PLoS ONE: Hæmning af Hsp90 øger docetaxel i kastrere Resistant Prostata Cancer

Abstrakt

Første linje behandling af patienter med kastrationsniveau resistent prostatacancer (CRPC) involverer primært administration af docetaxel kemoterapi. Desværre, modstandsdygtighed over for docetaxel er en ultimative begivenhed. Ændringer i androgen receptor (AR) udtryk og signalering er forbundet mekanismerne bag resistens mod docetaxel behandling i CRPC. Varmechokprotein 90 (Hsp90) er en molekylær chaperone, som regulerer aktiveringen, modningen og stabilitet af kritiske signalering proteiner involveret i prostatakræft, herunder AR. Denne viden og de seneste fremskridt i sammensatte design og udvikling har fremhævet Hsp90 som en attraktiv terapeutisk mål for behandling af CRPC. Vi har for nylig rapporteret udvikling af en MYC-CaP kastrationsniveau resistente (MYC-CaP /CR) transplantation tumormodel, som udtrykker amplificeret vildtype AR. Inden rapporterer vi, at en anden generation Hsp90 hæmmer, NVP-AUY922, hæmmer cellevækst og væsentligt inducerer celledød i MYC-CaP /CR og PTEN-CAP /CE2 cellelinjer. NVP-AUY922 induceret proteasom nedbrydning af AR, selvom interessant ikke kræver tab af AR protein til at inhibere AR transkriptionel aktivitet. Endvidere NVP-AUY922 øgede docetaxel toksicitet i MYC-CaP /CR og PTEN-CAP /CE2 cellelinjer

in vitro

. Endelig NVP-AUY922 /docetaxel kombinationsterapi i mus med MYC-CaP /CR tumorer resulteret i større antitumoraktivitet sammenlignet med enkelt behandling. Denne undersøgelse viser, at NVP-AUY922 fremkalder potent aktivitet mod AR signalering og forstærker kemoterapi respons i en musemodel af CRPC, giver rationale for den fortsatte kliniske udvikling af Hsp90-hæmmere i kliniske forsøg til behandling af CRPC patienter.

Henvisning : Ku S, Lasorsa E, Adelaiye R, Ramakrishnan S, Ellis L, Pili R (2014) Hæmning af Hsp90 øger docetaxel i kastrere Resistant prostatakræft. PLoS ONE 9 (7): e103680. doi: 10,1371 /journal.pone.0103680

Redaktør: Bandana Chatterjee, University of Texas Health Science Center, USA

Modtaget: 16. juli 2013; Accepteret: 6 jul 2014; Udgivet: 29 juli 2014

Copyright: © 2014 Ku et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist støttet af Department of Defense – PC094159 (LE) og National Cancer Institute – P50 CA58236 (RP). De finansieringskilder har ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne ønsker at erklære følgende konflikter: Roberto Pili har været en betalt konsulent og modtog forskningsmidler fra Novartis. Som sådan ændrer det ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

kastrere resistent prostatacancer (CRPC) er en uhelbredelig og aggressiv prostatakræft (PCA) fænotype. I flere år har den primære behandling mulighed for CRPC været begrænset til docetaxel kemoterapi, som forlænger overlevelsen dog i en begrænset periode [1]. Mens behandlingen af ​​CRPC har været ekstremt udfordrende, har de sidste 2 år oplevet en dramatisk ændring i terapeutiske muligheder for denne sygdom. Den anden linje cabazitaxel [2] immunterapi sipuluecel-T [3], androgen syntese inhibitor abirateronacetat [4], AR antagonisten enzalutamide [5], og radium-223 [6] har alle modtaget nylig FDA godkendelse til behandling af CRPC. Selv om disse nye behandlingsformer har udvidet de behandlinger muligheder for patienter, bæredygtig undertrykkelse af CRPC vækst stadig en primær udfordring og nye behandlingsstrategier er der stadig behov.

Fordi docetaxel er en effektiv terapi, er det stadig et afgørende element for første linje strategi behandling af CRPC. Overvindelse har været en stor klinisk udfordring både erhvervet og iboende modstand mod docetaxel og forbedre behandlingsresultater for patienter med docetaxel modstand er af høj prioritet. Med en større forståelse af de underliggende mekanismer for resistens, er nye terapeutiske muligheder opstår. Dette kan skabe muligheder for monoterapi behandling af docetaxel modstand CRPC eller potentielt ny bevidstgøre CRPC patienter til docetaxel med ny kombination strategier.

Målretning androgen-AR-aksen med abirateronacetat [4] og enzalutamide [5], som monoterapi hos patienter med docetaxel resistente CRPC har vist kliniske fordele. Mens direkte målretning af AR handling primært ønskes, indirekte målretning via hæmning af AR associerede proteiner er en attraktiv tilgang. Den molekylære chaperone Hsp90 er et medlem af varmechokprotein familie [7] og viste sig at være overudtrykt i flere cancertyper, herunder PSA. Hsp90 har over 200 dokumenterede kunder, herunder AR, hvor Hsp90 forhindrer proteasom nedbrydning og stabiliserer AR kropsbygning klar til ligand-aktivering [7]. Fordi Hsp90 interagerer med multiple klient-proteiner, er det opfattes, at inhibering af Hsp90 kan forstærke en større katastrofale antitumorvirkning sammenlignet med mere direkte målrettede behandlinger. I prækliniske studier, Hsp90 hæmning alene [8], [9], eller for nylig, i kombination [10], [11] lovende resultater i behandlingen af ​​PCA celler. Desværre har første generation Hsp90-inhibitorer resulterede ikke i signifikant effekt i kliniske forsøg [12] – [14]. Disse indledende Hsp90-inhibitorer kendt som geldanamycinderivaterne analoger, 17-allylamino-17 demethoxygeldanamycin (17-AAG) og 17- (dimethylaminotheyl-amino) -17-demethoxygeldanamycin (17-DMAG) blev tilskrevet mislykkes i klinikken på grund af dårlig opløselighed og farmakokinetik , hepatotoksicitet, modtagelighed for P-glycoprotein udstrømning og manglende metabolisme ved NQO1 /DT-diaphorase enzymer [15].

NVP-AUY922 (AUY922) er en resorcinlyic isoxazol amid (fig. 1A) vist sig at være en potent inhibitor af Hsp90 [16]. AUY922 er en ikke-geldanamycin analog, og ikke udviser begrænsningerne ved geldanamycinderivaterne analoger hertil gør dette middel mere lovende til klinisk afprøvning. AUY922 medierer sin virkning ved binding af ATPase domæne af Hsp90 N-terminus at inhibere chaperone funktion af Hsp90. Denne handling fører til proteosomal nedbrydning af flere kræft relevante klient proteiner [16], herunder AR [17]. AUY922 har vist anti-tumor-aktivitet i en række af fast tumor prækliniske musemodeller, herunder PC3 prostatacancercelle og xenografter [16], [18]. Senest har en ny generation af Hsp90-inhibitorer, herunder AUY922 blevet rapporteret at opnå biologiske reaktioner i prostata cancer-cellelinjer og human prostatacancer væv sammenlignet med geldanamycin analogen 17-AAG [17]. Fase I og II studier i blodkræftsygdomme og solide tumorer, herunder brystkræft og myelomatose, er i gang med AUY922.

(A) Kemisk struktur af NVP-AUY922. (B) kastrere resistente (MYC-CaP /CR og PTEN-CaP /CE2) cellelinier blev behandlet med angivne koncentrationer af AUY922 for 48 timer. Adhærerende celler blev fikseret med 70% EtOH. Cellevækst blev bedømt ved farvning fikserede celler med krystalviolet og måling af absorbansen ved 570 nm. Hvert punkt blev normaliseret til den ubehandlede kontrol (0) og er repræsenteret ved 3 uafhængige eksperimenter, gennemsnit ± SE. (C) MYC-CaP /CR og PTEN-CaP /CE2 celler blev behandlet med angivne koncentrationer af AUY922 i 48 timer. Adhærente og ikke-adhærente celler blev opsamlet og vasket i 1 x PBS. Celler blev inkuberet med propidiumiodid og celledød blev vurderet ved flowcytometri. Hvert punkt repræsenterer middelværdi ± SE for 3 uafhængige eksperimenter. * Angiver p 0,05 sammenlignet med ubehandlede kontrol (0), ved to-halet t-test

Formålet med denne undersøgelse var at teste evnen af ​​AUY922 til at antagonisere den transkriptionelle og /eller protein. stabilitet af AR i kastrationsniveau resistent MYC-CaP /CR og PTEN-CAP /CE2 prostatakræft-cellelinier samt en transplantation musemodel for nylig udviklet i vores laboratorium [19], [20]. Endvidere ønskede vi at undersøge antitumor og terapeutiske virkning AUY922 som enkeltstof og i kombination med docetaxel kemoterapi.

Materialer og metoder

Etik Statement

Instituttet Animal Pleje og brug Udvalg (IACUC) ved Roswell Park Cancer Institute (RPCI) godkendte alle mus protokoller, der anvendes i denne undersøgelse. Vores godkendelse /protokol-id er 1137M.

Cell kultur og reagenser

Isolering af en kastrat resistent MYC-CaP cellelinje.

MYC-CaP /CR-cellelinje var genereret fra vores tidligere rapporteret MYC-CaP kastrationsniveau resistente transplantation tumor model [19]. MYC-CaP /CR tumorstykker (-4 mm

2) blev anbragt i en 6 brønds dyrkningsplade og fjernes efter at være dyrket i 24 timer i DMEM høj glucose medier (10% FBS; 1% penicillin /streptomycin). Adhærerende celler var en blandet population af MYC-CaP /CR tumorceller og fibroblaster. Disse celler blev dyrket til ca. 80% sammenflydende. Seriepassage af disse heterogene kulturer blev udført, indtil en homogen monolag af MYC-CaP /CR-celler var til stede. MYC-CAP /CR cellelinier blev efterfølgende dyrket i DMEM-medium (Gibco) suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin ved 37 ° C, 5% CO

2. PTEN-CaP /cE2cE2 celler blev en venlig gave fra Dr. Roy-Burman (University of California, Los Angeles) og dyrket i DMEM-medium (Gibco) suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin ved 37 ° C, 5% CO

2. PC3-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) og opretholdt i RPMI 1640-medier (Gibco) suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin ved 37 ° C, 5% CO

2.

for

in vitro

eksperimenter, NVP-AUY922 (Novartis) blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) til fremstilling af stamopløsninger (10 mM). Det syntetiske androgen, methyltrienolone (R1881; Sigma-Aldrich), blev opløst i ethanol til fremstilling af stamopløsninger (10 mM). Den proteasominhibitor, MG132 (Sigma-Aldrich), blev opløst i DMSO til fremstilling af stamopløsninger (10 mM). Oversættelsen inhibitor, cycloheximid (Sigma-Aldrich), blev opløst i ethanol til fremstilling af stamopløsninger (5 mg /ml). Antistoffer anvendt til immunoblotting og /eller immunhistokemi (IHC) var anti-androgen receptor (Santa Cruz), GAPDH (Cell Signaling), c-myc (Epitomics) og aktiveret caspase 3 (Cell Signaling). For

in vivo

undersøgelser, docetaxel blev opnået fra Roswell Park Cancer Institute apotek og fortyndet til 1 mg /ml i PBS før indgivelse til dyr. NVP-AUY922 blev opløst i 5% dextrose i destilleret vand (D5W) i en koncentration på 4 mg /ml.

cellevækst og celledødsassays

MYC-CaP /CR eller Pten- CaP /CE2 celler (4 × 10

4 /ml) blev efterladt til at adhærere natten over i 24-brønds plader (BD Biosciences) og inkuberet med angivne koncentrationer af NVP-AUY922 i 24 og 48 timer. Cellevækst blev målt ved fiksering og farvning af adhærente celler med 10% methanol i krystalviolet i 30 minutter. Farvede celler blev gjort opløselige i absolut methanol og absorbansen blev detekteret ved en emissionsbølgelængde længde på 570 nm. Levedygtighed (celledød) blev målt ved at inkubere adhærente og ikke-adhærente celler med 1 ug /ml propidiumiodid (Sigma-Aldrich) optagelse og kvantificeret med en FACS Caliber flowcytometer.

Western blot-

MYC-CaP /CR eller PTEN-CaP /CE2 celler blev vasket i PBS og lyseret i RIPA buffer (Sigma-Aldrich) indeholdende 1 × protease og phosphatase inhibitorer (Sigma-Aldrich). Lige store mængder protein blev separeret ved elektroforese under anvendelse 4-15% SDS-PAGE gradientgeler (Bio-Rad) og protein blev overført til nitrocellulosemembraner (Biometra). Sekundære HRP konjugerede antistoffer var fra Dako. Påvisning blev udført under anvendelse af kemiluminescens reagenser (PerkinElmer).

Androgen receptor transskription aktivitet

androgen reaktionsevne status MYC-CAP /CR-celler blev bestemt ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt lentiviral-baseret luciferase rapporteret kit (Cignal Lenti AR Reporter (Luc) kit; SABioscience) ifølge producentens instruktioner

Kvantitativ realtids-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret ved TRIzol (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner.. Et mikrogram af RNA blev anvendt til at udføre cDNA syntese ved iScript cDNA-syntese kit (Bio-Rad). En mikroliter af cDNA-syntese reaktionen blev derefter udsat for PCR-amplifikation ved anvendelse af iQ SYBR green kit (Bio-Rad). PCR signaler blev registreret og analyseret af Bio-Rad CFX Connect real-time PCR detection system. Sekvenserne af primere er: FKBP5 fremadrettet, 5’GCCGACTGTGTGTGTAATGC 3 ‘, og revers, 5’ CACAATACGCACTTGGGAGA 3 ‘; GAPDH fremad, 5 ‘GTCTTCACCACCATGGAGAAG 3’, og omvendt, 5’CAAAGTTGTCATGGATGACCTTGG 3 ‘. ΔΔCt værdier blev beregnet og anvendt til at bestemme fold ændringer i mRNA.

Histologi /Immunhistokemi

Mus blev aflivet ved CO

2-kvælning ved definerede tidspunkter. Tumorvæv blev fikseret i 10% bufret formalin natten over efterfulgt af yderligere 24 timer i 70% ethanol. For antigen hentning blev objektglassene kogt i 10 minutter i 10 mM natriumcitrat pH 6 løsning for alle antistoffer. ImmPRESS påvisningssystem (Vector Laboratories) blev anvendt til påvisning af alle primære antistoffer. Farvning blev visualiseret ved hjælp af 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) (Sigma, Saint Louis, MO, FAST 3,3′-diaminobenzidin) og slides blev modfarvet med hæmatoxylin. Til kvantificering af ICH farvede repræsentative billeder (3-6) blev opnået ved anvendelse af et Zeiss lysmikroskop (Zeiss). Positiv nukleare farvning for c-myc og aktiveret caspase 3 blev kvantificeret ved Aperio ImageScope (v11.1.2.760).

In vivo

dyreforsøg

Instituttet Animal Care og brug Udvalg på Roswell Park Cancer Institute godkendt alle mus protokoller, der anvendes i denne undersøgelse. Mus blev huset i et dyr, der føres på en 12-timers lys /mørke cyklus ved en konstant temperatur (22 ± 2 ° C) og relativ fugtighed (55 ± 15%). Postevand og mad var til rådighed

ad libitum

. FVB-hanmus (4-6 uger gamle) blev erhvervet fra NCI Frederick (Maryland, USA). SCID-mus blev indkøbt fra en i hus koloni opretholdt ved Roswell Park Cancer Institute. Alle mus blev kirurgisk kastreret op til 10 dage før inokulation af tumor. Kirurgisk kastration blev udført ved barbering operationsstedet. Et snit blev lavet i pungen og i tunica af testiklerne med en saks. Testiklerne, sædlederen og fastgjort testikelkræft fedtpude blev fjernet gennem snittet site. Sitet snit vil blive lukket med kirurgiske hæfteklammer. Den LuCaP23 androgen uafhængige (AI) xenograftmodel [21] var en generøs gave fra Dr. Robert Vessella (University of Washington, Seattle WA). Denne model blev opretholdt ved seriel passage af tumorvæv at pre-kastrerede SCID hanmus.

Terapi studier.

Pre-kastrerede FVB hanmus blev podet med MYC-CaP /CR-celler ( 1 × 10

6) suspenderet i PBS ved subkutan injektion. Ligeledes blev pre-kastrerede SCID-mus podet med PC3 (1 × 10

6) celler suspenderet i PBS ved subkutan injektion, eller implanteret med en LuCaP 23 AI tumor stykke (4 mm

2) subkutant. For docetaxel enkelt behandlingsstudierne, tumorbærende mus modtog docetaxel (10-50 mg /kg én gang om ugen, i.p. injektion). For kombinationsstudier modtog tumorbærende dyr køretøj (D5W), docetaxel (10 mg /kg en gang ugentlig, i.p. injektion), NVP-AUY922 (40 mg /kg, 5 dage på 2 dage fra; i.p. injektion) eller kombination. I alle undersøgelserne blev mus vejet ugentligt for at overvåge for toksicitet. Tumorvækst blev vurderet ved seriel caliper måling to gange ugentligt.

Statistisk analyse

Data vises som gennemsnit ± SE. Forskelle blev bestemt ved hjælp af en eller to-vejs ANOVA og to-tailed parrede t-tests, hvor der er angivet, ved hjælp af GraphPad Prism software. P-værdier mindre end 0,05 blev tildelt statistisk signifikant.

Resultater

Hvordan reagerer kastrationsniveau resistente prostata kræftceller til AUY922 behandling

in vitro

MYC-CaP kastrere resistente (MYC-cap /CR) og PTEN-CaP kastrationsniveauer resistente (PTEN-CAP /CE2) celler blev udsat i 48 timer til stigende koncentrationer af AUY922. Som vist i fig. 1B, koncentrationer lave nanomolære af AUY922 var tilstrækkelig til at inhibere væksten af ​​MYC-CaP /CR og PTEN-CAP /CE2 celler. Endvidere AUY922 inducerede en dosisafhængig stigning i celledød af MYC-CaP /CR og PTEN-CaP /CE2 celler ved koncentrationer på 50-500 nM baseret på PI optagelse analyse (p 0,05;. Figur 1C).

AUY922 inducerer proteasom nedbrydning af AR og hæmmer AR transkriptionel aktivitet i MYC-CaP /CR og PTEN-CaP /cE2Pten-CAP /CE2 celler

det er dokumenteret, at Hsp90 hæmning ofte resulterer i proteasomet nedbrydning af dets klient proteiner [16]. Vi derfor ønskede at bestemme AR protein stabilitet og /eller transkriptionel aktivitet blev svækket ved AUY922 i vores kastrationsniveauer resistente modeller. MYC-CaP /CR og PTEN-CaP /CE2 celler behandlet med stigende koncentrationer af AUY922 i 48 timer viste en dosisafhængig tab af AR-protein, mest mærkbar i koncentrationer på 100 nM og 500 nM (fig. 2A og 2C). Samtidig behandling med AUY922 og proteasominhibitor, MG132 (0,5 uM), bekræftede, at AUY922 medieret tab af AR-protein var proteasom nedbrydning (fig. 2A). Virkningen af ​​AUY922 på AR transkriptionel aktivitet blev vurderet ved anvendelse af MYC-CaP /CR-celler med stabil ekspression af et luciferase reporter drevet af androgen responselementer (ARE-Luc). MYC-CaP /CR /ER-Luc celler blev inkuberet med stigende koncentrationer af AUY922 og 1 nM R1881 samtidig natten eller forbehandlet med en nM R1881 i 4 timer efterfulgt af stigende koncentrationer af AUY922 natten over. På grund af den konstitutive ekspression af luciferase i PTEN-CaP /CE2 celler vurderede vi mRNA ekspressionsniveauet af AR nedstrøms gen, FKBP5, at undersøge effekten af ​​AUY922 på AR transkriptionsaktivitet. Vores resultater viser, at AUY922 inhiberer AR transkriptionel aktivitet ved lave koncentrationer nanomolære i begge kastrere resistente cellelinier (fig. 2B og 2C). Yderligere viser disse resultater også, at AR proteinnedbrydning ikke kræves for AUY922 at antagonisere AR transkription. Derudover har vi udnyttet cycloheximid at blokere ny proteinsyntese til yderligere tyder på, at lav nanomolær AUY922 er i stand til at reducere AR transkriptionel aktivitet uden at påvirke AR protein niveau (fig. 2D).

(A) MYC-CaP kastreringsområdet resistente celle blev behandlet i 48 timer med stigende koncentrationer af AUY922 eller stigende koncentrationer af AUY922 takt med proteasominhibitor MG132 [0,5 uM]. Ekspression af AR-protein blev vurderet ved Western blot. (B) MYC-CaP /CR cellelinier med stabil transfektion af en AR reporterplasmid (ARE-Luc) blev inkuberet i androgen forarmet celledyrkningsbetingelser i 6 timer. Celler blev behandlet samtidig med 1 nM R1881 og angivne koncentrationer af AUY922 natten over eller forbehandlet med 1 nM R1881 i 4 timer før tilsætning de angivne koncentrationer af AUY992 Luminescens intensitet blev målt og kvantificeret. Kolonner repræsenterer 3 uafhængige forsøg; gennemsnit ± SE. (C) PTEN-CaP /CE2 celler blev behandlet med stigende koncentrationer af AUY922 i 48 timer. Ekspression af AR-protein blev vurderet ved Western blot. Transkriptionsaktivitet AR blev udført ved at måle FKBP5 mRNA-ekspression niveau. Celler blev inkuberet i androgen udtømte celledyrkningsbetingelser i 6 timer, og derefter behandlet samtidig med 1 nM R1881 og angivne koncentrationer af AUY922 natten over. Eksperimenter repræsenterer 3 uafhængige eksperimenter, gennemsnit ± SE. (D) MYC-CaP /CR og PTEN-CaP /CE2 celler blev behandlet samtidigt med 5 ug /ml cycloheximid og stigende koncentrationer af AUY922. Ekspression af AR-protein blev vurderet ved Western blot. GAPDH tjente som protein loading kontrol. Den densitometri blev udført ved billedanalyse j analyse. Tallene blev vist under de bands i forhold til kontrol- celler.

Co-behandling af AUY922 og docetaxel øger celledød af MYC-CaP /CR og PTEN-CAP /CE2 celler

Vi først undersøgt følsomheden af ​​MYC-CaP /CR og PTEN-CAP /CE2 celler til vækst hæmning evner docetaxel. Lægemiddelbehandling udviste evnen til at inhibere cellevækst i koncentrationer lave nanomolære i begge cellelinier (fig. 3A-B).

kastrere resistente cellelinier blev behandlet med angivne koncentrationer af docetaxel og /eller AUY922 i 48 timer. MYC-CaP /CR (A) og PTEN-CaP /CE2 (B) cellelinjer blev behandlet med angivne koncentrationer af docetaxel i 48 timer. Adhærerende celler blev fikseret med 70% EtOH. Cellevækst blev bedømt ved farvning fikserede celler med krystalviolet og måling af absorbansen ved 570 nm. MYC-CaP /CR (C) og PTEN-CaP /CE2 (D) celler blev behandlet med angivne koncentrationer af AUY922 og /eller docetaxel i 48 timer. Celler blev trypinized og vasket i 1 x PBS og inkuberet med propidiumiodid (PI). Procentdele af døde celler (PI positive celler) blev bestemt ved flowcytometri. Kolonner repræsenterer middelværdien ± SE, * angiver signifikant større i kombinationen sammenlignet med behandling med hvert lægemiddel alene (p = 0,03 som bestemt ved envejs ANOVA).

Vi valgte at behandle MYC-CaP /CR-celler i 48 timer med 10 nM AUY922 (en koncentration, hvor AR protein ikke nedbrydes, men AR transkriptionel aktivitet er hæmmet) og 100 nM AUY922 (en koncentration, hvor AR protein er nedbrudt og AR transkriptionel aktivitet er hæmmet) med 500 nM docetaxel. Fig. 3C viser, at kombinationen af ​​10 nM AUY922 med docetaxel øger celledød sammenlignet med behandling med hvert lægemiddel alene. Kombination af 100 nM AUY922 med docetaxel stadig øget celle drab i forhold til hver enkelt behandling dog ikke var signifikant. Endvidere behandlede vi PTEN-CAP /CE2 celler med 30 og 40 nM AUY922 (koncentrationer af AUY922 der ikke drastisk påvirke AR protein udtryk) med 500 nM docetaxel, som viser, at disse kombinationsbehandlinger af AUY922 og docetaxel er i stand til at fremkalde større celledød sammenlignet med hver enkelt behandling (fig. 3D). Disse data indikerer, at Hsp90 potentielt er involveret i den transskriptionelle aktivitet af AR og at forstyrre AR interaktion med Hsp90 via dets inhibering signifikant antagoniserer AR-aktivitet i MYC-CAP /CR og PTEN-CAP /CE2 celler er uafhængige af AR-proteinekspression, giver mulighed for større induktion af celledød i kombination med docetaxel.

MYC-CaP /CR tumorer er resistente over for docetaxel

in vivo

for at vurdere evnen af ​​docetaxel antitumoraktivitet

in vivo

mod MYC-CAP /CR tumorer, kastrerede FVB mus med MYC-CaP /CR tumorer blev behandlet med varierende doser af docetaxel. Som kontroller, vi også behandlet kastrerede SCID-mus der bærer human xenograft tumorer, LuCaP23.1 AI og PC3, som er kendt for at reagere på docetaxel

in vivo

. Fig. 4B og 4C viser, at LuCaP23.1 AI og PC3 tumorer var følsomme over for docetaxel behandling. Endvidere har hver dosis ikke generere signifikant toksicitet under behandling (fig. 4E og 4F). I modsætning hertil MYC-CAP /CR tumorer var resistente over for alle doser af docetaxel behandling (fig. 4A), og toksicitet blev angivet i mus behandlet med 50 mg /kg docetaxel (Fig. 4D).

(A ) MYC-CaP /CR-celler (5 x 10

6), (B) LuCaP23.1 AI tumor luns (-5 mm

2) og (C) PC3 celler (5 x 10

6) blev injiceret eller placeres subkutant i flanken af ​​kastrerede FVB (MYC-CaP /CR) eller SCID (LuCaP23.1 AI og PC3) mus. Behandlingen blev indledt, da tumorer målt ca. 50 mm

2. Docetaxel blev modtaget fra apoteket på RPCI som en vandig opløsning (20 mg /ml) og fortyndet til 1 mg /ml i 1 x PBS dagligt. Mus blev behandlet med docetaxel doser på 10, 25 og 50 mg /kg hver uge ved intra-peritoneal (i.p.) injektion for varighed af 2 cykler (MYC-CaP /CR) eller 3 cyklusser (LuCaP23.1 AI og PC3). Tumorvækst blev overvåget ved seriel tykkelsesmålinger hveranden uge. Tumorstørrelse blev beregnet ved L × W. Alle behandlingsgrupper bestod af 3-4 mus. Hver behandlingsgruppe blev normaliseret til målinger forbehandlings- og omdannes til procent tumorvækst. Hvert punkt repræsenterer middelværdien tumorstørrelse ± SE. (D-F) Alle mus blev vejet 2 gange /uge til overvågning docetaxel toksicitet. Toksicitet blev anset for at være opstået, når musenes kropsvægt blev reduceret ≥20%. Hver kolonne er repræsenteret ved 3-4 individuelle mus /behandling og repræsenteret som procent kropsvægt ændring i forhold til målingerne før behandling, gennemsnit ± SE.

AUY922 nedsætter AR udtryk i MYC-CAP /CR tumorer og kombinerer med docetaxel at øge terapeutiske virkning

anti-tumor aktiviteten af ​​AUY922 og docetaxel

in vivo

blev undersøgt ved at behandle kastreret FVB mus med MYC-CaP /CR tumorer. Tumor bærende mus blev behandlet med vehikel (D5W, 5d på 2d off), AUY922 (40 mg /kg ip: 5d på 2d off), docetaxel (10 mg /kg ip: én gang om ugen) eller kombination for 2 cykler (14 dage) . Ingen signifikant toksicitet blev observeret i alle terapi grupper som det fremgår af kropsvægt målinger (fig. 5B). Som det ses i fig. 5A, sammenlignet med vehikel behandling, en to ugers behandling med AUY922 eller docetaxel alene ikke signifikant reducere tumorvækst. Især kombinationen af ​​AUY922 med docetaxel signifikant ophævet væksten af ​​MYC-CAP /CR tumorer i forhold til hver enkelt behandling (AUY922, p = 0,002, docetaxel, p = 0,009). Endvidere histokemisk analyse af behandlet MYC-CaP /CR tumorvæv for AR udtryk afslørede, at både køretøjer og docetaxel behandlede tumorer viste stærk AR nukleare farvning (fig. 5C). Interessant, AUY922 som en enkelt behandling og i kombination med docetaxel, viste, at Hsp90 hæmning havde en heterogen samlet effekt på tumor AR udtryk. Fig. 5D og 5E viser repræsentative immunfarvning af MYC-CAP /CR tumor sektioner, der viser dele af tumor thatremained positive for AR nukleare udtryk, mens tilstødende sektioner af tumorer udstillet tab af nukleare AR udtryk.

(A) MYC- CaP /CR-celler (5 x 10

6) injiceret subkutant i flanken af ​​kastrerede FVB-mus. Behandlingen blev indledt, da tumorer målt ca. 50 mm

2 (L × B). Mus blev behandlet med vehikel (D5W, ip,

n = 6 fotos), docetaxel (10 mg /kg, ugentlig, ip,

n = 7

), AUY922 (40 mg /kg, 5d på 2d off, ip,

n = 5 fotos) eller kombination (

n = 6 fotos) i 2 uger. Tumorstørrelse blev overvåget ved seriel tykkelsesmålinger hver anden uge. Tumorstørrelse blev beregnet ved L × W. Hver behandlingsgruppe blev normaliseret til målinger forbehandlings- og omdannes til procent tumorvækst. Hvert punkt repræsenterer middelværdien tumorstørrelse ± SE. To-vejs ANOVA: ** p = 0,009 docetaxel versus kombination, p = 0,002 AUY922 versus kombination. (B) Ugentlige kropsvægt målinger tyder på, at behandling ikke var giftigt. Hvert punkt repræsenterer middelværdi ± SE. (C-E) Tumor væv blev opsamlet ved afslutningen af ​​behandlingen, fikseret i 10% normalt pufret formalin og indlejret i paraffin. Fire mikrometer (4 uM) strækninger i tumorvæv blev vurderet ved immunohistokemi for androgen receptor ekspression. Forstørrelse (x40), skala bar = 500 uM. Positiv nuklear farvning for AR blev kvantificeret under anvendelse Aperio imagescope analyse af 6 tilfældige felter ved x40 forstørrelse. Scale bar = 500 uM. Uparret to-halet t-test med Welch korrektion: **** p 0,0001 kombination versus docetaxel; ** P = 0,0016 docetaxel versus AUY922.

AUY922 nedsætter AR transkriptionel aktivitet i MYC-CAP /CR tumorer og kombinerer med docetaxel at øge tumor celledød

For at vurdere aktiviteten af AUY922 på dæmpningen af ​​transkriptionel aktivitet

in vivo

anvendte vi immunfarvning at bestemme ekspressionen af ​​c-myc-transgen, hvilket i denne tumormodel er drevet af AR transkription via en probasinpromotoren [22], [23 ]. Docetaxel behandling inducerede ikke et tab af c-myc-ekspression (42,3%) i forhold til køretøjets behandlede tumorer (41,2%;. Figur 6A), hvilket var i overensstemmelse med AR udtryk i tumorvæv. I modsætning hertil tumorer behandlet med AUY922, frembydes betydelig reduktion af c-myc-ekspression sammenlignet med bærer behandling (42,3% vers 24,6%; p 0,0001) og docetaxel behandling (41,2% vers 24,6%; p = 0,006). Endvidere kombinationsbehandling udviste tilsvarende tab af c-myc-ekspression sammenlignet med AUY922 enkelt behandling, og var signifikant i forhold til docetaxel enkelt behandling (28,7% vers 41,2%; p = 0,03;. Figur 6A).

( A) repræsentant c-MYC immunfarvning. Positiv nukleare farvning for c-myc blev kvantificeret ved hjælp af Aperio imagescope analyse af 6 tilfældige felter ved x40 forstørrelse. Scale bar = 500 uM. To-halet t-test: **** p 0,0001 AUY922 versus vehikel; ** P = 0,006 AUY922 versus docetaxel; * P = 0,03 kombination med docetaxel. (B) repræsentant spaltet caspase-3 immunfarvning. Positiv nukleare farvning for kløvet caspase-3 blev kvantificeret ved hjælp af Aperio imagescope analyse af 6 tilfældige felter ved x20 forstørrelse. Scale bar = 500 uM. To-halet t-test: **** p 0,0001 kombination versus enkelt behandlinger

Væv blev næste vurderet for induktion af celledød ved immunstaining for spaltet caspase-3.. Et lavt niveau af celledød blev observeret i køretøjet behandlede væv (3,3%) uden nogen signifikant stigning i celledød efter docetaxel (2,1%) eller AUY922 (4,4%) enkeltbehandlinger. Men kombinationsbehandling steget markant antallet af spaltede caspase-3 positive tumorceller sammenlignet med docetaxel (14,5% vers 2,1%; p 0,0001) og AUY922 (14,5% vers 4,4%; p 0,0001) enkelte behandlinger (. Fig 6B) .

diskussion

Docetaxel kemoterapi stadig en primær standard for pleje af patienter med kastrationsniveau resistent prostatacancer. Desværre sygdommen skrider frem trods docetaxel behandling eller ikke reagerer på alle. Derfor identifikation af nye lægemidler, som kan øge eller bevidstgøre patienter docetaxel kemoterapi, er stærkt behov for. Mekanismerne bag resistens over for docetaxel er blevet demonstreret at være multifaktoriel i cellelinier og kliniske prøver af forskellige tumortyper [24]. Identificerede mekanismer omfatter nedsat cellulær akkumulering skyldes efflux proteiner, herunder P-glycoprotein (P-gp) /MDR1 og MDR2 [25] og mutationer, der inhiberer docetaxel fra direkte bindende β-tubulin [26]. I denne undersøgelse viser vi, at den anden generation Hsp90 inhibitor AUY922 inducerer kraftig inhibering af AR transkription forbundet med antitumoraktivitet, og øger celledød i kombination med docetaxel i kastrationsniveauer resistent prostata cancercellelinjer. Yderligere viser vi, at AUY922 /docetaxel kombinationsbehandling resulterer i signifikant antitumoraktivitet.