PLoS ONE: En shRNA Baseret Genetisk Screen Identificeret Sesn2 som en potentiel tumorsuppressor i lungekræft via Undertrykkelse af Akt-mTOR-p70S6K Signaling

Abstrakt

Baggrund

Lungekræft er på vej hurtigt som den førende død årsag i kinesiske cancerpatienter. De kausale faktorer for kinesisk lungekræft udvikling stort set uklar. Her beskæftigede vi en shRNA bibliotek-baserede tab af funktion skærm i et genom-dækkende og saglig måde at afhøre potentielle tumor suppressor kandidater i udødeliggjort human lunge epitel celle linje BEAS-2B.

Metoder /Results

blød agar assays blev udført til screening BEAS-2B-celler inficeret med den retrovirale shRNA bibliotek med den erhvervede træk ved forankringsuafhængig vækst, store ( 0,5mm i diameter) og godt adskilte kolonier blev isoleret for proliferation . PCR’er blev udført for at amplificere den integrerede shRNA fragmentet fra individ genomisk DNA ekstraheret fra hver koloni, og hvert PCR-produkt indgives til DNA-sekventering for at afsløre den integrerede shRNA og dens målgen. I alt seks ansøgerlande transformation undertrykkere herunder INPP4B, Sesn2, TIAR, ACRC, Nup210 blev LMTK3 identificeret. Vi valideret Sesn2 som kandidat for lungekræft tumor suppressor. Knockdown af Sesn2 af en shRNA målretning 3’UTR af Sesn2 transkript kraftigt stimuleret proliferation og malign transformation af lunge bronkial epitelcelle BEAS-2B via aktivering af Akt-mTOR-p70S6K signalering, mens ektopisk ekspression af Sens2 re-undertrykte malign transformation fremkaldt af Sesn2 shRNA. Endvidere knockdown af Sesn2 i BEAS-2B-celler fremmet BEAS-2B-celle-transplanterede xenograft tumorvækst i nøgne mus. Endelig DNA-sekventering angivne mutationer af Sesn2 genet er sjældne, protein niveauer af Sesn2 af 77 kinesiske lungekræftpatienter varierer meget i forhold til deres hosliggende normale væv, og det lave ekspressionsniveau af Sesn2 associerede med ringe overlevelse i disse undersøgte patienter af Kaplan Meier analyse.

konklusioner

Vores shRNA-baseret skærm har vist Sesn2 er en potentiel tumorsuppressor i lunge epitelceller. Udtrykket niveau Sesn2 kan tjene som en prognostisk markør for kinesiske lungekræftpatienter i klinikken

Henvisning:. Xu H, Sun H, Zhang H, Liu J, Fan F, Li Y, et al. (2015) En shRNA Baseret Genetisk Screen Identificeret Sesn2 som en potentiel tumorsuppressor i lungekræft via Undertrykkelse af Akt-mTOR-p70S6K Signaling. PLoS ONE 10 (5): e0124033. doi: 10,1371 /journal.pone.0124033

Academic Redaktør: Max Costa, New York University School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: December 22, 2014 Accepteret: 3 marts 2015; Udgivet: Maj 11, 2015

Copyright: © 2015 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Finansieringen blev leveret af Natural Sciences Foundation of China (tilskud nr 81.272.582). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft fremstår som den mest almindelige og dødelige malignitet i Kina såvel som i verden [1,2]. Baseret på patologiske træk, kan lungekræft inddeles i to store undertyper, ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og småcellet carcinom (SCLC). NSCLC, der tegner sig for mere end 80% af alle tilfælde af lungekræft kan yderligere opdeles i adenocarcinom (~ 48%), planocellulært karcinom (~ 28%) og storcellet carcinom (~ 24%) [1,3]. På trods af de store fremskridt, der er opnået i diagnostik, operation, strålebehandling og målrettede behandlinger, lungekræft stadig en ganske dårlig prognose og dens 5 års overlevelse forbliver så lav som 10% -15% i de seneste 30 år [3].

De mekanismer kørsel lungekræft udvikling er komplekse, genetiske ændringer, rygning og forskellige miljømæssige forureninger er fælles årsagsfaktorer tilskrives lungekræft forekomst. Tumorsuppressorer med tab af funktion mutationer, deletioner og /eller epigenetisk inaktivering spiller ofte en afgørende rolle i lunge tumorigenese [4]. For eksempel kan mutation rate af p53-genet i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) nå til 60%, selv går op til 80% i småcellet lungecancer (SCLC) [5]. Andre tumorsuppressorer såsom PTEN med meget lavere mutation sats også involverer i lunge adenocarcinom [6]. Ud over bedre forståelse af det molekylære ændringer forekom under lunge celle malign transformation, opdagelsen af ​​lungecancerrelaterede relateret tumorsuppressorgener tilvejebringer også mere effektive og personlige terapier for lungekræft behandling [7]. Til dette formål at identificere nye tumorsuppressorer i et genom-dækkende og saglig måde er en af ​​de centrale opgaver for lungekræft forskning. Imidlertid identificere nye tumorsuppressorgener er temmelig vanskeligt på grund af deres recessive udtryk natur. Cancer hele genomisk analyse viser, at der er mange lavt forhold mutationer i tumorcellerne, og mutationerne varierer mellem forskellige oprindelser af væv [8]. En shRNA bibliotek-baserede tab af funktion skærm rettet mod menneskelig transkriptom at afhøre potentielle tumor suppressor kandidater systematisk i immortaliserede humane celler har vist sig at være en stærk tilgang til identifikation af nye tumorsuppressorer [9,10], ved at bruge denne metode, en række nye tumorsuppressorer herunder Rest, PTPN12 osv blev opdaget [11,12].

De Sestrins tilhører en lille og evolutionær bevaret familie bestående af tre medlemmer i pattedyr, hvoraf Sesn1 og Sesn2 er inducerbare og p53 reguleres [13,14]. Evnen hos Sesn1 og Sesn2 at inhibere cellevækst og proliferation blev tilskrevet deres inhibering af mTORC1 aktivitet gennem en AMPK afhængig mekanisme i en række humane og muse cellelinier, såvel som i muselever [15].

Konsekvensen af ​​Sesn2 i kontrol af cellevækst og overlevelse stadig kontroversielt. Den nøjagtige rolle Sesn2 på celleoverlevelse kan afhænge af arten af ​​stress. Det er blevet vist, at Sesn2 ekspression inhiberer cellevækst og proliferation som reaktion på genotoksisk stress (såsom DNA skader) og Sesn2 mangel gør murine fibroblast mere modtagelige for oncogen transformation via lindring af p53-afhængig inhibition af mTOR [16]. Desuden forhøjede Sesn2 inhiberede IR-induceret mTOR signal- og sensibiliserede MCF7-celler til IR-bestråling [17], i modsætning ekspressionen af ​​Sesn2 beskyttet iskæmi, lav glucose og H

2O

2 induceret apoptose i LNCaP-celler [18 ].

Resultater

shRNA skærm til transformation undertrykkere af lunge epitelceller

Anchorage uafhængig vækst er kendetegnende for cellulær malign transformation

in vitro

. De transformerede celler mister kontaktinhibering, kan vokse og overleve uden at knytte sig til kulturen matrix. Derfor blød agar-assay til måling af forankringsuafhængig vækst er en nyttig metode til at finde nye transformation suppressor gener [19]. Da de fleste lungekræft som følge af epitelceller, valgte vi de bronchiale epitelceller BEAS-2B for den primære screening. BEAS-2B celler afledt fra sundt humant lungevæv blev transformeret med SV40-stort T-antigen. Disse celler immortaliseres men manglende evne til at proliferere effektivt i fravær af ekstracellulær matrix og danne tumorer i nøgne mus [20]. Vi inficere BEAS-2B-celler med en retroviral shRNA bibliotek konstrueret i pSM2 retroviral vektor. Den shRNA Biblioteket består af 87,283 shRNAs rettet 32,216 menneskelige udskrifter [9,10]. Biblioteket blev screenet i 72 puljer med 1.000 shRNAs per pool anvendelse af en protokol tidligere beskrevet (Fig 1A) [21]. De inficerede BEAS-2B celler blev selekteret med 0,5 ug /ml puromycin til 1 uge, derefter vurderede vi de inficerede celler til forankringsuafhængig proliferation (Fig 1B). Både den negative kontrol shFF2 og shRNA bibliotek inficeret BEAS-2B celler blev dyrket i 0,35% topagar i tre uger. Vi tælles koloni numre fra shFF2 kontrol og shRNA bibliotek plader med violet krystal farvning. Henviser shFF2 celler induceret meget mindre og færre antal koloni, biblioteket transformerede celler fremkaldte meget mere og større kolonier i den øvre blød agar medium. De gennemsnitlige antal transformerede koloni var 86 ± 20 pr 10 cm plade for shFF2 celler og 205 ± 35 for shRNA biblioteket celler baseret på resultater fra tre uafhængige forsøg (Fig 1C). Den store ( 0,5 mm i diameter) og godt adskilte enkelte kolonier blev udtaget til ekspansion i regelmæssig monolagskultur. Omtrentlige 100 forankring uafhængige individuelle kloner blev isoleret og dyrket. Det genomiske DNA fra en enkelt koloni blev ekstraheret og PCR blev udført for at amplificere hårnål DNA’et af det integrerede shRNAs og efterfulgt af indgivelse til Sanger DNA-sekventering. Selv om de fleste PCR-produkter ikke producerede informative DNA-sekventering resultater på grund af enten tekniske problemer eller flere arter af shRNAs eksisterende i samme genom, vi stadig var i stand til at identificere i alt 6 individuelle gener er omfattet af 6 unikke shRNAs gennem sekventering af provirale shRNAs fra disse individuelle kloner (tabel 1 og S1 Tabel for detaljeret information). Blandt de seks ansøgerlande transformation undertrykkere, INPP4B er en kendt tumor suppressor involverer i bryst- og prostatakræft [22,23], har rollerne for resten kandidatgener i undertrykkelse af celletransformation ikke været klar eller vel- karakteriseret endnu. Da Sesn2 genet har været impliceret i cellulær regulering via p53 signalvej, således valgte vi Sesn2 som den øverste kandidat tumor suppressor og valideret sine cellulære funktioner både

in vitro

in vivo

.

(a) et skematisk diagram af en genetisk screening for transformation suppressorer af BEAS-2B-celler. Retrovira bærer shRNA biblioteket blev genereret ved transfektion af virale pakkeceller med shRNA plasmider. BEAS-2B-celler blev inficeret med FF2 shRNA eller shRNA bibliotek vira og dyrket i blød agar i 10 cm plader i 3 uger, store og enkelte kolonier blev isoleret for celle ekspansion, PCR-amplifikation og DNA-sekventering af det integrerede shRNAs. (B) Repræsentative billeder af dannede kolonier på bløde agarplader. Transformerede kolonier blev observeret ved krystalviolet-farvning (øvre panel) eller under lysmikroskopi ved 20x forstørrelse (nederste panel). (C) Flere og større forankring uafhængige kolonier blev dannet i bibliotekets inficerede celler end i shFF2 inficerede celler, er data præsenteres som gennemsnit koloni nummer ± standardafvigelse per plade baseret på tre uafhængige infektion eksperimenter, *

s

0,05 ved t-test.

Sesn2 undertrykker malign transformation af BEAS-2B celler

Sesn2, først identificeret som Hi95, er en hypoxi inducerbart protein og viser en inhiberende funktion på mTOR signalvej [18]. Nogle Undersøgelser viste, at det kan fungere som en tumorsuppressor grund af dets inhibering af celleproliferation, men der er ingen direkte beviser for, at [16]. Fra vores shRNA baseret genetisk skærm og DNA-sekventering resultater, fandt vi tre BEAS-2B transformerede kolonier husende en identisk shRNA målretning 3’UTR af Sesn2 transkripter (betegnet shSesn2-1, for shRNA sekvens information se S1 tabel). For at udelukke off-target effekter, vi udviklet og testet to mere shRNAs (navngivet som shSesn2-2 og shSesn2-3, se S1 tabel) rettet mod de forskellige regioner i de 3’UTR af Sesn2 udskrifter. De cellelinjer, der udtrykker shRNAs Sesn2 målretning blev analyseret ved Western blotting og niveauet af endogen Sesn2 er blevet reduceret med ca. 80% i shSesn2-2 udtrykkende cellelinie (figur 2A). Vi podet disse Sesn2-2 dæmpende celler i blød agar plader. Efter 3 ugers vækst, shSesn2-2 silencing celle udviste stærk kolonidannelse evne med 435 ± 25 kolonier pr 10cm plade, mens færre og mindre kolonier (106 ± 40 per plade) blev dannet i shFF2 kontrolcelle podet plader (Fig 2B ). Desuden ektopisk udtryk Sesn2 drevet af pcDNA3.1 vektor i shSesn2-2 lyddæmpende celle delvist re-undertrykte kolonidannelse evne fremkaldt af shSesn2-2 (Fig 2B), der angiver de observerede fænotyper sandsynligvis henføres til reduktion af Sesn2, ikke forårsaget af shRNA off-target effekter. For at teste

in vivo

tumor fastholdende evne tillagt ved Sesn2 blev shSesn2-2 og shFF2 celler injiceres subkutant i de rigtige ampits af Balb /c nøgne mus. På den 28. dag efter implantation, blev dannet xenograft dissekeret fra hver mus, volumen og vægt af hver tumor blev målt og sammenlignet. Som vist i fig 2C, blev en stærk xenograft tumordannelse evne observeret i shSesn2-2 udtrykkende celler (for oversigt over alle tumorer dannet af Sesn2 knockdown cellelinie i to partier af nøgne mus, se S2 Fig). De gennemsnitlige xenograft tumorvolumener hos shSesn2-2 og shFF2 transplanterede mus er 521,45 ± 25.51mm

3og 69,02 ± 31.48mm

3 (fig 2D), og den gennemsnitlige tumor vægte var 0,523 ± 0,064 g og 0,156 ± 0,071 g (fig 2E), disse forskelle er statistisk signifikante (p 0,05 af t-test). Tilsammen vores resultater viser, at knockdown af Sesn2 fremmer malign transformation af BEAS-2B-celler både

in vitro

in vivo

, og Sesn2 kan virke som en potentiel tumorsuppressor i lungeepitelceller .

(A) slået ned af endogen Sesn2 af to uafhængige shRNAs rettet 3’UTR af Sesn2 udskrifter, blev bekræftet af immunblotting. (B) Det gennemsnitlige antal kolonier dannet i shSesn2-2 transformerede celler var 4 gange højere end shFF2 transformerede celler, *

s

0,05. Ektopisk udtryk for Sesn2 igen undertrykt forankring uafhængige vækst i shSesn2-2 udtrykkende celler. (C), (D) og (E) Knockdown af Sesn2 i BEAS-2B-celler førte til øget tumordannelse i nøgne mus. De Sesn2 tavshed celler blev transplanteret ind i armhulerne af

Balb /c

nøgne mus, blev implanteret dannet en måned senere efter transplantationen og fotograferet, røde pile angivne dannede tumorer under musen huden (øverste panel af C). Billedet af to repræsentant dissekerede tumorer blev vist i det nederste panel af C. Den gennemsnitlige tumor mængder og vægte fra transplanterede mus med Sesn2 lyddæmpning og FF2 kontrol celler blev målt og plottet i D og E, er data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse pr mus gruppe, *

s

. 0,05 af Student t-test

Silencing Sesn2 af shRNA fremmer både cellevækst og cellevandring

Accelerated cellevækst og cellevandring er kendetegnene for maligne transformerede celler. At udforske virkningerne af Sesn2 på cellevækst og celle migration, vi etableret et Sesn2 lyddæmpning cellelinje ved at inficere retroviral shSesn2-2 i lungeadenokarcinom A549-celler (fig 3A). Cellecyklus profiler i de resulterende cellelinjer blev bestemt ved flowcytometri. En høj S-fase andelen blev påvist i shSesn2-2 celler end i shFF2 celler (39,22% versus 23.45%, Fig 3B) indikerer nedregulering af Sesn2 forårsaget accelereret cellecyklusprogression. Derefter overvåges vi cellevækst ved MTT-assayet, og fundet shSesn2-2 prolifererer hurtigere end shFF2 celler (p 0,05, figur 3E). Sårheling blev udført i shSesn2-2 og shFF2 celler til at kontrollere forholdet mellem ekspressionen af ​​Sesn2 og cellemigration. Før assayet, shSesn2-2 og shFF2 celler blev forbehandlet med mitomycin C for at sikre, at lukningen af ​​såret skyldtes cellevandring men ikke celleproliferation. De gennemsnitlige lukning områder var 15,30 ± 2,56, 26,03 ± 3,96, 74,93 ± 5,72 på 6 h, 12h og 24h efter scratch oprettelse i shSesn2-2 celler og 2,42 ± 1,05, 7,37 ± 1,38, 28,4 ± 4,08 i shFF2 celler henholdsvis (fig 3C og fig 3D). Den hurtige sårlukning i shSesn2-2 celle støttede denne mangel på Sesn2 fremmer celle migration af lunge adenocarcinom A549 celler.

(A) Kropsbygning af Sesn2 knockdown i A549 celler ved immunblotting. (B) cellecyklus profiler af lunge adenocarcinom A549cell linjer udtrykker shSesn2-2 og shFF2. Celler blev farvet med propidiumiodid og analyseret ved flowcytometri. Den højere S-fag andel detekteret i shSesn2-2 celler foreslog hurtigere cellecyklusprogression forhold til shFF2 celler. (C) Repræsentative billeder af sårheling forsøg udført i shSesn2-2 og shFF2 udtrykkende celler på de angivne tidspunkter. De gennemsnitlige sårlukning procenter i hver celle gruppe blev afbildet i (D), signifikant heling forskel blev observeret efter den 24. time af sårheling, *

s Restaurant 0,05. Eksperimenter blev udført tre gange. (E) De celle vækstrater shSesn2-2 og shFF2 udtrykkende celler blev bestemt ved MTT-analyser og sammenlignet med de to-vejs ANOVA test (*

s

0,05)

Sesn2 undertrykker Akt-mTOR-p70S60K signalering

Implikationen at Sesn2 indebærer i reguleringen den transformerede tilstand af BEAS-2B epitelceller får os til at afgøre, hvilke molekylære kredsløb kan være påvirket af tabet af Sesn2 funktion. Som Akt-mTOR signalvej spiller en vigtig rolle i forskellige tumorer, og Sestrin familien har været impliceret i undertrykkelsen af ​​mTORC1 aktivering ved binding til AMPK [24], vi kontrollerede virkningerne på mTOR aktivering ved nedregulering af Sesn2 i A549 celler. Vi har registreret niveauerne af phosphoryleret p70S6K, en nedstrøms mål på mTOR og en indikator for mTOR aktivering, og det phosphorylerede Akt ved Ser473, en aktiv art af Akt, i A549-celler, der udtrykker shSesn2-2 eller shFF2. Under normale cellekultur tilstand, de basale niveauer af phosphoryleret p70S6K og phosphoryleret Akt i begge cellelinier var knap påviseligt (data ikke vist). Men efter tilsætning af 100 nM insulin ind serum sultet to cellelinier til 20 min, phosphoryleret p70S6K kunne påvises i begge cellelinier, men blev observeret meget mere phosphoryleret p70S6K i Sesn2 Knockdown celler (Fig 4A). Disse data indikerer mTOR-p70S6K vej er mere aktiveres ved Sesn2 lyddæmpning af shRNAs. Adskillige tidligere undersøgelser rapporteret insulin induceret Akt aktivering i mus kræver intakt mus Sesn2 [25], men vi stadig observeret signifikant aktivering af Akt efter insulin stimulation i Sesn2 dæmpende celler. Vores observation kan afspejle den kontroversielle rolle Sesn2 som reaktion på forskellige karakter stress. Efter aftale med vores resultater, at overekspression af Sesn2 forårsagede mindre phosphoryleret Akt-S473, gengiver MCF-7 celler mere følsomme over for ioniserende stråling [17]. Kollektivt, vores resultater viste, at Sesn2 kan fungere som et tumorsuppressorgen, der kan hæmme kræft celledeling levedygtighed gennem regulering af Akt-mTOR-p70S6K signalvej.

(A) A549 celler, der stabilt udtrykker shSesn2-2 eller shFF2 var serum-udsultet natten over og restimuleres med 100 nM insulin i 20 min, blev ekspressionsniveauerne af Akt, p70S6K og deres phosphorylerede arter detekteret ved immuno-blotting med viste antistoffer. (B) Intensiteten af ​​proteinbånd på immuno-blots blev kvantificeret med densitometri scanning. Den relative ekspression niveauet af hvert protein blev normaliseret baseret på niveauet af GAPDH i hvert lysat og plottet i B blev data vist som middelværdi ± standardafvigelse (SD) fra tre uafhængige forsøg. *

s

0,05 angiver en signifikant forskel i ekspressionsniveauerne af de undersøgte proteiner i de to cellelinjer

Lave ekspressionsniveauer af Sesn2 korrelerer med dårlig overlevelse i kinesisk lunge. kræftpatienter

for at etablere en årsagssammenhæng mellem afbrydelse af Sesn2 funktion og lunge tumor tilblivelse, vi indsamlede biopsi prøver fra 77 lunge kræftpatienter diagnosticeret som tumor hospital i Harbin Medical University (de detaljerede clincopathological funktioner i 77 kinesiske lungekræftpatienter blev opsummeret i S2 tabel). Det genomiske DNA blev ekstraheret fra disse lungekræft væv og deres tilstødende normale lungevæv. Vi amplificeret 3. og 4. exoner (som er de to DNA-elementer til kodning funktionen domæne af Sesn2) af Sesn2 gener og underkastes PCR-produkterne til Sanger DNA-sekventering. Af alle de sekventerede prøver påvistes kun to punktmutationer Val (GTA) 76 til Ala (GCA), Thr (ACG) 103 til Lys (AAG) i exon 3 af Sesn2 gen (se tabel 2) og disse to mutationer forekom samtidigt. Desuden blev kun én lungekræft patient (1 ud af 77) fandt der huser de to mutationer. Den meget lave mutation på Sesn2 genet i human lungecancer foreslår strukturel ændring af Sesn2 gen ikke er en væsentlig årsag bidraget til den maligne transformation af lungeepitelceller. For at teste, om dette Sesn2 mutant interfererer med funktionen af ​​endogent vildtype Sesn2 introducerede vi en Sesn2 cDNA huser Val76 til Ala og Thr103 til Lys mutationer ved pcDNA3.1 ekspressionsvektor i de BEAS-2B-celler. De transformerede celler med over-ekspression af Sesn2 mutanten undladt at fremkalde indlysende forankringsuafhængig vækst sammenlignet med celler transformeret med tom vektor (p 0,05) (S2 Fig). Denne observation foreslog mutationer af Val76 til Ala og Thr103 til Lys i exon 3 i Sesn2 genet kan ikke være i stand til at producere en stærk dominant negativ aktivitet i det mindste i BEAS-2B celler.

Næste, vi bestemt protein niveauer af Sesn2 i disse lungekræft væv ved immunblotting. Total væv lysater blev dannet ved homogenisering og påført SDS-PAGE opløsning. Proteinet niveau af Sesn2 blev afsløret ved Western blotting med antistoffer mod Sesn2 blev signalintensiteten af ​​Sesn2 protein kvantificeret ved densitometri scanning (Fig 5A). Vi definerer den relative ekspression af Sesn2 så lav, medium og høj i sammenligning med Sesn2 niveau i deres tilstødende normale lungevæv (detaljerne for denne definition er beskrevet i materiale og metode afsnit). Sammenfattende af de 77 lungekræftpatienter undersøgt, 57 patienter blev scoret med lav og medium udtryk for Sesn2 blev 20 patienter scoret med høj ekspression af Sesn2. Vi analyserede ekspressionen fordeling af Sesn2 med hensyn til deres klinisk-patologiske kategorier såsom pladecellekræft, adenocarcinom og småcellet carcinom samt køn, alder og karakteren af ​​celledifferentiering, fandt vi der ingen signifikant forskel på Sesn2 ekspression under de kategorier (detaljer se S2 tabel). Således er Sesn2 ekspressionsniveauer ikke sandsynligt påvirket af disse klinisk-patologiske træk ved lungecancerpatienter.

(A) Vævshomogenater fremstillet ud fra resektion lungekræft væv blev underkastet immunblotting probet med de angivne antistoffer. Vist er et repræsentativt billede af et Western blot. brev Capital N viser en normalt væv støder op til en kræft væv, og stort bogstav T med et tal angiver en kræft vævsprøve fra et individ lungekræft patient. Sesn2 ekspressionsniveau blev kvantificeret ved densitometri scanning og normaliseret baseret på signalet fra ladningskontrol GAPDH, blev detaljerede fremgangsmåder til definition af proteinekspression niveau som beskrevet i materiale og fremgangsmåde sektion. (B) Patienter blev opdelt i den høje ekspression og den kombinerede medium lave grupper baseret på deres ekspressionsniveauer af Sesn2 undersøgt i A. Kaplan Meier overlevelse analyse viste den lave udtryk for Sesn2 positivt korreleret med en dårlig overlevelse af de undersøgte patienter med lungecancer i løbet af en treårig følge op på deres diagnose, p = 0,015 ved en log-rank test viser en signifikant forskel på overlevelsen mellem de to patientgrupper

Vi delte de undersøgte patienter ind i høj ekspression og den kombinerede medium lave grupper baseret på deres ekspressionsniveauer af Sesn2. En tre-års overlevelse opfølgning af disse kræftpatienter 77 lunge blev udført på deres diagnose, Kaplan Meier analyse viste de treårige overlevelsesrater i den høje og den lave mellemstore grupper var 65,00% og 42,11% henholdsvis, log-rank test viste en signifikant fald i 3-års overlevelse på det lave medium (p 0,05) sammenlignet med den høje gruppe (figur 5B). Derfor vi konkludere det lave ekspressionsniveauet af Sesn2 medarbejdere med en dårlig overlevelse i kinesiske lungekræftpatienter, og ekspressionsniveauet af Sesn2 kan tjene som en potentiel prognostisk markør for patienter med lungecancer i klinikken.

Diskussion

et tab af funktion skærmen ved hjælp af shRNA biblioteket er en gennemprøvet kraftfuld tilgang til identifikation af nye og uforudsete tumorsuppressorer på en saglig måde. I denne undersøgelse har vi anvendt denne fremgangsmåde til at identificere gener undertrykke oncogen transformation i humane lunge epitelceller. Vi har identificeret flere gener impliceret i kræft patogenese. Skønt generne isoleret via denne strategi ikke kan være hyppige mål for mutation i tumorer, kan de ikke desto mindre afslører hidtil ukendte veje relevante for tumorigenese. For eksempel isolerede vi inositol polyphosphat 4-phosphatase type II (INPP4B) genet, en kendt tumor suppressor i bryst-, prostata-, og blandt andre maligniteter [22,26]. Mutationen eller lav ekspression af INPP4B er blevet tæt forbundet med dårlig prognose af disse cancere [23]. Hertil kommer, identifikation af T-celle intracellulære antigen 1-relaterede protein (TIAR) støtter yderligere tidligere resultater, som TIAR nedreguleres i en delmængde af epitelial tumorer og HeLa-celler med reduceret TIAR af shRNA producerede større epiteliale xenografter i nøgne mus [27 ]. Disse kendte cancer-relevant gener identificeret gennem vores skærme foreslog andre kandidatgener kunne være mere eller mindre relateret til fastholdende forankringsuafhængig proliferation, yderligere forsøg har behov for at bestemme, i hvilket omfang disse gener er involveret i lunge tumorigenese.

AKT-mTOR pathway har spillet en afgørende rolle i udviklingen af ​​kræft ved at regulere celleproliferation, apoptose og angiogenese [28]. Vi viste, at manglende Sens2 funktion forbedrer aktiviteten af ​​AKT-mTOR signalering kan være en vigtig mekanisme ligger til grund for evnen hos Sesn2 at begrænse den transformerede tilstand. Efter aftale med vores fund, at Sesn2 er en cellulær transformation suppressor i lunge epitel celle BEAS-2B, har Sestrin familie været impliceret i cellulær proliferation og celle overlevelse via undertrykke pattedyr mål for rapamycin kompleks en (mTORC1) aktivitet ved aktivering af AMP- afhængig proteinkinase (AMPK) i en p53-afhængig måde [15,16,29]. Endvidere Sestrins medierer DNA beskadigelse-sensing pathway bestående af ataxi telangiectasia muteret (ATM) og p53, selvom den underliggende mekanisme er uklar hidtil [16]. Interessant rolle Sesn2 i regulering af celleoverlevelse forbliver kontroversiel. For eksempel efter DNA beskadigelse induceret oncogen transformation, forhøjet Sesn2 i MCF-7-celler fremmer IR inducerede apoptotisk celledød [17]. Men under den energiske stress, såsom ATP mangel forårsaget af 2-deoxyglucose (2-DG) eksponering, Sesn2 beskyttede 2-DG-induceret celledød i både LNCaP celler og mus embryonale fibroblaster [18].

De fleste påfaldende den Sesn2 knockout mus fremlagt noget tumordannelse, selv ingen indlysende kortsluttede levetid hvilket er i modsætning til sine roller i tumor suppression og antiaging demonstreret tidligere [25]. Hvorfor der er sådan en fænotypisk uoverensstemmelse fandt sted mellem den

in vitro

cellulær transformation og

in vivo

musemodel? Da der er tre sentrin medlemmer i pattedyr med høj homologi (f.eks homologien mellem Sesn1B og Sesn2 er 71%), mest sandsynligt, Sesn2 kan være spille en redundant rolle i mus og dens mangel kan kompenseres ved dens tæt homolog såsom Sesn1B eller Sesn3. Men på et cellulært niveau, udførelse af en sådan kompensation måske afhængig af den genetiske baggrund og under et bestemt cellelinje, som kan helt forskellig fra situationen på en hel organisme såsom visse stammer af mus.

I modsætning til forudgående konstatering insulin induceret aktivering af Akt kræver tilstedeværelse af Sesn2 godtgøres med Sesn2 knock out musemodel [25], foreslog vores data insulinbehandling stadig var i stand til at stimulere øget phoshorylation af Akt-S473 i A549-celler med Sesn2 slået af shRNAs. Da AKT kaskade kan reguleres ved mange membranproteiner, herunder receptortyrosinkinaser, integriner, G-proteinkoblede receptorer [30], er det sandsynligt, at aktiveringen af ​​Akt i humane celler er delvis uafhængig af det intakte Sesn2. Til støtte for vores resultater, at overekspression af Sesn2 forårsagede mindre fosforylering på Akt-pS473 i MCF-7 celler [17], og den knockdown af AMPKα, en funktionel partner Sestrins for hæmning af mTORC1, har ikke påvirket stigning på akt phosphorylering stimuleret af FoxO1activation [29].

genetiske ændringer ofte bidrage til inaktivering af tumorsuppressorgener. Tab af heterozygocity (LOH) i Sesn1 (6q21) og Sesn2 (1p35) er også ofte observeret i forskellige menneskelige kræftformer [14,31]. I modsætning til sin herre p53-gen, fandt vi mutationen på Sesn2 gen i lungekræft væv er meget lav. Blandt vævsprøver reseceret fra 77 lungekræftpatienter, blev kun én detekteret med punktmutationer i Sesn2 genet. I betragtning af, at 60-80% af lungekræft væv havnen p53 mutationer, og Sesn1 og Sesn2 er direkte mål for p53 medieret transskription, rolle Sesns i tumor genesis kan være en del af en mekanisme, der ligger til grund nedskrivning af p53 i lunge kræftceller .

Den kliniske relevans af Sesn2 ekspressionsniveauet blev evalueret i lungekræft vævsprøver reseceret fra 77 patienter med lungecancer. Selvom Sesn2 protein varierer meget i de undersøgte lungevæv, der er en klar positiv sammenhæng mellem lave Sesn2 udtryk niveau og en dårlig overlevelse i de undersøgte patienter med lungecancer. Overraskende, i modsætning til de fleste tumorsuppressorer generelt nedreguleret i cancer væv, har vi observeret en betydelig del af høj ekspression af Sesn2 (20 ud af 77) i de undersøgte patienter med lungecancer, deres Sesn2 niveauer selv er meget højere end deres tilstødende normale lungevæv. I første omgang har Sestrins blevet impliceret som reaktion på oxidativ stress, inaktivering af Sestrins og akkumulering af reaktive oxygenarter (ROS) er blevet forbundet til carcinogenese [32]. Under onkogene tilstande, såsom kronisk inflammation, langvarig vækstfaktorsignalering og høje niveauer af oxidativt stress måske skadelig for overlevelse og formering af kræftceller, som følge af antioxidant mekanismer, er det ikke overrasket over at observere opreguleres Sestrins i visse dele af Mu76F1:5’-ATGTCCTCTGGGCGAGCAGACAACCTGGCAGTG-3’

Mu76R1:5’-CACTGCCAGGTTGTCTGCTCGCCCAGAGGACAT-3’

Mu103F2: