PLoS ONE: Design, syntese og in vitro og in vivo Biologiske Studier af en 3′-deoxythymidin konjugat, som potentielt dræbe cancerceller Selectively

Abstrakt

thymidin kinaser (TKS) er blevet betragtet som en af ​​de potentielle mål for anticancer terapeutisk på grund af deres forhøjede udtryk i kræftceller. Imidlertid har nucleobase analoger rettet mod TK vist dårlig selektiv cytotoksicitet i kræftceller trods effektive antivirale aktivitet. 3′-deoxythymidin phenylquinoxaline konjugat (dT-QX) er designet som en ny nukleobaseanalog at målrette TK i cancerceller og blokere cellereplikation via konjugeret DNA interkalerende quinoxalin-del. In vitro viste cellescreeningssystemet at dT-QX selektivt dræber en række cancerceller herunder lever carcinom, brystadenocarcinom og hjerne gliomceller; det havde en lav cytotoksicitet i normale celler, såsom normale humane leverceller. Anticancer aktivitet af dT-QX blev tilskrevet den selektive hæmning af DNA-syntesen resulterer i omfattende mitokondrie superoxid stress i cancerceller. Vi viser, at kovalent binding med 3′-deoxythymidin entydigt rettet cytotoksisk phenylquinoxaline del mere mod cancerceller end normale celler. Indledende museundersøgelse med subkutan levertumor model viste, at dT-QX effektivt hæmmede væksten af ​​tumorer. dT-QX er det første molekyle af sin art med meget amendable bestanddele, der udviser denne selektive cytotoksicitet i kræftceller

Henvisning:. Wei Q, Zhang D, Yao A, Mai L, Zhang Z, Zhou Q (2012 ) design, Synthesis, og in vitro og in vivo biologiske undersøgelser af en 3′-deoxythymidin konjugat, der potentielt dræbe cancerceller selektivt. PLoS ONE 7 (12): e52199. doi: 10,1371 /journal.pone.0052199

Redaktør: Kamyar Afarinkia, Univ of Bradford, England

Modtaget: August 2, 2012; Accepteret: November 12, 2012; Udgivet: 26 december, 2012 |

Copyright: © 2012 Zhou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af National Basic Research Program Kina (2011CB933100), grundforskning Midler til de centraleuropæiske universiteter (HUST: 2010ZD023), og den vigtige National Science Teknologi Specifikke projekter (2009ZX09301-014). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

med kræft er den hyppigste dødsårsag på verdensplan, udvikle sikre og effektive midler mod cancer forbliver i akut behov. Molekylært målrettet terapi har været den seneste fokus for udvikling anticancer lægemiddel, som det ses i eksemplet i Sorafenib [1], [2]. Sorafenib er en multi-tyrosinkinasehæmmer, der potentielt kan minimere bivirkninger såsom hepatotoksicitet forårsaget af andre lægemidler mod cancer, herunder 5-fluorouracil og doxorubicin [3], [4]. Svarende til tyrosinkinaser, har thymidin-kinaser (TKS) blevet betragtet anden potentiel anticancer target [5] – [8]. TK er de første phosphorylering enzymer i thymidin frelsesyntesevejen converting thymidin til dets 5′-phosphat form til DNA-syntese. I normale pattedyrceller, cytosolisk TK kun ved et lavt niveau i S-fasen af ​​celler; mens er observeret forhøjet niveau af TK i virusinficerede celler og hurtigt prolifererende cancerceller [5] -. [8], f.eks, lunge tumorer og brystkræft væv [9], [10]

nucleobase analoger målretning TK såsom AZT og acyclovir har vist effektive antivirale aktivitet [11], [12]. Imidlertid har dårlige cancer-selektivitet og stærke bivirkninger blevet forbundet med nucleobase-analoger, herunder neutron capture agent 5-thymidin bor konjugat og radioisotopisk ioderede deoxyuridin [13], [14]. For nylig har en kombinationsterapi ved anvendelse predelivered thymidinkinase efterfulgt af nucleobase analoger blevet undersøgt i liver cancer patienter med begrænsede effekter opnået [15]. Dette skyldes sandsynligvis, at TKS orienteret nucleobase-analoger, såsom AZT hurtigt blive fjernet ved nukleobase reparationsprocesser efter de inkorporeres i DNA syntese af cancerceller via thymidin frelsesyntesevejen [16] – [18]. 5-fluoruracil, et andet thymin analog, er en dihyrofolate reduktaseinhibitor og gælder forårsager cytotoksicitet i normale hepatocytter [3], [19]. Derfor er der behov alternativ udformning af mere effektive nucleobase-analoger rettet mod TK.

Vi rapporterer her en hidtil ukendt 3′-deoxythymidin phenylquinoxaline konjugat (dT-QX, figur 1), som selektivt dræber en række af cancerceller, men ikke normale hepatocytter. Strukturelt dT-QX er en 3′-triazol-3′-deoxythymidin forbundet med et DNA interkalerende quinoxalin-del. dT-QX designet til at målrette thymidin bjærgning vej baseret på det faktum, at 3′-triazol thymidinderivater genkendes af humane thymin kinaser [20], [21]. Formålet med tilsætning af quinoxalin-delen til DT-QX struktur var at blokere cellulær fjernelse af thymidinanaloger [16] – [18] via DNA interkalering i DNA syntese af cancerceller, fordi quinoxalin-delen er en kendt DNA interkalator [22]. Desuden kan den quinoxalin struktur hensigtsmæssigt syntetiseres ved et trin kondensation af en diketon forbindelse 1 [23] og en ortho-phenylendiamin (figur 1). Vigtigere, quinoxalin struktur er særdeles amendable for kemiske modifikationer med forskellige substituenter for avanceret struktur aktivitet undersøgelse for at optimere potentielle biologiske aktivitet. Anticancer aktivitet af dT-QX blev derefter evalueret under anvendelse af et panel af cancerceller. Virkningerne af dT-QX om inhibering af DNA-syntese og inducere cellulær oxidativ stress blev også undersøgt. Endelig blev hæmning af tumorvækst ved dT-QX vurderet i mus med subkutane levertumorer.

Materialer og metoder

Syntese

Alle kemikalier blev købt fra Sigma-Aldrich (WI, USA), J K Scientific Ltd (Beijing, Kina), eller Sinopharm Chemical Reagent Co, Ltd (Shanghai, Kina) og anvendes uden yderligere rensning. NMR-spektre blev optaget med Bruker Avance-400 NMR-spektrometer (Madison, WI, USA). Forkortelser anvendt til opdelingen mønstre af proton NMR-signaler er: singlet (s), dublet (d), triplet (t), kvartet (q), kvintet (qui), multiplet (m) og bredt signal (br). Elektrospray ioniseringsmassespektroskopi (ESI-MS) analyse blev udført med en Thermo Fisher TSQ Quantum Max Triple Stage kvadrupolmassespektrometer (MA, USA). Forbindelse 1 blev opnået som tidligere rapporteret [23]

6-brom

N

-.. (Prop-2-ynyl) hexanamid (2)

Til en opløsning 6-bromhexansyre (694 mg, 3,56 mmol) i tør CH

2Cl

2 (50 ml) blev tilsat propargylamin hydrochlorid (300 mg, 3,28 mmol), triethylamin (332 mg, 3,28 mmol) og 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (630 mg, 3,28 mmol). Reaktionsblandingen blev omrørt under N

2 i 16 timer ved stuetemperatur. Den resulterende opløsning blev ekstraheret med CH

2Cl

2 (150 ml x 3). De organiske faser blev opsamlet, vasket med saltvand (250 ml), tørret med magnesiumsulfat

4 og koncentreret. En flash kromatografisk separation (0-40% EtOAc i hexan) gav 2 som 1:01 syn /anti-amid blanding som en farveløs olie (390 mg, 1,68 mmol) i 51% udbytte.

1H NMR (CDC

3, 400 MHz, 01:01 syn /anti):

δ

= 5,71 (br s, 1H; NH), 4,05 (dd,

3J

(H, H) = 5,2 Hz,

4J

(H, H) = 2,5 Hz, 2H; CH

2), 3,53 (t,

3

J

(H, H) = 6,6 Hz, 1 H; 0,5CH

2), 3,40 (t,

3

J

(H, H) = 6,7 Hz, 1H; 0,5CH

2), 2,24-2,19 (m, 3H, CH, CH

2), 1,87 (qui,

3J

(H, H) = 7,2 Hz, 1H; 0,5CH

2), 1,79 (qui,

3J

(H, H) = 7,0 Hz, 1 H; 0,5CH

2), 1,67 (qui,

3J

(H, H) = 7,52 Hz, 2H; CH

2), 1,50-1,41 ppm (m, 2H; CH

2);

13C NMR (CDC

3, 100,6 MHz, 01:01 syn /anti):

δ

= 172,3, 172,2, 79,5, 71,6, 44,8, 36,1, 36,1, 33,5, 32,4, 32,2 , 29,1, 27,7, 26,4, 24,7, 24,5 ppm (fig S1); HRMS beregnet for C

9H

15BrNO [M + H]

232,0337 og [M + 2 + H]

234,0316, fundet 232,0324 og 234.0413.

N

-(Prop-2-ynyl)-6-(4b,8,8-trimethyl-9,10-dioxo-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octahydrophenanthren-2-yloxy)hexanamide (3).

Til en opløsning af 2 (390 mg, 1,68 mmol) i tørt DMF (50 ml) blev tilsat 1 (355 mg, 1,30 mmol) og kaliumcarbonat (1,8 g, 13,0 mmol). Reaktionsblandingen blev omrørt under N

2 i 16 timer ved stuetemperatur og derefter forsuret til pH 5 med 5 N HCI. Den resulterende opløsning blev ekstraheret med CH

2Cl

2 (150 ml x 3). De organiske faser blev opsamlet, vasket med saltvand (250 ml), tørret med magnesiumsulfat

4 og koncentreret. En flash kromatografisk separation (0-40% EtOAc i hexan) gav 3 som en gul olie (320 mg, 0,76 mmol) i 58% udbytte.

1H NMR (CDC

3, 400 MHz):

δ

= 7,53 (d,

4J

(H, H) = 2,9 Hz, 1 H; CH ), 7,35 (d,

3J

(H, H) = 8,8 Hz, 1 H; CH), 7,21 (dd,

3J

(H, H) = 8,7 Hz,

4J

(H, H) = 2,7 Hz, 1 H; CH), 5,94 (br s, 1H; NH), 4,04 (dd,

3J

(H, H) = 5,3 Hz,

4J

(H, H) = 2,6 Hz, 2H; CH

2), 4,00 (t,

3J

(H, H) = 6,4 Hz, 2H; CH

2), 2,65 (s, 1H; CH), 2,53 (d,

3J

(H, H) = 14,3 Hz, 1 H, CH), 2,24 (t,

3J

(H, H) = 7,6 Hz, 2H; CH

2), 2,21 (d,

4J

(H, H) = 2,5 Hz, 1 H; CH), 1,82-1,70 (m, 4H, 2CH

2), 1,56-1,31 (m, 7H; 3CH

2, CH), 1,18 (s, 3H, CH

3), 0,95 (s, 3H, CH

3), 0,38 ppm (s, 3H, CH

3);

13C NMR (CDC

3, 100,6 MHz):

δ

= 199,0, 181,3, 172,4, 158,1, 142,6, 134,6, 126,1, 124,2, 112,6, 71,7, 68,9, 68,1, 41,9, 39,2, 39,0, 36,3, 36,3, 35,5, 31,4, 29,7, 29,2, 28,9, 25,7, 25,2, 24,3, 18,8 ppm (figur S2); HRMS beregnet for C

26H

34NO

4 [M + H]

424,2488, fundet 424.2487.

N

-(Prop-2-ynyl)-6-(4b,8,8-trimethyl-4b,5,6,7,8,8a-hexahydrodibenzo[a,c]phenazin-2-yloxy)-hexanamide (4).

Til en opløsning af 3 (320 mg, 0,76 mmol) i toluen (25 ml) blev tilsat

o

phenylendiamin (103 mg, 0,95 mmol) og silicagel ( 300 mg). Reaktionsblandingen tilbagesvaledes under N

2 i 18 timer og derefter koncentreret. En flash kromatografisk separation (0-40% EtOAc i hexan) gav 5 som et gult fast stof (230 mg, 0,46 mmol) i 61% udbytte.

1H NMR (CDC, 400 MHz

3):

δ

= 8,09-8,07 (m, 3H, 3CH), 7,73-7,67 (m, 2H; 2CH), 7,30 (d,

3J

(H, H) = 8,8 Hz, 1 H; CH), 7,02 (dd,

3J

(H, H) = 8,4 Hz,

4J

(H, H) = 2,8 Hz, 1 H; CH), 5,71 (br s, 1H; NH), 4,14-4,06 (m, 4H, 2CH

2), 2,88 (s, 1H; CH), 2,56 (br d,

3J

(H, H) = 14 Hz, 1H, CH), 2,28-2,23 (m, 3H; CH

2, CH) , 1,89-1,73 (m, 4H, 2CH

2), 1,59-1,47 (m, 7H; 3CH

2, CH), 1,02 (s, 3H, CH

3), 0,99 (s, 3H; CH

3), 0,16 ppm (s, 3H, CH

3);

13C NMR (CDC

3, 100,6 MHz):

δ

= 172,4, 158,0, 154,8, 148,4, 141,9, 141,3, 137,6, 134,8, 129,2, 129,1, 129,0, 128,6, 125,0, 118,1, 111,2, 79,6, 71,6, 67,7, 59,7, 42,0, 37,3, 36,3, 36,1, 36,0, 34,8, 31,5, 29,2, 29,1, 25,8, 25,3, 22,1, 19,0 ppm (fig S3); HRMS beregnet for C

32H

38N

3 O

2 [M + H]

496,2964, fundet 496.2964.

N

-((1-(2-(Hydroxymethyl)-5-(5-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-tetrahydrofuran-3-yl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl)-6-(4b,8,8-trimethyl-4b,5,6,7,8,8a-hexahydrodibenzo[a,c]phenazin-2-yloxy)hexanamide (DT-QX).

Til en opløsning af 4 (100 mg, 0,2 mmol) i 5 ml DMF og 10 ml CH

2Cl

2 blev sat 3′-azido-3′ deoxythymidin (54 mg, 0,20 mmol) og en vandig opløsning af natriumascorbat (40 mM, 15 ml). Reaktionsblandingen blev renset med N

2 i 10 minutter, og CuSO

4 · 5H

2O (8 mg, 0,03 mmol) blev tilsat. Reaktionsblandingen blev derefter omrørt under N

2 ved stuetemperatur i 12 timer. Den resulterende opløsning blev ekstraheret med CH

2Cl

2 (150 ml x 3). De organiske faser blev opsamlet, vasket med saltvand (200 ml), tørret med magnesiumsulfat

4 og koncentreret. En flash kromatografisk separation (0-7% MeOH i CH

2Cl

2) gav dT-QX som et hvidt fast stof (114 mg, 0,15 mmol) i 75% udbytte.

1H NMR (DMSO

d

6

, 400 MHz):

δ

= 11,35 (s, 1 H; OH), 8,34 (t,

3

J

(H, H) = 5,5 Hz, 1 H; CH), 8,14-8,11 (m, 2H; 2CH), 8,06-8,04 (m, 1H; CH), 7,96 (d,

4

J

(H, H) = 2,8 Hz, 1 H; CH), 7,79 (m, 3H, 2CH, NH), 7,39 (d,

3

J

(H, H) = 8,7 Hz, 1 H; CH), 7,11 (dd,

3

J

(H, H) = 8,5 Hz,

4

J

(H, H ) = 2,8 Hz, 1 H; CH), 6,40 (t,

3

J

(H, H) = 6,6 Hz, 1 H; CH), 5,36-5,33 (m, 1H; CH), 5,28 (t,

3

J

(H, H) = 5,2 Hz, 1 H; NH), 4,31 (d,

3

J

(H, H) = 5,5 Hz, 2H; CH

2), 4,18 (m, 1 H; CH), 4,06 (t,

3

J

(H, H) = 6,4 Hz, 2H; CH

2), 3,67-3,60 (m, 2H; CH

2), 2,85 (s, 1H; CH), 2,67-2,57 (m, 2H; CH

2), 2,16 (t,

3

J

(H, H) = 7,4 Hz, 2H; CH

2), 1,79-1,62 (m, 5H, CH

3, CH

2), 1,56-1,43 (m, 10H; 5CH

2), 0,93 (s, 3H, CH

3), 0,91 (s, 3H, CH

3), 0,07 ppm (s, 3H, CH

3 );

13C NMR (DMSO

d

6

, 100,6 MHz):

δ

= 172,0, 163,6, 157,4, 154,2, 150,4, 147,5, 145,2, 141,1, 140,9, 137,1, 136,1, 134,1, 129,5, 129,4, 128,9, 128,4, 125,3, 122,4, 117,7, 110,8, 109,5, 84,4, 83,8, 67,4, 60,6, 59,0, 58,5, 41,2, 37,0, 36,8, 35,5, 35,1, 34,9, 34,4, 34,0, 31,3, 28,5, 25,2, 24,9, 21,6, 18,5, 12,2 ppm; HRMS beregnet for C

42H

51N

😯

6 [M + H]

763,3932, fundet 763.3959 (Tal S4 og S5).

4b, 8, 8-trimethyl-9,10-dioxo-4b, 5,6,7,8,8a, 9,10-octahydrophenanthren-2-yl 4-methyl-piperazin-1-carboxylat (5).

til en opløsning af 1 (650 mg, 2,39 mmol) i DMF (30 ml) blev tilsat 4-methyl-1-piperazinecarbonyl hydrochlorid (630 mg, 3,16 mmol) og kaliumcarbonat (3,4 g, 24 mmol). Reaktionsblandingen blev omrørt under N

2 i 18 timer og derefter forsuret til pH 5 med 5 N HCI. Den resulterende opløsning blev ekstraheret med CH

2Cl

2 (150 ml x 3). De organiske faser blev opsamlet, vasket med saltvand (250 ml), tørret med magnesiumsulfat

4 og koncentreret. En flash kromatografisk separation (0-25% EtOAc i hexan) gav 5 som en gul olie (730 mg, 1,83 mmol) i 77% udbytte.

1H NMR (CDC

3, 400 MHz):

δ =

7,86 (s, 1H; CH), 7,49 (s, 2H; 2CH), 3,71 (br s, 2H; CH

2), 3,61 (br s, 2H; CH

2), 2,69 (s, 1H; CH), 2,58 (d,

3

J

(H, H) = 13,3 Hz, 1 H; CH), 2,49 (br s, 4H, 2CH

2), 2,37 (s, 3H, CH

3), 1,47-1,42 (m, 5H, 2CH

2, CH ), 1,23 (s, 3H, CH

3), 0,98 (s, 3H, CH

3), 0,41 ppm (s, 3H, CH

3);

13C NMR (CDC

3, 100,6 MHz): δ 198,2, 180,6, 152,5, 149,8, 147,4, 134,6, 129,4, 126,3, 122,5, 68,7, 53,7, 53,6, 41,7, 39,5, 38,7, 36,2, 36,1 , 35,5, 31,2, 26,9, 24,2, 24,2, 18,7 ppm (fig S6); HRMS beregnet for C

23H

31N

2O

4 [M + H]

299,2284, fundet 299,2294.

4b, 8,8-Trimethyl-4b, 5,6,7,8,8a-hexahydrodibenzo [a, c] phenazin-2-yl 4-methylpiperazin-1-carboxylat (Pip-QX).

til en opløsning af 5 (330 mg, 0,83 mmol) i toluen (25 ml) blev tilsat

o

phenylendiamin (100 mg, 0,92 mmol) og silicagel (300 mg). Reaktionsblandingen tilbagesvaledes under N

2 i 18 timer og derefter koncentreret. En flash kromatografisk separation (0-3% MeOH i CH

2Cl

2) gav Pip-QX som en gul olie (310 mg, 0,66 mmol) i 79% udbytte.

1H NMR (DMSO

d

6

, 400 MHz):

δ

= 8,14-8,05 (m, 3H, 3CH), 7,81-7,79 (m, 2H , 2CH), 7,49 (d,

3

J

(H, H) = 8,4 Hz, 1 H; CH), 7,29 (dd,

3

J

(H , H) = 8,4 Hz,

4

J

(H, H) = 2,4 Hz, 1 H; CH), 3,63 (br s, 2H; CH

2), 3,46 (br s , 2H; CH

2), 2,88 (s, 1H; CH), 2,58 (m, 1 H; CH

2), 2,38 (br s, 4H, 2CH

2), 2,16 (s, 3H; CH

3), 1,51-1,38 (m, 5H, 2CH

2, CH), 0,96 (s, 3H, CH

3), 0,90 (s, 3H, CH

3 ), 0,06 ppm (s, 3H, CH

3);

13C NMR (DMSO

d

6

, 100,6 MHz):

δ

= 154,4, 153,3, 150,5, 147,5, 142,3, 141,6, 134,7, 130,2, 130,2, 129,4, 129,0, 125,7, 125,2, 119,3, 58,9, 54,7, 54,6, 46,2, 44,6, 44,0, 41,6, 37,7, 36,1, 35,4, 34,7, 31,8, 22,2, 19,0 ppm (fig S7); HRMS beregnet for C

29H

35N

4O

2 [M + H]

471,2760, fundet 471,2767.

Biologisk Studies

Dyret protokollen blev godkendt af korrekturruden udvalg af College of Life Science and Technology ved Huazhong Universitet for Videnskab og Teknologi. Cancercellelinier HepG2, Hep3B, MCF-7 og C6 blev opnået fra ATCC (VA, USA). Humane leverceller HL-7702 og murine liver kræftceller H22 var fra Shanghai Institute of Life Science Cell Culture Center (Shanghai, Kina). Celler blev holdt i høj glucose DMEM eller RPMI-1640-medium (Invitrogen, CA, USA) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 25 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 1,0 mM natriumpyruvat, 50 U /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin ved 37 ° C og 5% CO

2. Stamopløsninger af dT-QX, Pip-QX eller AZT blev fremstillet i DMSO, og doxorubicin hydrochloridsalt blev direkte opløst i vand. Alle biologiske kemikalier blev opnået fra Sigma-Aldrich (WI, USA), medmindre andet er angivet. Alle eksperimenter blev uafhængigt gentages mindst tre gange.

Cellelevedygtighed MTT assay.

Celler (5.000 pr brønd) blev podet på plader med 96 brønde i vækstmedier natten over, før hver behandling i tre eksemplarer. dT-QX, Pip-QX eller AZT var i en slutkoncentration på 0, 0,1, 1, 10, 20, 50, 100 eller 200 uM med total DMSO mindre end 0,2%. Doxorubicin blev anvendt som en sammenligning ved en slutkoncentration på 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 eller 2,0 uM. Efter 72 timer blev MTT-assay udført som beskrevet [23]. Cellelevedygtigheden af ​​hver behandling blev afbildet med GraphPad Prism program, og IC

50 værdier blev opnået under anvendelse sigmoidal dosis-respons-analyse, som softwaren (version 4.00, GraphPad Software, CA, USA).

anti-BrdU-fluorescens-assay.

Hep3B, HepG2 eller HL-7702 celler (50.000 per brønd) udsået i vækstmediet natten over på plader med 48 brønde og behandlet med 0, 10 eller 50 uM dT-QX for 5 timer. Anti-BrdU-assay blev udført ifølge producentens anbefalinger (BD Biosciences, NJ, USA). Kort beskrevet blev BrdU-opløsning (0,1 mg /ml) til hver brønd, og cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 3 timer. Cellemedium blev fjernet, og cellerne blev fikseret med 3,7% formaldehyd i PBS. Celler blev permeablized med 0,1% triton-100 i PBS og blokeret med 3% FBS i PBS-opløsning. Cellulært DNA blev denatureret ved DNasel (0,3 mg /ml) i PBS-opløsning. Den inkorporerede BrdU blev farvet med Alexa Fluor®488 anti-BrdU-monoklonalt antistof (BD Biosciences, NJ, USA). Kernerne blev counter-farvet med Hoechst 33342 løsning. Cell billeder af hver behandling blev fanget med Olympus IX71 omvendt mikroskop udstyret med et digitalt kamera under passende lys. Virkningerne af Pip-QX og AZT på DNA-syntese i Hep3B blev vurderet på samme måde som beskrevet ovenfor.

Fluorescens undersøgelse af mitokondrie superoxid produktion.

Hep3B eller HL-7702 celler (50.000 per brønd ) blev podet i vækstmediet natten over på plader med 48 brønde. Celler blev behandlet med 0 eller 50 uM dT-QX i 8 timer og derefter blev mediet fjernet. En opløsning af MitoSOX Red mitokondrie superoxid indikator (Invitrogen, CA, USA) i PBS blev tilsat og inkuberet ved 37 ° C i 20 min. Celler blev derefter vasket en gang med PBS og modfarvet med Hoechst 33342-opløsning. Fluorescerende billeder blev taget med Olympus IX71 omvendt mikroskop under passende lys. Undersøgelsen med 100 uM Mn (III) tetrakis (1-methyl-4-pyridyl) porfyrin tetratosylate hydroxid (MnTmPyP, EMD Chemicals, Inc., USA) som en positiv kontrol på Hep3B celler blev udført på lignende måde.

Subkutan levertumor studie i mus.

Murine liver kræftceller H22 blev oprindeligt opretholdt i RPMI-1640 vækstmedium og derefter vokser i BALB /c mus (Hubei Provincial Laboratory Animal center, Kina) intraperitonealt. Mus blev aflivet efter 4 dage og H22 celler blev høstet med PBS-opløsning. H22-celler blev vasket en gang med sterilt PBS og blev injiceret subkutant (3×10

6 celler per mus) ved den nedre ryg af naive BALB /c-mus. Når tumorerne nåede en gennemsnitlig størrelse på (8×8 mm, 340 mm

3), blev ni mus tilfældigt opdelt i tre grupper (3 pr gruppe) og injiceret med 100 pi saltvand (med 0,1% DMSO), AZT (50 uM i sterilt PBS med 0,1% DMSO) eller dT-QX (50 uM i steril PBS med 0,1% DMSO) på tumorstedet på dag 1 og dag 7. tumorvækst og legemsvægt blev overvåget dagligt. På dag 12 efter den første injektion blev alle mus aflivet og billeder af tumorer blev registreret. Statistik analyse (enkelt ANOVA med Tukeys multiple sammenligning test) af de behandlinger blev udført ved hjælp af GraphPad Prism software.

Resultater og Diskussion

Syntese af dT-QX blev opnået ved at koble AZT med phenylquinoxaline 4 via kobber (I) -catalyzed klik reaktion (figur 2). Mellemprodukt 3 blev opnået fra nukleofil substitution af bromoalkyne 2 med oxideret terpenone 1. Phenylquinoxaline 4 blev opnået ved kondensation med

o

-diaminobenzene og silicagel under tilbagesvaling i toluen, som var meget bedre end acetonitril, DMF eller ethanol. Konjugeringen af ​​AZT med phenylquinoxaline 4 til dT-QX udførtes i 75% udbytte under anvendelse af in situ reduktion af kobber (II) ved ascorbat [20], [21]. Phenylquinoxaline 4, en reference molekyle, viste sig at være dårligt opløseligt i 1% DMSO vandig opløsning og dermed blev modificeret til en

N

-methylpiperazin derivat Pip-QX som vist i figur 2. Pip-QX blev syntetiseret i en måde svarende til dT-QX via omdannelse af 1 til piperazinderivat 5, efterfulgt af kondensation med

o

-diaminobenzene i et samlet udbytte på 61%. Pip-QX tjente som en af ​​referencestoffer i følgende biologiske undersøgelser. Flere batcher af dT-QX og kontrol forbindelser blev syntetiseret, og alle batches udføres konsekvent ikke kun i kemi, men også i biologiske undersøgelser.

Den biologiske aktivitet af dT-QX blev først vurderet ved anvendelse af cellelevedygtighed assay på et panel af cancercellelinjer herunder human lever carcinoma HepG2 og Hep3B, muselever carcinoma H22, brystadenocarcinom MCF-7, og rotte hjerne gliom C6-celler. Human lever HL-7702-cellelinje blev anvendt som repræsentant for normale celler i undersøgelsen. HL-7702 celler transformeres humane normale hepatocytter med lav ekspression af kræft markører [24]. Behandling af HL-7702 med dT-QX ikke resulteret i nogen væsentlig cytotoksicitet ved koncentrationer så høje som 200 uM (figur 3a). EF

50 af dT-QX på alle kræftceller blev fundet at variere fra 6,6 til 42,1 uM. Den mest udtalte cytotoksicitet blev observeret på humant hepatocellulært carcinom Hep3B celler med mere end 80% celledød ved 20 uM, efterfulgt af bryst adenom MCF-7 og hjerne gliom C6-celler. I stærk kontrast, Pip-QX ikke-selektivt dræbt alle cellelinjer, herunder HL-7702 ved 50 uM (figur 3b). Det andet referencestof, AZT som en 3′-deoxythymidin analog, viste sig at udvise lav cytotoksicitet mod disse cellelinier (figur 3c), medens co-behandling af AZT plus Pip-QX også ikke-selektivt dræbte alle cellelinjer (fig 3d ), svarende til den i Pip-QX-behandling alene. Disse resultater tydede på, at den selektive drab af cancerceller i normale leverceller ved dT-QX skyldtes den unikke kovalent konjugering af cytotoksisk phenylquinoxaline del med 3′-deoxythymidin. Til sammenligning blev anticancer narkotika doxorubicin fundet stærkt giftige for alle disse celler. Faktisk doxorubicin var endnu mere giftige mod normal lever 7702 celler end leverkræft Hep3B eller H22 celler i koncentrationer på over 0,5 uM (figur 3e).

Et panel af kræft cellelinier (sort farve) og en normal lever hepatocyt-cellelinie (rød farve) blev behandlet med a) dT-QX; b) Pip-QX; c) AZT; d) Pip-QX plus AZT og e) doxorubicin, hhv. Cellelevedygtighed blev vurderet efter 72 timers inkubation ved MTT-assayet. Den procentvise levedygtighed blev beregnet og monteret med dosisresponskurver under anvendelse af GraphPad Prism software. Alle behandlinger blev udført in triplo og gentaget mindst tre gange.

For yderligere at forstå den selektive cytotoksicitet af dT-QX dybt cancerceller, vi først undersøgt celleproliferation ved anvendelse af anti-BrdU-fluorescens-assay. BrdU (5-brom-3′-deoxyuridin) er en thymidin-analog, der er inkorporeret i celle genom som den gentager [25]. Således er niveauet for BrdU i cellekerne afspejler niveauet af celledeling og proliferation. I betragtning af de ovenstående levedygtighed celle resultater, human HL-7702, HepG2 og Hep3B celler blev undersøgt som repræsentanter for normale og kræftceller. Anti-BrdU-assay blev udført ved 5 timer efter dT-QX behandlingen for at tillade tilstrækkelig akkumulering af forbindelse i celler og bestemme dets indvirkning på cellulær DNA-syntese. Niveauet af BrdU i cellekerner blev målt under anvendelse af et fluorescerende anti-BrdU-konjugat [25] (grøn farve) med celle kerner modfarvet med Hoechst 33342 (blå farve) som vist i figur 4.

BrdU assay blev udført efter celler behandlet med forbindelser i 5 timer. Den inkorporeret BrdU blev farvet med anti-BrdU Alexa Fluor®488 monoklonalt antistof (grøn farve) med celle kerner counter-farvet med Hoechst 33342 (blå farve). a) BrdU inkorporering i HL-7702, HepG2 eller Hep3B celler behandlet med DMSO eller dT-QX; b) BrdU inkorporering inHep3B celler behandlet med DMSO, AZT eller Pip-QX.

I normale humane HL-7702 celler, behandlinger af DMSO og dT-QX resulterede i tilsvarende niveauer af BrdU inkorporering i cellekerner , hvilket indikerede tilstedeværelsen af ​​dT-QX ikke forstyrre celledeling og proliferation. Imidlertid blev signifikant tab af grøn fluorescens iagttaget i kræft HepG2 og Hep3B celler med dT-QX behandling sammenlignet med den for DMSO-kontrol (figur 4a). Disse resultater indikerede, at dT-QX selektivt inhiberes cellulære DNA syntese af HepG2 og Hep3B celler på det tidlige stadium af behandlingen resulterer i selektivt drab begge cancerceller. Inhiberingen af ​​BrdU-inkorporering var meget mere udtalt på Hep3B celler med fuldstændigt tab af grøn fluorescens i celle kerner (figur 4a). Dette var i overensstemmelse med cellelevedygtighed resultater, dT-QX var mere effektiv til at dræbe Hep3B end HepG2-celler. Den mere udtalte cytotoksicitet på Hep3B celle end HepG2 kan skyldes det faktum, at Hep3B er stammer fra hepatitis B-infektion [26].

For at belyse hvilken chemophore af dT-QX var ansvarlig for inhiberingen af ​​DNA-syntese, anti-BrdU-fluorescens-assay blev udført med AZT eller Pip-QX på Hep3B celler (figur 4b). Behandling af AZT medførte nogen signifikant inhibering af DNA-syntese, mens Pip-QX signifikant inhiberede DNA-syntese i celler, svarende til den i dT-QX, hvilket indikerer phenylquaxinoline chemophore var ansvarlig for inhiberingen af ​​DNA-syntese iagttaget. I kombination med cellelevedygtighed resultater, foreslås det, at konjugering med 3′-deoxythymidin entydigt modificeret den cytotoksiske phenylquinoxaline chemophore at gøre det mere selektivt mod cancerceller end normale hepatocytter. Disse resultater bekræftede også, at konjugering af quinoxalin-delen med 3′-triazol-3′-deoxythymine førte til selektivt at målrette kræftceller ved at blokere deres DNA-syntese.

Den selektive hæmning af nuklear DNA-syntese af dT-QX i kræft celler førte til den hypotese, at dT-QX selektivt kan inhibere mitokondrisk DNA-syntese og forårsage mitokondriel dysfunktion samt. Desværre, anti-BrdU fluorescenstest var ikke følsom nok til at observere en sådan inhibering i celler. Alternativt har mitokondriel dysfunktion på grund af DNA tømt af nukleosidanaloger blevet rapporteret at forekomme i takt med forhøjet superoxid niveau i mitokondrier efter behandling i 4 dage [27]. Derfor blev virkningen af ​​dT-QX på mitokondriefunktionen vurderet ved anvendelse af en fluorescens baseret mitokondrie superoxid imaging assay. Hep3B celler blev undersøgt som repræsentant for kræftcellen model på grund af den udtalte hæmning af DNA-syntesen på et tidligt tidspunkt af dT-QX observeret i anti-BrdU assay (figur 4a).

Betydelig rød fluorescens indikerer superoxid produktion blev påvist i Hep3B celler efter behandling af 50 uM dT-QX i 8 timer sammenlignet med den DMSO (figur 5). Den cytosoliske tilstedeværelse af røde farvning af superoxid blev bekræftet ved counter-farvning cellekerner med Hoechst farvestof. Det blev også fundet, at behandling af Hep3B celler med dT-QX i kortere tid, såsom 3 eller 5 timer ikke inducere signifikant rød fluorescens, hvilket tyder på produktion af mitokondrie superoxid var akkumulerende og var sandsynligvis på grund af hæmning af cellulær DNA-syntese. Desuden er en positiv kontrol med en Mn (III) -chelator virker som et NADPH /GSH: O

2

– oxidoreductase i celler [28] resulterede i et tilsvarende niveau for rød fluorescens i Hep3B celler til denne behandlede med dT-QX (se figur S8). I modsætning hertil blev lav baggrund rød fluorescens observeret i humane normale HL-7702-celler behandlet med dT-QX, svarende til den, behandles med DMSO (figur 5). Således er disse resultater antydede, at dT-QX kan forårsage mitochondrial dysfunktion ved at inducere mitokondrie superoxid stress i cancerceller efter inhibering af DNA-syntese.

cancercellelinie Hep3B eller normale HL-7702-celler blev behandlet med DMSO eller 50 pM dT-QX i 8 timer. Niveauet af mitokondrie superoxid blev påvist med MitoSOX superoxid indikator mitokondrie (rød farve). Cellekerner blev counter-farvet med Hoechst farvestof (blå farve).

En foreløbig in vivo antitumor studie med dT-QX blev udført i en musemodel. Subkutane tumorer blev etableret med murine H22 liver kræftceller [29]. Tumorer fik lov til at nå en gennemsnitlig størrelse på 8,8 × 8,8 mm. Den relative lave opløselighed af dT-QX i PBS-opløsning begrænset indgivelsesvejen at være intra-tumor injektioner. Således AZT eller dT-QX (100 pi × 50 uM hver) blev injiceret direkte ind i tumorer på dag 1 og dag 7. Uanset behandlinger, hverken mus døde heller ikke var der et betydeligt vægttab observeret under 12-dages-undersøgelse. Den tumorvækst profil over 12 dage efter den første injektion er vist i figur 6a. Tumorer i mus behandlet med AZT voksede hurtigt, svarer til dem af den negative kontrol (saltvand); mens væksten af ​​tumorer var signifikant inhiberet i dT-QX-behandlede mus (figur 6a). På dag 12 efter den første injektion, størrelsen af ​​tumorer hos mus injiceret med dT-QX var klart mindre end dem med AZT eller saltvand (figur 6b). Statistik analyse bekræftede også, at behandlingen af ​​dT-QX var signifikant forskellig fra de to andre (

P

0,01). Disse resultater antydede, at intra-tumor injektion af dT-QX ved en lav dosis (svarende til 0,13 mg /kg per mus) var ganske effektiv til at hæmme væksten af ​​subkutane tumorer i en musemodel.

Subkutan tumor var etableret ved injektion af H22 celle ved lænden af ​​BALB /c mus subkutant (3 × 10

6 celler per mus).