PLoS ONE: opregulering af S100A11 i Lung Adenocarcinom – dens potentielle Forholdet til Cancer Progression

Abstrakte

Vi har tidligere rapporteret, at patienter med lunge adenokarcinomer med KRAS genmutationer og stærk prolifererende aktivitet havde dårligere resultater, selv i de tidlige stadier af sygdommen. Formålet med den foreliggende undersøgelse var at belyse den potentielle molekylære grundlag for disse meget maligne lungetumorer ved at fokusere på S100 proteiner (S100A2, S100A7, og S100A11), som er nedstrøms mål for onkogene KRAS og promotorer på tumorudvikling. Den immunhistokemiske udtryk for S100 proteiner blev undersøgt i 179 primære lunge adenokarcinomer, og de potentielle relationer mellem deres niveauer og clinicopathologic faktorer blev analyseret. Blandt de tre undertyper, S100A11 niveauer signifikant højere i adenocarcinomer med KRAS mutationer og stærk prolifererende aktivitet. De var også højere i adenocarcinomer med dårligt differentieret tumorer. Endvidere blev højere niveauer af S100A11 forbundet med kortere sygdomsfri overlevelse. Disse resultater antyder, at opregulering af S100A11 spiller en rolle i tumorudvikling, specielt i KRAS-muterede lunge-adenokarcinomer

Henvisning:. Woo T, Okudela K, Mitsui H, Tajiri M, Rino Y, Ohashi K et al. (2015) opregulering af S100A11 i Lung Adenocarcinom – dens potentielle Forholdet til Cancer Progression. PLoS ONE 10 (11): e0142642. doi: 10,1371 /journal.pone.0142642

Redaktør: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: August 1, 2015; Accepteret: 23. oktober 2015; Udgivet: November 6, 2015

Copyright: © 2015 Woo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, og videnskab Japan (Tokyo Japan), og Yokohama Medical Facility (Yokohama, Japan) . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de mest almindelige årsager til kræft-relaterede dødsfald i den udviklede verden [1-2]. En stor del af patienterne, selv dem med tidlig fase ikke-småcellet lungecancer, dør på grund af tilbagevendende sygdom [3-4]. Selv om nogle lungetumorer er følsomme over for konventionelle kemoterapeutiske midler eller visse molekylære målrettende midler, er mange ikke [5-6]. Således er der behov for en dybere forståelse af den molekylære basis for lunge carcinogenese for at udvikle nye terapeutiske strategier.

Vi har tidligere rapporteret, at patienter med lunge-adenokarcinomer med KRAS genmutation og stærk prolifererende aktivitet havde dårligere resultater, selv i den tidlige fase af sygdommen [6]. Derfor er formålet med den foreliggende undersøgelse var at belyse den potentielle molekylære grundlag for disse meget maligne lungetumorer ved at fokusere på S100-proteiner. S100 proteinfamilien binder til calcium og modulerer transmission af forskellige cellulære signaler. Vi har tidligere vist, at S100A2, S100A7, og S100A11 var nedstrøms mål for onkogene KRAS (tabel 1 og 2) [7-8]. Ekspressionen af ​​S100-proteiner viste sig også at blive ændret i forskellige cancere [9-20] (larynx [10], bryst [11], lunge [12-13], gastrisk [14], kolorektal [15], hepatocellulær [16 ], pancreas [17], prostata [18], nyre [19], og blære kræft [20]), herunder lungekræft [12-13], og disse proteiner er blevet foreslået at fremme udviklingen af ​​carcinogenese ved at modulere cellemigration og proliferativ aktivitet [21].

Vi her undersøgte 179 kirurgisk resektion primær lunge adenokarcinomer for immunhistokemisk ekspression af S100 proteiner (S100A2, S100A7, og S100A11), og analyseret de potentielle relationer mellem deres niveauer og clinicopathologic faktorer.

Materialer og metoder

Primær Lung Cancer

Alle 179 lungekræft undersøgte var tilfælde af fase i adenocarcinom, der undergik radikale kirurgisk resektion på Kanagawa Cardiovascular og Respiratory center (Yokohama, Japan). Forskningen Planen blev godkendt af de etiske komitéer i Yokohama City University og Kanagawa kardiovaskulære og respiratoriske center. Skriftligt informeret samtykke til forskning brug af resektion materialer blev opnået fra alle fag giver materialer.

Histologiske undertyper blev klassificeret i henhold til 2011 IASLC /ATS /ERS klassifikation af lunge adenocarcinom [22], og tumor stadier blev bestemt ifølge det internationale klassifikationssystem TNM (syvende udgave af UICC) [23].

Western blotting

Tissue lysater blev underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese, og overført til PVDF-membraner (Amersham, Piscataway, NJ). Membranerne blev derefter inkuberet med fedtfri tørmælk i Tris-bufret saltvand indeholdende Tween-20 (TBS-T) for at blokere ikke-immunspecifikt proteinbinding, og derefter med et primært antistof mod S100 A11 (Santa Cruz, Santa Cruz, CA ), og beta-actin (Sigma, St. Louis, MO). Efter vask med TBS-T, blev membranerne inkuberet med dyr-matchede HRP-konjugerede sekundære antistoffer (Amersham). Immunreaktivitet blev visualiseret med et forøget kemiluminescens (Amersham).

Immunhistokemi

Tumor snit blev skåret fra formalinfikserede, paraffinindlejrede vævsblokke. Snit blev deparaffineret, rehydreret, og inkuberet med 3% hydrogenperoxid, efterfulgt af 5% gedeserum til at blokere endogen peroxidaseaktivitet aktiviteter og ikke-immunospecifik proteinbinding. Snit blev kogt i citratbuffer (0,01 M, pH 6,0) i 15 minutter for at hente maskerede epitoper og derefter inkuberet med primære antistoffer mod S100A2, S100A7, og S100A11 (Santa Cruz) såvel som Ki-67 (DAKO, Ely, UK ). Immunoreaktivitet blev visualiseret under anvendelse af et Envision detektionssystem (DAKO), og kerner blev modfarvet med hematoxylin. De immunohistokemiske ekspressionsniveauer af S100-proteiner blev bedømt ved et pointsystem som beskrevet i afsnittet Resultater. Indekset for Ki-67 mærkning blev beregnet som andelen af ​​celler med positive kerner blandt 500-1000 cancerceller. Ki-67 indeks mærkning af 10% og = 10% blev klassificeret som lave og høje niveauer baseret på resultaterne af vores tidligere undersøgelse [6].

Statistisk analyse

Forskelle i score blandt de grupper, der er klassificeret baseret på clinicopathologic emner blev analyseret ved Mann-Whitney eller Kruskal-Wallis test. Det indbyrdes forhold mellem scores og clinicopathologic emner blev analyseret under anvendelse af en multipel lineær regressionsmodel. Den postoperative sygdomsfri span blev defineret som perioden lige fra datoen for operationen til den dato, hvor gentagelse blev diagnosticeret. En observation blev censureret i sidste opfølgning, hvis patienten var i live eller var død af en anden end lungekræft årsag. Gentagende kurver blev plottet ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden, og den absolutte risiko for tilbagefald på fem år blev estimeret ud fra disse kurver. Forskelle i sygdomsfri overlevelse spænder blev analyseret under anvendelse af log-rank test. P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS software (SPSS til Windows Version 10.0, SPSS, Chicago, IL, USA).

Resultater

immunhistokemisk udtryk for S100 proteiner

S100A11 protein blev udtrykt i kerner og cytoplasma af normale epitelceller fra bronkioler (fig 1A), mens S100A2 proteinet blev hovedsageligt udtrykt på den apikale side af cytoplasmaet i granulatform (fig 1E).

repræsentant fotografier fra normale bronkioler (A, E) og tumorer, hvor ekspressionen af ​​S100A11 og S100A2 var negativ (B, F), svag (C, G) og stærk (D, H), vises.

S100 proteinniveauer varierede i neoplastiske celler, og selv i individuelle tumorer. Ekspressionen af ​​disse proteiner var højere i nogle neoplastiske celler end i bronchiolær epithelceller (fig 1D og 1H), mens andre celler udtrykte dem svagt (Fig 1C og 1G) eller på en umålelig niveau (fig 1B og 1E). På den anden side blev den S100A7 proteinet kun udtrykkes i et par adenokarcinomceller. Det blev kraftigt udtrykt i keratiniserende celler af pladecellecarcinomer (S1 Fig). Således blev S100A7 protein udelukket fra den følgende analyse.

Udtrykket niveauer af S100A2 og S100A11 blev klassificeret i negativ (niveau 0), svag (niveau 1), stærk (niveau 2). Den svage blev defineret som niveauet næsten svarer til det i bronchiolær epitelceller. Den stærke niveau blev defineret som et utvetydigt stærkere niveau end den bronchiolær epitelceller. Den immunhistokemiske udtryk score blev bestemt som det gennemsnitlige niveau i en maksimal tumor sektion (hvis 30%, 10%, og 60% af neoplastiske celler i den maksimale tumor sektion var negative, svage og stærke niveauer, henholdsvis det gennemsnitlige niveau beregnet som “0.3×0 + 0.1×1 + 0.6×2 = 1,3”). Ekspressionsniveauerne af S100A2 og S100A11 i alle de undersøgte er vist i fig 2A og 2B tumorer.

Median ekspressionssystemer scoringer var 1,30 i S100A11 (A) og 0,10 i S100A2 (B). S100A11 blev ikke udtrykt i 8 tilfælde (A), mens S100A2 ikke blev udtrykt i næsten halvdelen af ​​de undersøgte sager (83 sager) (B). ADC, Adenocarcinom.

Gyldigheden af ​​den immunhistokemiske evaluering blev støttet af den Western blot-analyse, fordi S100 protein niveauer evalueret ved immunhistokemi og dem ved Western blotting var nogenlunde parallelt (Resultatet af en Western blot for S100A11 blev vist i S2 fig).

S100 proteinniveauer og clinicopathologic faktorer

S100A11 niveauer signifikant højere i adenocarcinomer med KRAS mutationer og stærk prolifererende aktivitet (P = 0,038 i Kruskal-Wallis test , fig 3). De var også signifikant højere hos adenocarcinomer med dårligt differentieret tumorer (P = 0,021 i Kruskal-Wallis test, tabel 3) og lymfe eller vaskulære komplikationer (P = 0,026 i Mann-Whitney test, tabel 3). En multipel lineær regressionsanalyse viste, at ringe differentierede tumorer korrelerede med højere S100A11 niveauer (P = 0,039, tabel 4). På den anden side, blev S100A2 niveauer ikke forbundet med KRAS-mutationer, prolifererende aktivitet, eller nogen af ​​de andre clinicopathologic faktorer (data ikke vist).

fortykkede linjer angiver median score på S100 A11 ekspression, som blev 1,00 i KRAS Wild-type /Ki-67 Low tilfælde (n = 94), 1,50 i KRAS Wild-type /Ki-67 Høje tilfælde (n = 62), 1,20 i KRAS muterede-type /Ki-67 Low tilfælde (n = 11) og 1,80 i KRAS muterede-type /Ki-67 Høje tilfælde (n = 11). S100A11 ekspressionsniveauer var signifikant højere i adenocarcinomer med KRAS mutationer og stærk prolifererende aktivitet (P = 0,038 i Kruskal-Wallis test). Wt, Vildtype; Mt, Muterede-typen. Vejviser

S100A11 protein niveauer og sygdomsfri overlevelse

Da de opnåede resultater antydede, at opregulering af S100A11 var involveret i tumor progression, især i KRAS-muterede lunge adenokarcinomer, dens prognostisk værdi blev efterfølgende verificeret. Et hundrede og halvfjerds-ni patienter med lunge adenokarcinomer på trin I blev undersøgt. S100A11 udtryk snesevis af 1,65 og = 1,65 blev klassificeret som lav og høj baseret på en Receiver Operating karakteristik (areal under kurven 0,629, 95% fortrolige interval 0,501-0.757). Et hundrede og atten patienter var lav-expressers, mens 61 var høj-expressers. Femårige sygdomsfrie overlevelse var 90,1% og 76,3% i lav- og høj-S100A11 expressers hhv. Den stærke udtryk for S100A11 korreleret med kortere sygdomsfri overlevelse i postoperative lunge adenokarcinomer (p = 0,0182 i Log-rank test, figur 4). På den anden side blev en korrelation ikke fundet mellem S100A11 ekspressionsniveauer og stedet for tilbagevendende sygdom (data ikke vist).

Femårige sygdomsfri overlevelse satser var 76,3% i høj-S100A11 expressers (n = 61) og 90,1% i lav-S100A11 expressers (n = 118). Den stærke udtryk for S100A11 korreleret med kortere sygdomsfri overlevelse i postoperative lunge adenokarcinomer (p = 0,0182 i Log-rank test).

Diskussion

Blandt S100 proteiner (S100A2, S100A7, og S100A11) undersøgt i nærværende undersøgelse, S100A11 niveauer signifikant højere i adenokarcinomer med KRAS mutationer og stærk prolifererende aktivitet (figur 3). De var også højere i adenocarcinomer med dårligt differentierede tumorer (tabel 3 og 4). Endvidere den stærke ekspression af S100A11 korreleret med kortere sygdomsfri overlevelse (Fig 4). Disse resultater antydede, at ændringer i ekspressionen af ​​S100A11 spillet en rolle i tumorudvikling, specielt i KRAS-muterede lunge-adenocarcinomer.

S100A11, også kaldet S100C eller calgizzarin, hører til S100 familie af multi-gen calcium- bindende proteiner. Det er beliggende på 1q21 med 15 andre S100 familiemedlemmer og har en molekylevægt på 11.7kDa [24]. S100 familiemedlemmer regulere vigtige intracellulære begivenheder såsom enzymaktiviteter, dynamikken i cytoskeletale bestanddele, og Ca

2 + koncentrationer, med henblik på at modulere cellevækst og motilitet samt differentiering [9]. Den opregulering af S100A11 er blevet rapporteret i forskellige kræftformer [9], såsom larynx [10], bryst [11], lunge [12-13], gastrisk [14], kolorektal [15], pancreas [16], og prostatakræft [17], og er ofte blevet forbundet med kræft progression, implicerer sin onkogene rolle [10-17]. Tian T et al. tidligere vist, at S100A11 blev opreguleret i et stærkt metastatisk lungecancer-cellelinie gennem en proteomisk analyse [13]. Wang et al. rapporterede også, at S100A11 niveauer steg med udviklingen af ​​sygdommen fase i colorectal cancer [15]. Vores resultater er i overensstemmelse med disse resultater.

Men tidligere undersøgelser viste, at S100A11 ekspressionsniveauerne blev reduceret i tumorer med højere ondartede aktivitet i nyrerne [19] og blære kræft [20]. Memon AA et al. viste, at S100A11 blev nedreguleret i en højere-graded cellelinje af blærekræft ved en proteomanalyse, og svag ekspression af S100A11 var forbundet med ringe overlevelse [20]. Denne uoverensstemmelse indebærer kompleksiteten af ​​kræft progression. For eksempel adskillige cancer-beslægtede proteiner, såsom transformerende vækstfaktor-beta, har modsatte funktioner som inhibitorer eller promotorer i forskellige stadier af cancer progression [25]. Derfor kan den potentielle rolle for den afvigende ekspression af S100A11 i carcinogenese variere blandt forskellige typer af maligniteter.

Sammenfattende resultaterne af den foreliggende undersøgelse tydede på, at opregulering af S100A11 spillet en rolle i tumorudvikling , navnlig i KRAS-muterede lung adenocarcinomer. Den biologiske funktion af S100A11 stadig uklar. Yderligere undersøgelser er berettiget med henblik på at belyse de mekanismer, som S100A11 fremmer udviklingen af ​​lungekræft.

Støtte Information

S1 Fig. Immunhistokemisk undersøgelse af S100A7 protein udtryk niveauer i tumorer og ikke-tumorform epitel fra lungekræft patienter, der gennemgår kirurgisk resektion.

Repræsentative billeder fra normale bronkioler (A), adenocarcinom (B) og pladecellekræft (C) er vist. S100A7 blev ikke udtrykkes i normale epitelceller i bronkioler (A), og blev kun udtrykt i få adenocarcinom (ADC) celler (B). På den anden side, blev det stærkt til udtryk i de keratiniserende celler planocellulært karcinom (SQC) (C)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0142642.s001

(TIFF)

S2 Fig. Salg Proteinlysater fra tumorer (t) og ikke-tumor-væv (N) af lungeadenocarcinom væv af patienter, der gennemgår kirurgisk resektion blev underkastet en Western blot-analyse for S100A11 og β-actin (ACTB) i de repræsentative tilfælde (A) . Signalintensiteterne af båndene blev vurderet ved NIH billeddannelse. S100A11 niveauer var normaliseret til dem af ACTB. Normaliserede niveauer er vist (B). Den immunhistokemiske ekspression af S100A1 i de samme tumorer blev vist (C). S100 proteinniveauer evalueret ved immunohistokemi og dem ved Western blot var nogenlunde parallel. . Cs, Case

doi: 10,1371 /journal.pone.0142642.s002

(TIFF)

Tak

Vi har især takke Emi Honda og Misa Otara (Patologisk Institut, Kanagawa kardiovaskulære og respiratoriske center) for deres tekniske assistance.