PLoS ONE: Cudrania tricuspidata Stem Extract fremkalder apoptose via ydre bane i SiHa Livmoderhalskræft Cells

Abstrakt

Fokus i denne undersøgelse er de anti-cancer effekter af

Cudrania tricuspidata

stængel ( CTS) ekstrakt på livmoderhalskræft celler. Virkningen af ​​CTS på cellelevedygtigheden blev undersøgt i HPV-positive cervikale cancerceller og HaCaT humane normale keratinocytter. CTS viste signifikante dosisafhængige cytotoksiske virkninger i livmoderhalskræft celler. Der var imidlertid ingen cytotoksisk effekt af CTS på HaCaT keratinocyter ved koncentrationer på 0,125 til 0,5 mg /ml. Baseret på denne cytotoksiske virkning, vi demonstreret, at CTS-induceret apoptose ved nedregulering af E6 og E7 virale onkogener. Apoptose blev detekteret ved DAPI-farvning, annexin V-FITC /PI-farvning, cellecyklusanalyse, western blotting, RT-PCR, og JC-1-farvning i SiHa cervical cancerceller. MRNA ekspressionsniveauer af ydre vej molekyler, såsom Fas, dødsreceptor 5 (DR5), og TNF-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) blev forhøjet med CTS. Endvidere CTS behandling aktiveret caspase-3 /caspase-8 og spaltning af poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). Imidlertid blev de mitokondrielle membranpotentiale og ekspressionsniveauer af indre vej molekyler, såsom Bcl-2, Bcl-XL, Bax og cytochrom C ikke moduleret af CTS. Taget sammen indikerer disse resultater, at CTS-induceret apoptose ved at aktivere ydre vej, men ikke den indre vej, i SiHa cervical cancerceller. Disse resultater antyder, at CTS kan anvendes som et modulerende middel i livmoderhalskræft

Henvisning:. Kwon S-B, Kim M-J, Yang JM, Lee H-P, Hong JT, Jeong H-S, et al. (2016)

Cudrania tricuspidata

Stem Extract fremkalder apoptose via ydre bane i SiHa Cervical Cancer Cells. PLoS ONE 11 (3): e0150235. doi: 10,1371 /journal.pone.0150235

Redaktør: Yi-Hsien Hsieh, Institut for Biokemi og Bioteknologi, TAIWAN

Modtaget: November 24, 2015; Accepteret: 10. februar, 2016 Udgivet: 9 mar 2016

Copyright: © 2016 Kwon et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af grundforløbet (2015R1A2A2A09001137) af National Research Foundation Korea (NRF), https://www.nrf.re .kr /nrf_eng_cms. D.Y. Yoon blev støttet delvist af Priority Research Centers Program (2012 til 0.006.686). Forfatterne er taknemmelige for Pharma Teksol og Chungcheongbukdo Bio CS for deres intellektuelle og økonomisk støtte til dette projekt. Der var ingen yderligere ekstern finansiering modtaget for denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Forfatter Eun Suk Kim er ansat af en kommerciel virksomhed, Chungcheongbukdo Bio CS, og virksomheden yder støtte i form af løn til hende. Men virksomheden har ikke nogen yderligere rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Specifikke rolle denne forfatter artikuleres i »forfatter bidrag« sektion

Forkortelser:. HPV, human papilloma virus; CTS,

Cudrania tricuspidata

dæmme; DR, død receptor; TRAIL, TNF-relateret apoptoseinducerende ligand; PARP, poly (ADP-ribose) polymerase

Introduktion

Livmoderhalskræft er en af ​​de mest almindelige sygdomme, som rammer kvinder verden over og er stadig en stor årsag til dødelighed blandt kvinder i udviklingslandene [1-2 ]. Epidemiologiske og kliniske data antyder, at infektion med human papillomavirus højrisiko (HPV) type, såsom type 16 og 18, spiller en stor rolle i den multifaktorielle ætiologi livmoderhalskræft [3]. HPV oncoproteiner Højrisiko-E6 og E7 spiller en vigtig rolle i at opretholde livmoderhalskræft vækst kræftcelle. Oncoproteiner E6 og E7 inaktivere tumorsuppressorproteiner p53 og pRb henholdsvis [4]. High-risk HPV oncoprotein E6 forbinder med og nedbryder p53, mens HPV protein E7 konkurrerer med E2F for retinoblastoma protein (pRb) bindingssteder [5].

Cudrania tricuspidata

er et løvfældende træ, der tilhører til familien

Moraceae Hoteller, som distribueres primært i Korea, Kina og Japan. Hele

C

.

tricuspidata

plante er blevet udnyttet som en vigtig husråd for kræft i Korea i løbet af de seneste årtier, mens det også er blevet brugt som en traditionel medicin for at kurere neuritis og betændelse i andre dele af Asien [6]. Desuden flere effekter af

C

.

tricuspidata

ekstrakt er blevet rapporteret, herunder antioxidant aktivitet [7] og hæmmende effekt på nitrogenoxid syntase [8]. Men den anti-cancer effekter af ekstraktet af stilken af ​​

C

.

tricuspidata

på livmoderhalskræft celler er ikke blevet undersøgt.

Således målene med denne undersøgelse var at undersøge anti-cancer aktivitet af

Cudrania tricuspidata

stilk (CTS) ekstrakt på HPV-positive cervikale cancerceller og til at undersøge de apoptotiske mekanismer CTS. Her rapporterer vi, at CTS behandling forårsager apoptose via ydre vej, samt gennem undertrykkelse af HPV-16 oncoproteiner E6 og E7 og ændringer i proteinniveauer af p53 og p-pRb.

Materialer og metoder

Reagenser og antistoffer

CellTiter 96 AQ

ueous One Solution celleproliferationsassay Reagent [MTS, 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium] blev indkøbt fra Promega (Madison, WI, USA). Propidiumiodid (PI) og 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) farvning blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). NE-PER Nuclear og cytoplasmiske Ekstraktion Reagenser blev indkøbt fra Pierce (Rockford, IL, USA). Antistoffer specifikke for PARP, caspase-3, caspase-8, p53, Bcl-2, Bcl-XL, Bax, Bid, pRb, p-pRb, og cytochrom C blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Den anti-kanin IgG peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært antistof og anti-muse-IgG HRP-konjugeret sekundært antistof blev indkøbt fra Millipore (Billerica, MA, USA). Antistoffer specifikke for p27, p21, og glyceraldehyd-3-phospahte dehydrogenase (GAPDH) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). JC-1 (5,5 ‘, 6,6′-tetrachlor-1,1′, 3,3’-tetraethyl benzimidazolycarbocyanine chlorid) blev indkøbt fra Enzo (Farmingdale, NY, USA). General-caspaseinhibitor Z-VAD-fmk og caspase-8 inhibitor Z-IETD-fmk blev indkøbt fra R Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA) indeholdende 10% (vol /vol) varmeinaktiveret kalvefosterserum (FBS; Hyclone Laboratories). Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO

2/95,% luft med mættet fugtighed.

Cell levedygtighed analyser

Cell levedygtighed blev vurderet af farvestoffet reduktion MTS assay, som måler mitokondrie respiratoriske funktion. Livmoderhalskræft Celler blev podet (12 × 10

4 celler /ml) i 100 pi medium /brønd i plader med 96 brønde, inkuberet natten over og behandlet med forskellige koncentrationer af CTS, som nævnt i figurteksterne, i 24 timer . Cellelevedygtighed blev beregnet ved at vurdere MTS metabolisme som tidligere rapporteret [10]. Kort fortalt, blev medieprøver (100 pi) fjernet og inkuberet med 100 pi MTS-PMS mix opløsning i 1 time ved 37 ° C. Optisk absorbans blev målt ved 492 nm med en ELISA-læser (Apollo LB 9110, Berthold Technologies GmbH E7, 5′-TGA AGG ACA TGG CTT AGA AGT G-3 ‘(fremad), 5′-GGT GCA AGG GTC ACA GTG TT-3′ (tilbage); TRAIL, 5’-AAG TTT GTC GTC GTC GGG GT-3 ‘(fremad), 5′-TGG TGC AGG GAC TTC TCT CT-3’ (tilbage); Fas, 5’TGA AGG ACA TGG CTT AGA AGT 3 ‘(fremad), 5′-GGT GCA AGG GTC ACA GTG TT-3′ (tilbage); DR5, 5’-CAG AGG GAT GGT CAA GGT CG- 3 ‘, 5′-TGA TGA TGC CTG ATT CTT TGT GG-3′; og GAPDH, 5’-TGG GCT ACA CTG AGC ACC AG-3 ‘(fremad), 5′-GGG TGT CGT TGT TGA AGT CA-3’ (tilbage).

Western blot-analyse

Celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af CTS i 24 timer, høstet, vasket med PBS, og recentrifugeret (1.890 ×

g

, 5 min, 4 ° C). De resulterende cellepellets blev resuspenderet i lysepuffer indeholdende 50 mM Tris (pH 7,4), 1,5 M natriumchlorid, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,25% natriumdeoxycholat, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), og en protease inhibitor cocktail. Cellelysaterne blev inkuberet på is i 1 time og klaret ved centrifugering ved 17.010 x

g

i 30 minutter ved 4 ° C. Proteinindhold blev kvantificeret under anvendelse af et Bradford-assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og et UV-spektrofotometer. Cellelysaterne blev adskilt ved 10-12% SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Proteiner blev overført til polyvinylidendifluorid-membraner (PVDF; Millipore, Billerica, MA, USA), der blev blokeret i 5% fedtfri tørmælk opløses i Tris-bufret saltvand indeholdende Tween-20 (2,7 M NaCl, 53,65 mM KCI, 1 M Tris-HCI, pH 7,4, 0,1% Tween-20) i 1 time ved stuetemperatur. Membranerne blev inkuberet natten over ved 4 ° C med specifikke primære antistoffer. Efter vask blev membranerne inkuberet med de sekundære antistoffer (HRP konjugeret anti-kanin eller anti-mus IgG) i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask blev blots analyseret under anvendelse West-Zol Plus og en western blot-detektionssystem (intron Biotechnology, Sungnam, Sydkorea). Salg

nukleare og cytoplasmatiske fraktionering

CTS-behandlede celler var opsamlet og fraktioneret ved hjælp af NE-PER Nuclear og cytoplasmiske Ekstraktion Reagenser (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA) ifølge producentens protokol.

Analyse af mitokondrie membranpotentiale (MMP)

MMP (Δψ

m) blev evalueret ved JC-1-farvning og flowcytometri. SiHa-celler blev podet i 60 mm dyrkningsskåle (2,5 x 10

5 celler /brønd) og behandlet med forskellige koncentrationer af CTS. Celler blev høstet med trypsin-EDTA og overføres til 1,5-ml rør. JC-1 (5 ug /ml) blev tilsat til cellerne og blandet indtil det var fuldstændigt opløst, hvorefter cellerne blev inkuberet i mørke i 10 minutter ved 37 ° C i en inkubator. Cellerne blev centrifugeret (300 x

g

, 5 min, 4 ° C), vasket to gange med PBS og resuspenderet i 200 pi PBS. Opløsningerne blev delt under anvendelse af en FACSCalibur instrument og analyseret ved CellQuest software (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Hele protokol blev udført i minimalt lys.

Lyddæmpningsplader af endogene HPV 16 E6 og E7 udtryk ved siRNA’er

siRNA’er af E6 og E7 og scrambled siRNA blev købt fra Dharmacon (Dharmacon, Lafayette, CO ). E6 siRNA-sekvensen og E7 siRNA-sekvensen blev anvendt som beskrevet i tidligere rapporteret [11]. For at undertrykke transskription af de endogene HPV16 E6- og E7-generne, SiHa-celler blev forbigående co-transficeret med de syntetiske siRNA’er for HPV16 E6 og E7 eller et nontargeting siRNA anvendelse af lipofectamin RNAiMAX reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner.

Statistisk analyse

data er præsenteret som gennemsnit ± SEM fra mindst tre uafhængige forsøg. Statistisk signifikans blev vurderet med t-test. *

s

0,05 eller **

s

0,005 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Identifikation af phenolforbindelser i CTS

Vi identificerede potentielle lægemidler komponenter (figur 1, tabel 1) og et stort antal klorogensyre (tabel 2) i CTS ekstrakten under anvendelse af HPLC. Tabel 2 viser komponenterne i CTS-ekstrakt, som omfattede chlorogensyre, (+) – catechin, koffeinsyre, phloretic syre, veratric syre, hesperidin, quercetin, og naringenin. CTS ekstrakt indeholdt forskellige phenolsyrer og var rig på chlorogensyre (64,42 mg /g). Chlorogensyre er blevet rapporteret at have anticancer og antioxidant egenskaber [12-15]. Quercetin, hesperidin, og andre phenoliske syrer såsom koffeinsyre er også blevet rapporteret at udvise anti-cancer effekter i flere typer af kræft [16-18]. Disse forbindelser var, til stede i lave koncentrationer i CTS ekstrakt.

sytten slags det phenoliske syre prøvens sammensætning blev analyseret ved at sammenligne spektret af prøve- og standarder komponenter matcher for at skabe en standardkurve fra Peak areal pr komponent at kvantificere mængden af ​​forandringer. (A) De sytten slags reference- phenoliske syreforbindelser. (B)

Cudrania tricuspidata

stilk (CTS) ekstrakt. HPLC-analysen viste tilstedeværelsen af ​​otte forbindelser svarende til 8 af en 17 standard forbindelser. De 5, 7, 11 toppe repræsenterede chlorogensyre, koffeinsyre, og veratric syre henholdsvis. Vejviser

CTS inducerer cytotoksiske virkninger i livmoderhalskræft celler og normale keratinocytter

de cytotoksiske virkninger af CTS blev vurderet i adskillige cellelinjer under anvendelse af MTS-assayet. Livmoderhalskræft cellelinjer og HaCaT normale keratinocytter blev behandlet med forskellige koncentrationer og tidsperioder (fig 2). Som vist i fig 2B, blev levedygtigheden af ​​livmoderhalskræft celler faldt på en dosis- og tidsafhængig måde ved CTS ekstrakt. Levedygtigheden af ​​de CaSki HPV16-positive celler blev reduceret på en tids- og dosisafhængig måde af CTS ekstrakt, men i mindre grad end hos de SiHa HPV16-positive celler. Desuden CTS havde nogen cytotoksisk virkning i HaCaT humane normale keratinocytter koncentrationer på 0,125 til 0,5 mg /ml (Fig 2A). Derfor besluttede vi at foretage en undersøgelse af den mekanisme, der ligger til grund apoptose induceret af CTS-ekstrakt i SiHa cervikal kræftceller.

(A) HaCaT, (B) SiHa og CaSki celler blev behandlet i 24-48 timer med forskellige koncentrationer af CTS ekstrakt, hvorefter cellelevedygtighed blev undersøgt under anvendelse af MTS-assayet. Resultater af * p 0,05 og ** p 0,005 blev betragtet som statistisk signifikant. CTS-behandlede celler blev sammenlignet med kontrolceller.

CTS inducerer morfologiske ændringer og apoptose i SiHa-celler

Fasekontrastmikroskopi viste, at CTS-induceret celledød og morfologiske ændringer i SiHa-celler på en dosis-afhængig måde efter en 24 h behandling (fig 3A). DAPI-farvning blev anvendt til at observere cellekernekondensation, en markør af apoptose. Cellekernekondensation var signifikant og dosisafhængigt forøget i CTS-behandlede celler i sammenligning med den for kontrolcellerne (figur 3B og 3C). Annexin V-FITC /PI-farvning anvendes generelt til at detektere apoptose og nekrose. Apoptose blev yderligere bekræftet ved annexin V-FITC og PI-farvning efter en 24 h behandling med CTS. De SiHa celler behandlet med CTS ved koncentrationer på 0,125 til 0,5 mg /ml i 24 timer viste en signifikant større andel af apoptotiske celler sammenlignet med den for kontrolcellerne, hvilket indikerer, at CTS-induceret apoptose. Der var imidlertid ingen ændringer i CTS behandlede HaCaT celler (Fig 3D).

(A) Mikroskopiske billeder af SiHa-celler behandlet med CTS i 24 timer. Fotografierne er taget af fase-kontrast mikroskopi ved 100 × forstørrelse. (B) Fluorescens mikroskopiske billeder af SiHa-celler behandlet med CTS i 24 timer. Cellekernekondensation og chromatin krympning blev observeret. (C) Data om apoptotiske kerner af hele DAPI farvede celler blev opsummeret som søjlediagrammer. Resultater af *

s

0,05 og **

s

0,005 blev betragtet som statistisk signifikant. (D) Efter behandling med den angivne koncentration af CTS i 24 timer, SiHa og HaCaT celler blev farvet med annexin V-FITC /PI.

CTS hæmmer E6 /E7 udtryk og regulerer ekspressionen af ​​E6 /E7-targeting anti-tumor faktorer

E6 og E7 oncoproteiner er kendt for at forårsage nedbrydning af p53 og pRb hhv. Derfor ville nedregulering af E6 og E7 oncogener forventes at resultere i genoprettelse af p53 og pRb niveauer [19-20]. HPV-16 E6 og E7 mRNA ekspressionsniveauer blev undersøgt ved kvantitativ RT-PCR. E6 mRNA-ekspression blev reduceret i CTS behandlet SiHa-celler sammenlignet med de ikke-behandlede kontrolceller. Derudover blev E7 mRNA-ekspression også faldet (fig 4A). Ekspressionsniveauet af p-pRb blev nedreguleret, men pRb ekspression var uændret i CTS-behandlede SiHa-celler (Fig 4B). CTS dosisafhængigt forøget ekspressionsniveauet af p53, hvilket resulterer i modulering af downstream faktorer p21 og p27. Som vist i fig 4B, blev p21 og p27 ekspressionsniveauer øges på en dosis-afhængig måde af CTS behandling som forventet.

(A) mRNA-niveauer af oncoproteiner E6 og E7, som detekteret ved QRT-PCR. (B) Western blot-analyser af pRb, p-pRb, p53, p21, og p27. SiHa celler blev behandlet med den angivne koncentration af CTS i 24 timer.

CTS hæmmer cellecyklusprogression og modulerer cellecyklus-relaterede faktorer

For at vurdere effekten af ​​CTS på cellecyklus progression, undersøgte vi cellecyklus status ved flowcytometri. I de foregående eksperimenter blev ekspressionsniveauer af p53 og nedstrøms gener p21 og p27 øget efter behandling med CTS (Fig 4B). Sammenlignet med den ikke-behandlede kontrolceller, viste CTS-behandlede celler signifikant og dosisafhængig akkumulering i sub-G1-fasen (fig 5B). Der var imidlertid ingen væsentlige ændringer i populationer af celler i G0 /G1, S og G2 /M faser efter behandling med CTS (Fig 5A).

(A) Cell cyklus profiler af CTS behandlet SiHa celler. (B) Andelen af ​​celler i sub-G1-fasen. Resultater af **

s

0,005 blev betragtet som statistisk signifikant. CTS-behandlede celler blev sammenlignet med ubehandlede celler.

Virkningerne af CTS er uafhængige af indre vej

Mitokondriel dysfunktion er den vigtigste faktor i den indre apoptose pathway. Når mitokondrierne membranpotentiale kollapser, er cytochrom C frigives i cytosolen, hvorefter den danner apoptosome med Apaf-1 og caspase-9 [21]. For at måle mitokondrielle membranpotentiale sammenbrud efter CTS behandling, udførte vi JC-1-farvning og FACS-analyse. Som vist i S1A Fig blev JC-1 top ikke forskydes efter CTS behandling. Desuden viste Western blot analyser, CTS behandling ikke ændrede ekspressionsniveauerne af pro-apoptotisk faktor Bax eller dem af anti-apoptotiske faktorer Bcl-2 og Bcl-XL. Desuden blev cytochrom C ikke frigives i cytosolen (S1B Fig). Således konkluderer vi, at forstærkning af den apoptotiske signal efter CTS behandling er uafhængig af signalering via den intrinsiske apoptose pathway.

CTS-induceret apoptose medieres via dødsreceptor signalering

Fordi vi vist, at iboende apoptose pathway var ikke involveret i CTS-induceret apoptose, vi næste fokuseret på ydre apoptose pathway. Den ydre apoptose pathway modtager signaler gennem binding af ekstracellulære dødsligand proteiner til proapoptotiske dødsreceptorer (DRS) [22]. Den ydre vej transmitterer signaler fra ekstracellulære ligander gennem proapoptotiske DRs til apoptotiske caspase maskiner [23]. Desuden er poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) er involveret i apoptose, samt en række andre cellulære processer. Vi undersøgte ekspressionsniveauer af ydre vej-relaterede faktorer TRAIL, DR5, og Fas i SiHa-celler efter CTS behandling (Fig 6A). Vores resultater viste, at CTS behandling opregulerer mRNA-niveauer af TRAIL, DR5, og Fas. Protein ekspressionsniveauer af caspase-3, caspase-8, PARP, og Bid, blev spaltet på en dosis-afhængig måde af CTS (Fig 6B). Desuden har vi identificeret de specifikke caspaser involveret i pro-apoptotiske mekanisme CTS. SiHa-celler blev forbehandlet med caspaser inhibitorer, herunder en generel caspase-inhibitor og en caspase-8 inhibitor. Som vist i fig 6C, forbehandling med generel caspaseinhibitor Z-VAD-FMK før CTS behandling signifikant blokeret CTS-induceret apoptose. En tilsvarende inhibitorisk virkning på CTS-induceret apoptose blev produceret af caspase-8 inhibitor Z-IETD-FMK. Disse resultater viser, at caspase-3, er caspase-8 og PARP aktiveres via DR-medieret signalering i CTS-induceret apoptose.

(A) mRNA-niveauer af TRAIL, DR5 og Fas som påvist ved QRT-PCR . (B) Western blot-analyse af ydre vej-relaterede faktorer. SiHa-celler blev behandlet med den angivne koncentration af CTS i 24 timer. (C) Western blot analyse af virkningerne af CTS efter forbehandling med generel caspaseinhibitor Z-VAD-FMK eller caspase-8-hæmmer Z-IETD-FMK i SiHa celler.

Nedregulering af E6 og E7 generne forbedret CTS induceret apoptose

For at undersøge om CTS-induceret apoptose ville blive påvirket af E6 /E7 niveauer blev E6 /E7 siRNA transficeret og behandlet med CTS. Apoptose aktiverende proteiner, såsom caspase-3, caspase-8 og PARP blev mere spaltes under E6 /E7 siRNA transfektion og CTS-behandling (figur 7). p-pRb ekspressionsniveauet blev reduceret i E6 /E7 siRNA transficerede SiHa-celler sammenlignet med kontrol siRNA transficerede celler. Imidlertid blev p53-ekspression niveau ikke ændret (figur 7). Disse resultater viser, at CTS kan understøtte induktion af apoptose via nedregulering af E6 /E7 mRNA udtryk.

Western blot-analyse af apoptose-relaterede faktorer efter transfektion af kontrol siRNA eller E6 /E7 målretning siRNA.

diskussion

Hovedformålet med vores undersøgelse var at bekræfte anti-cancer effekt og tilhørende mekanismer af CTS i humane livmoderhalskræft celler. CTS-ekstrakt hæmmede livmoderhalskræft proliferation i HPV-positive SiHa og CaSki celler. Den cytotoksiske effekt af CTS i HPV-16-positive SiHa-celler var lidt bedre end den effekt CaSki-celler (figur 2). Denne virkning kan skyldes den kendsgerning, at antallet af HPV genom kopier i CaSki-celler er højere end den for SiHa-celler [24]. Dette fund tyder på, at det samlede antal HPV kopier i cellerne kan have påvirket deres modtagelighed for de proapoptotiske virkninger af CTS [24]. Derudover demonstrerede vi, at CTS nedreguleret ekspressionsniveauer af onkogener E6 og E7 i HPV-16-positive cellelinier. Som forventet baseret på det nedsat ekspression niveau af E6, bekræftede vi, at p53-ekspression blev øget i dosisafhængig måde. Interessant, nedsat udtryk for E7 var ikke forbundet med ændret pRb udtryk; imidlertid blev p-pRb faldt på en dosis-afhængig måde af CTS (Fig 4B). Dette resultat mindede tidligere rapporter, som viser, at inhibering af E7 resulterede i reduceret phosphorylering af pRb uden at ændre den samlede pRb proteinekspression [20].

CTS ekstrakt indeholder flere phenolforbindelser (Fig 1). Chlorogensyre er til stede ved den højeste koncentration blandt dem. Chlorogensyre er blevet rapporteret at have anticancer, antioxidant, og antidiabetiske virkninger [14, 25-26]. Desuden chlorogensyre er den anden store bioaktive komponent i kaffe efter koffein [25]. Chlorogensyre stimulerer glukose transport i L6 skeletmuskulatur via AMPK aktivering, som bidrager til de gavnlige virkninger for diabetes [25]. Desuden chlorogensyre er en antioxidant, der kan forsinke frigivelse af glukose i blodstrømmen efter et måltid [26]. Desuden kan chlorogensyre inducere cellulær DNA-skader og apoptose i lungecancerceller uden at påvirke normale lungefibroblaster [14]. Men den anti-cancer effekter af chlorogensyre i livmoderhalskræft celler er ikke blevet grundigt undersøgt. Kaffesyre syrer findes i mange naturlige planter [27] og er blevet vist at undertrykke tumorvækst ved at inhibere tumorcelleproliferation og øge antioxidant aktivitet [28]. En tidligere undersøgelse viste, at caffeic syrer hæmmede proliferation, vedhæftning, og migration ved A549 humane lunge kræftceller og HT29-D4 tyktarmskræft celler [29]. Yderligere er hesperidin, naringenin og quercetin blevet rapporteret at udvise anti-cancer effekter i flere cancer celletyper [16-17, 30-31].

Apoptose medieret af indre og ydre veje. Den indre vej medieres af mitokondrisk ydre membran permeabilisering (MOMP) og cytochrom c-frigivelse fra mitochondrier i cytoplasmaet [32-33]. I cytosolen, cytochrom c inducerer samling af apoptosome, som indeholder adapter protein Apaf-1 og apoptose-initierende protease caspase-9. Apoptosome dannelse aktiverer caspase-9, som aktiverer effektor-caspaser [34]. Den ydre vej modtager signaler gennem bindingen af ​​ekstracellulært protein ligander til proapoptotiske DRs placeret på celleoverfladen [23]. Selv om flere DRs er blevet beskrevet, vi fokuseret på Fas (CD95) og DR5 og deres respektive ligander såsom Fas ligand (Fas L) og TRAIL [35]. DRs har et intracellulært død domæne, der rekrutterer adapter proteiner og caspase-8 [36]. Binding af dødsligand til DR resulterer i dannelsen af ​​død-fremkaldende signaler kompleks (DISC), sammensat af død receptoren, FADD og caspase-8 [37]. DISC aktiverer en nedstrøms signaleringskaskade resulterer i apoptose [38-40]. Vi undersøgte hvilke veje er involveret i apoptose induceret af CTS i SiHa cervical cancerceller. Selvom iboende pathway-relaterede faktorer, der ikke er påvirket af CTS behandling (S1 Fig), ekspressionsniveauerne af ydre vej-relaterede faktorer såsom Fas, DR5, TRAIL, og caspase-8, blev ramt af CTS behandling (figur 6).

Vores resultater viser, at CTS har en dyb anti-cancer virkning mod cervicale cancerceller. Dette er den første demonstration af evnen af ​​CTS at inhibere ekspression af HPV-16 E6 og E7 oncogener, og at inducere apoptose medieret af ydre vej i cervicale cancerceller. Dog bør yderligere undersøgelser identificere de specifikke forbindelser i CTS ansvar for sine anticancer effekter.

Støtte Information

S1 Fig. Virkninger af CTS på mitokondrie membranpotentiale og cytochrom c-frigivelse i SiHa cervical cancerceller.

(A) Forskellen i JC-1 farver blev analyseret ved flowcytometri. JC-1 aggregater (orange) er en funktion af raske celler, hvorimod JC-1-monomerer (grøn) er en funktion af apoptotiske celler. (B) Western blot-analyse af anti-apoptotiske faktorer Bcl-2 og Bcl-XL, pro-apoptotisk faktor Bax og cytochrom C i SiHa cervical cancerceller. SiHa celler blev behandlet med den angivne koncentration af CTS i 24 timer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0150235.s001

(TIF)

Tak

Denne forskning var støttet af grundforløbet (2015R1A2A2A09001137) af National Research Foundation Korea (NRF). (https://www.nrf.re.kr/nrf_eng_cms). D.Y. Yoon blev støttet delvist af Priority Forskningscentre Program (2012 til 0.006.686).