (OD) blev registreret ved 570 nm i en mikropladelæser. Procent af resterende cellelevedygtighed blev bestemt som [1- (OD af behandlede celler /OD af kontrol celler)] × 100.

Effekt af plumbagin på PBMC

PBMC blev isoleret fra hepariniseret venøst ​​blod opnået fra en rask frivillig forsøgsperson ved Ficoll-Paque (Histopaque 1077, Sigma-Aldrich Inc., USA) densitetsgradientcentrifugering som pr standard procedure [19]. PBMC (1 × 105 celler /brønd) blev dyrket i komplette RPMI-1640-medier som sædvanligt og inkuberet med plumbagin i 48 timer efterfulgt af MTT-assayet.

Cellecyklusanalyse under anvendelse af flowcytometri

Både HT29 og HCT15-celler blev podet i en 6-brønds plade ved en tæthed på 1 x 10

5 celler pr. Cellerne blev trypsiniseret og høstet ved centrifugering ved 1700

g

. Flowcytometrisk analyse af cellecyklus blev udført ved farvning af permeabiliserede celler med propidiumiodid (PI) for DNA-indhold. Cellerne blev resuspenderet i PBS, fikseret med 70% ethanol, farvet med PI-opløsning (0,05 mg /ml PI, 2 mg /ml RNase A, 0,1% TritonX-100 i PBS) og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur (RT) i mørke. Fluorescensintensitet blev målt ved flowcytometri (Becton-Dickinso) under anvendelse excitations- og emissions- bølgelængder på 488 og 525 nm. Alle eksperimenter blev udført i triplikater.

Comet assay

comet assay blev udført ifølge fremgangsmåden ifølge Singh et al. (1988) [20] med mindre modifikationer. HT29 og HCT15-celler (5 x 10

5) blev podet i plader med 24 brønde og udsat for de ønskede koncentrationer af plumbagin (slutkoncentrationen af ​​DMSO oversteg ikke 0,1%, blev kontroller samtidigt behandlet med 0,1% DMSO) til specificerede tidsrum. Efter behandling blev celler pelleteret ved centrifugering ved 1500 rpm. Pelleten blev resuspenderet i 60 pi PBS (pH 7,4). 10 pi af cellesuspensionen blev blandet med 100 pi 1% lavtsmeltende agarose og 75 pi af denne celle-agarose blanding blev spredt på mikroskopiske objektglas belagt med 1% agarose. Et tredje lag af 0,5% lavtsmeltende agarose (75 pi) blev påført over laget af agarose med cellesuspensionen. Objektglas blev inkuberet i 1 time i en lysis-opløsning (2,5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100, 1% SDS, pH 10). Efterfølgende celler blev udsat for en alkalisk buffer (300 mM NaOH, 1 mM dinatrium-EDTA) i 30 min. De mikroskopiske objektglas blev underkastet elektroforese ved 0,8 V /cm-1 i 30 minutter, hvorefter Objektglas blev neddykket i en neutraliseringsbuffer (0,4 M Tris, pH 7,5) i 15 min. Efter farvning med ethidiumbromid (20 ug /ml) Objektglassene blev analyseret under et fluorescensmikroskop (Nikon PCM-2000). Billeder af mindst 50 celler fra tre objektglas blev analyseret under anvendelse Cometscore ™ software. For hver komet to områder blev udvalgt: hele cellulært DNA og et område, der kun indeholder hovedområdet af komet. I hver selektion blev densiteter målt, og resultaterne blev præsenteret som hale øjeblik defineret som resultatet af den procentdel af DNA i halen multipliceret med halen længde.

Isolering af RNA

Til fremstilling totalt RNA, phenolen – blev guanidiniumthiocyanat baseret Tri Reagent (Genei ™, Bangalore), der anvendes. Til 10

7 celler, 1 ml Tri-reagens blev tilsat, og lyseret ved gentagne pipettering og fik lov til at henstå i 5 minutter efterfulgt af tilsætning af 200 pi chloroform for faseseparation .Vigorously vortexet i 15 sekunder og fik lov at henstå i 15 minutter efterfulgt af centrifugering ved 12000 g i 15 minutter ved 4 ° C. Den øvre vandige fase indeholdende RNA blev overført til et frisk sterilt DEPC behandlet mikrofugerør. Til dette blev 500 pi iskold isopropanol tilsat, forsigtigt blandet og fik lov at henstå i 10 minutter og centrifugeret ved 12000 g i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev kasseret, og RNA pellet blev vasket med 1 ml 75% ethanol i DEPC behandlet vand og igen centrifugeret ved 14000 g i 10 minutter ved 4 ° C for at få totalt RNA. Denne pellet blev opløst i 25 pi sterilt RNase-frit vand ved opvarmning ved 55 ° C i 20 minutter og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse.

Reverse transcriptase polymerase kædereaktion (RT-PCR)

for at syntetisere cDNA, en revers transkriptionsreaktion opløsning indeholdende 1,0 ug totalt RNA i RNase /DNase-frit vand og 1,5 pi tilfældig hexamer-primer (GeNeiTM, Bangalore) blev inkuberet i 10 minutter ved 72 ° C og afkølet straks. Til dette, 5,0 pi forblandet 10 mM dNTP-opløsning (GeNeiTM, Bangalore), 3,0 pi 10 × M-MLV revers transkriptase buffer (GeNeiTM, Bangalore), 1,0 pi (200 enheder /pl) M-MLV revers transkriptase (GeNeiTM, Bangalore) blev tilsat, og fyldt op til 50 pi anvendelse af sterilt RNase /DNase-frit vand.

for at amplificere cDNA’et, polymerasekædereaktion (PCR) klar blanding (GeNeiTM, Bangalore) blev anvendt ifølge producentens anvisninger. Alle PCR-prøver blev denatureret ved 94 ° C i 5 minutter forud for cykling og blev forlænget i 10 minutter ved 72 ° C efter cykling. PCR-assay under anvendelse af primere blev udført i 39 cyklusser ved 94 ° C i 60 s, 60 ° C i 60 s og 72 ° C i 60 s. Primere til GAPDH, COX-2, er TNF-α vist i tabel 1. Primere blev konstrueret under anvendelse primer3 software tilgængelig gratis på https://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm og nucleinsyresekvens blev åbnet fra https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fci?val=Reference ID Table. Primerne blev indkøbt fra Integrated DNA-teknologier, USA. Endvidere ekspressionen af ​​COX-2 og TNF-α blev analyseret semi kvantitativt ved hjælp af FN SCAN it-software.

Isolering af protein

Til 0,5 ml phenol-ethanol supernatant, 3 volumener acetone blev tilsat for at udfælde proteiner. Prøverne blev blandet ved inversion i 10-15 sek til opnåelse af en homogen opløsning og fik lov at henstå i 10 minutter ved stuetemperatur. Protein blev præcipiteret ved centrifugering ved 12.000 g i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev fjernet og pelleten dispergeret i 0,5 ml 0,3 M guanidinhydrochlorid i 95% ethanol med 2,5% glycerol (V:V). Efter dispergering pelleten blev en anden 0,5 ml prøve af guanidinhydrochlorid /ethanol /glycerol vaskeopløsning til prøven og opbevaret i 10 minutter ved stuetemperatur. Protein blev pelleteret ved 8.000 g i 5 minutter ved 4 ° C. Vaskeopløsningen blev fjernet, og yderligere to vaske blev udført i 1 ml hver af guanidin /ethanol /glycerol vaskeopløsning. Afsluttende vask blev udført med 1 ml ethanol indeholdende 2,5% glycerol (V:V). Protein blev pelleteret ved centrifugering ved 8000 g i 10 minutter ved 4 ° C og lufttørret i 5 min. Efter kortvarigt lufttørring blev proteinet pelletten opløst i 1% SDS. Proteinkoncentrationer af cellelysater blev estimeret ifølge Lowry et al., 1951 [21] og lige koncentrationer af proteinfraktion blev kørt på natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og immunobloted med specifikke antistoffer.

siRNA transfektion

COX-2-genet blev stille ved transfektion COX-2 siRNA. I en seks brønds vævskulturplade, 2 × 10

5 celler per brønd blev podet i 2 ml antibiotikum-frit normalt vækstmedium suppleret med FBS. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i en CO

2 inkubator indtil cellerne var 60-80% sammenflydende. Cellernes levedygtighed blev vurderet før transfektion. De følgende opløsninger blev fremstillet: Opløsning A: For hver transfektion, fortyndet 6 ul siRNA duplex (dvs. 0,25-1 pg eller 20-80 pmol siRNA) i 100 pi siRNA Transfektion Medium (Santa Cruz, USA). Opløsning B: For hver transfektion fortyndet 6 pi siRNA transfektionsreagens (Santa Cruz, USA) i 100 pi siRNA Transfektion Medium. siRNA duplex opløsning (opløsning A) blev blandet med fortyndet transfektionsreagens (opløsning B) og inkuber blandingen i 45 minutter ved stuetemperatur. For hver transfektion blev 0,8 ml siRNA Transfektion Medium tilsat til hvert rør indeholdende siRNA transfektionsreagens blanding (opløsning A + Opløsning B), blandet forsigtigt, lægges over vaskede celler og inkuberet i 5-7 timer ved 37 ° C i en CO

2 incubator. Efter inkubation blev 1 ml normalt vækstmedium indeholdende 2 gange den normale serum og koncentration antibiotika (2 × normalt vækstmedium) tilsat uden at fjerne transfektionsblandingen. Celler blev inkuberet i yderligere 18-24 timer. Medium blev erstattet med 1 ml frisk 1 × normalt vækstmedium og anvendes til yderligere analyse.

Statistisk analyse

Værdier blev registreret som middelværdien x ± SD af tre eksperimenter. Forsøgsresultater blev analyseret ved t-test. P 0,00 blev betragtet som niveauet af meget betydning og P. 0,05 blev betragtet som betydning for værdier opnået for behandlede grupper sammenlignet med kontrolgruppen

Resultater

plumbagin inducerer cytotoksicitet i HCT15 og HT29 tyktarmskræft celler

Anvender HCT15 og HT29 tyktarmskræft cellelinjer, vi først evaluerede effekten af ​​cytotoksicitet plumbagin af MTT assay. Udover afvigende Wnt signalering i begge cellelinier, er HT29-celler vides at udtrykke COX2, hvorimod HCT15 celler mangler COX2 ekspression. Begge cellelinier var følsomme over for plumbagin, hvilket indikerer, at plumbagin kunne inducere cytotoksicitet af både coloncancerceller uanset COX2 status (fig. 1a og 1b). Men HCT15-celler var mere følsomme over for plumbagin som IC

50 ved 24 timer var 22,5 uM, hvilket er væsentligt lavere end den for IC

50 af plumbagin behandlede HT29, hvilket er 62,5 uM. Kun ikke-væsentlige ændringer i levedygtighed PBMC’er (normale celler) blev observeret selv in100 uM plumbagin inkuberes celler (Fig. 1c)

et. Cytotoksicitet effekt af forskellige koncentrationer af plumbagin på HCT15 celler

. Dosis cytotoksicitet effekter af plumbagin på HCT15 celler var repræsenteret i ovenstående graf. HCT15-celler var mere følsomme over for plumbagin som IC

50 ved 24 timer var 22,5 uM. Alle forsøgene blev udført i tre eksemplarer og udtrykkes som gennemsnit ± SD. Signifikans er angivet som *

s 0,001

.

b. Cytotoksicitet virkningen af ​​forskellige koncentrationer af plumbagin på HT29-celler Salg. Dosis cytotoksicitet virkninger af plumbagin på HT29-celler var repræsenteret i ovenstående graf. HT29-celler var mere følsomme over for plumbagin som IC

50 ved 24 timer var 62,5 uM. Alle forsøgene blev udført i tre eksemplarer og udtrykkes som gennemsnit ± SD. Signifikans er angivet som *

s 0,001

.

c. Cytotoksicitet virkningen af ​​forskellige koncentrationer af plumbagin på PBMC-celler

. Dosis cytotoksicitet effekter af plumbagin på PBMC celler var repræsenteret i ovenstående graf. PBMC-celler resistens over for plumbagin induceret cytotoksicitet selv ved 100 uM koncentration. Alle forsøgene blev udført i tre eksemplarer og udtrykkes som gennemsnit ± SD. Signifikans er angivet som *

s. 0,001

plumbagin hæmmer spredning af HCT15 og HT29 colon kræftceller

Udbredelsen af ​​HCT15 celler behandlet med 15 pM og 30 uM plumbagin steg svagt i 24 timer og faldt betydeligt efter 48 timer og 72 timer, hvorimod ubehandlede kontrolceller blev opretholdt eksponentielle vækstfase. I modsætning hertil HT29-celler behandlet med 50 pM plumbagin viste eksponentiel vækst, der svarer til den for ubehandlede kontrolceller, hvorimod væksten af ​​HT29-celler behandlet med 75 pM plumbagin steget lidt ved 24 timer og faldt betydeligt efter 48 timer og 72 timer (Fig . 2a og 2b).

en. HCT15 celler. b. HT29-celler

. Proliferation af HCT15 celler behandlet med 15 pM og 30 uM plumbagin og HT29-celler behandlet med 75 pM plumbagin steg betydeligt efter 48 timer og 72 timer, mens 50 uM plumbagin behandlede HT29-celler har tendens til at formere sig. Alle forsøgene blev udført i tre eksemplarer og udtrykkes som gennemsnit ± SD. Signifikans er angivet som *

s. 0,001

plumbagin inducerer apoptose i HCT15 og HT29 kolon kræftceller

For at bestemme DNA ødelæggende egenskaber plumbagin, HCT15 celler blev inkuberet med 15 pM og 30 pM plumbagin i 24 timer, hvorimod, HT29-celler blev inkuberet med 50 pM og 75 pM plumbagin i 24 timer. Udseendet af komet haler svarer med induktion af DNA-skade var synlige (fig. 3). HCT15-celler behandlet med 30 uM plumbagin og HT29-celler behandlet med 75 pM plumbagin viste forøget eksisterede af DNA-beskadigelse. Spændvidden af ​​kometen hale var ti og seks gange så kontrol- HCT15 celler og 15 pM plumbagin behandlet HCT15 henholdsvis mens, 50 uM og 75 uM plumbagin – behandlet HT29-celler viser fire og to gang af span af halen, henholdsvis sammenlignet med kontrol HT29-celler. DNA-skader blev ikke observeret, da glorie omgivende cellekerner var klart synlig i kontrol- celler.

HCT15 celler behandlet med 30 pM plumbagin og HT29-celler behandlet med 75 pM plumbagin viste øget bevaret af DNA-skader. Længden af ​​kometen hale var ti og seks gange større end kontrolgruppen og 15 uM plumbagin behandlet HCT15 henholdsvis mens, 50 uM og 75 uM plumbagin – behandlede HT29-celler viser fire og to gang af span af halen, sammenlignet med kontrol HT29-celler. DNA-skader blev ikke observeret, da glorie omgivende cellekerner var klart synlig i kontrol- celler.

Analyse af NFKB, Caspase-3-aktivering og cytochrom C frigivelse i plumbagin inkuberes HCT15 og HT29-celler

Aktivering af caspase-3, NFKB (p65) og cytosoliske frigivelse af cytochrom C blev analyseret ved western blotting (fig. 4a). Aktivering af NFKB (p65) var signifikant forøget i både 15 uM og 30 uM plumbagin – behandlet HCT15 samt i 50 uM og 75 uM plumbagin – behandlet HT29-celler, sammenlignet med kontrolpatienter HCT15 og HT29-celler. Aktivering af caspase-3 og niveauer af cytosolisk cytochrom C var signifikant høj, i både 15 um og 30 um plumbagin – behandlet HCT15-celler, sammenlignet med ubehandlede HCT15-celler. Men aktivering af caspase-3 og niveauer af cytosolisk cytochrom C var høje kun 75 uM plumbagin behandlede HT29-celler, men ikke i HT29-celler behandlet med 50 pM plumbagin.

en. Immunoblotting-analyse af NFKB-aktivering, Caspase-3-aktivering og cytochrom C frigivelse

. Lane 1- Kontrol HCT15; Bane 2- 15 uM plumbagin behandlet HCT15; Bane 3- 30 uM plumbagin behandlet HCT15; Lane 4 Kontrol HT29; Bane 5- 50 uM plumbagin behandlede HT29; Bane 6- 75 uM plumbagin behandlede HT29.

b.i. Celle cyklus analyse af kontrol- og plumbagin behandling HCT15 og HT29-celler ved flowcytometri

. Sammenlignet med kontrol HCT15, HCT15 behandlet med plumbagin viser markant stigning i sub-G1 fraktion tyder på, at disse celler undergår apoptose. HT29-celler udsat for 75 uM plumbagin alene udviste stigning i sub-G1 fraktion henviser HT29-celler eksponeret for 50 uM plumbagin sub-G1 fraktion var meget mindre.

b.ii. Kvantitative data af cellecyklus analyse

. Alle forsøgene blev udført i tre eksemplarer og udtrykkes som gennemsnit ± SD. Signifikans er angivet som *

s. 0,001

Cell cyklus analyse af kontrol og plumbagin behandlet HCT15 og HT29 celler

HCT15 celler udsat for 15 og 30 uM af plumbagin udstillet fortsatte stigning i sub-G1 fraktion, der kan omfatte både apoptotiske og snavs fraktion indebærer sammen omfanget af celledød. Skaden var mere tydelig med 30 pM af plumbagin. Den sub-G1 fraktionen for kontrollen var 6,8%, mens det samme var 24,52 og 37,87% i 15 og 30 uM plumbagin behandlede HCT15 celler (fig. 4b.i). Dette indikerer en dosisafhængig stigning i apoptose på HCT15 celler ved plumbagin. Resultater illustreret også forbundet akkumulering af celler i G0 /G1-fasen, hvilket indikerer inhibering af bevægelse af celler fra G0 /G1-fasen til S-fasen og dermed forsinke eller inhibere indtrængen af ​​datterceller i mitotisk cyklus.

I tilfælde af HT29-celler udsat for 75 uM plumbagin alene udviste stigning i sub-G1 fraktion henviser HT29-celler eksponeret for 50 uM plumbagin sub-G1 fraktion var meget mindre. Sub-G1 fraktion til kontrol var 4,39%, mens den samme var 6,14 og 26.76% for 50 og 75 uM af plumbagin behandlet H29-celler, hvilket angiver forekomsten af ​​omfattende apoptose kun 75 uM plumbagin behandlet H29 celler, sammenlignet med 50 pM af plumbagin behandlet H29-celler og kontrol HT29-celler. Resultater viser også, at akkumuleringen af ​​celler i G0 /G1 fasen kun 75 uM plumbagin behandlet H29 celler, der forårsager signifikant fald i bestanden af ​​S og G2 /M-fasen, hvilket indikerer forsinkelse eller hæmning af optagelsen af ​​disse celler i syntese fase og mitotiske cyklus. Markant øget celle population blev set i S og G2 /M-fasen i 50 uM plumbagin behandlet H29 celler indikerer proliferation af celler (fig. 4.b.ii)

Analyse af phosphoryleret Akt, phosphoryleret EGFR, PCNA og cyclin D1 i plumbagin inkuberet HCT15 og HT29-celler Salg

Ekspression af PCNA blev cyclin D1 sammen med phosphorylering af Akt og EGFR analyseret ved western blotting (fig. 5). Ekspression af PCNA var signifikant reduceret i 15 uM og 30 uM plumbagin behandlet – HCT15-celler sammenlignet med ubehandlede celler. Signifikant fald i niveauet af PCNA blev kun observeret i 75 pM plumbagin behandlede HT29-celler, men ikke i 50 uM plumbagin behandlede HT29-celler. Signifikant nedsatte niveauer af phosphoryleret EGFR, blev Akt og GSK-3β observeret i 15 uM og 30 uM plumbagin behandlet HCT15 og i 75 uM plumbagin behandlede HT29-celler i sammenligning med kontrolceller. I 50 uM plumbagin behandlede HT29-celler, niveauer af phosphoryleret EGFR, Akt og GSK-3β viste ubetydelige ændringer. . Β – Actin tjente som intern kontrol

Lane 1- Kontrol HCT15; Bane 2- 15 uM plumbagin behandlet HCT15; Bane 3- 30 uM plumbagin behandlet HCT15; Lane 4 Kontrol HT29; Bane 5- 50 uM plumbagin behandlede HT29; Bane 6- 75 uM plumbagin behandlede HT29. Ekspression af PCNA, cyclin D1 sammen med phosphorylering af Akt og EGFR var signifikant reduceret i 15 uM og 30 uM plumbagin behandlede HCT15 og i 75 uM plumbagin sammenlignet med kontrolpatienter HCT15, kontrol HT29 og HT29-celler behandlet med 75 pM plumbagin. β-actin tjente som intern kontrol.

Analyse af

TNF-α

cox-2

udtryk i HCT15 og HT29-celler behandlet med plumbagin

en. b. c. d.