PLoS ONE: Den Tab af miR-26a-medieret posttranskriptionel Regulering af cyclin E2 i kræft i bugspytkirtlen Cell Proliferation og Nedsat Patient overlevelse

abstrakt

Baggrund

MIR-26a spiller en kritisk rolle i tumorigenese, enten som en tumorsuppressor eller som et onkogent miRNA, afhængigt af forskellige tumortyper. Men funktionen af ​​MIR-26a i bugspytkirtelkræft er ikke klart belyst. Den foreliggende undersøgelse er designet til at bestemme rollerne for miR-26a i bugspytkirtelkræft og dens association med overlevelsen af ​​patienter med kræft i bugspytkirtlen.

Metoder

udtryk for miR-26a blev undersøgt i 15 par af pancreas kanalen adenocarcinom (PDAC) og deres tilstødende benigne pancreas væv (ABPT), ved QRT-PCR. Resultaterne blev bekræftet af

in situ

hybridisering ved hjælp af to paneler af 106 PDACs og deres ABPT microarray. Foreningen af ​​miR-26a udtryk med den samlede overlevelse blev bestemt. Spredningen og cellecyklus distribution af Capan-2, SW-1990, og Panc-1 celler, transficeret med miR-26a efterligner eller en miR-26a-hæmmer, blev vurderet ved hjælp af Cell Counting Kit-8 assay og flowcytometri hhv. Cellen tumorigenicitet blev evalueret via murine xenograft eksperimenter. Cyclin D2, E2, EZH2, og PCNA-niveauer blev analyseret ved Western blot og immunhistokemi.

Resultater

MIR-26a blev udtrykt i cytoplasmaet i pankreatiske duktale epitelceller, mens dets ekspression var betydeligt nedreguleret i PDAC væv sammenlignet med ABPT. Patienter med lav miR-26a udtryk havde en væsentligt kortere overlevelse end dem med høj miR-26a udtryk.

in vitro

in vivo

analyser viste, at overekspression af miR-26a resulterede i cellecyklusstop, hæmmet celledeling, og nedsat tumorvækst, der var forbundet med cyclin E2 nedregulering.

konklusioner

mIR-26a er en vigtig suppressor af pancreas duktalt karcinom, og kan vise sig at være en ny prognostisk faktor og terapeutisk mål for kræft i bugspytkirtlen behandling

Henvisning:. Deng J, han M, Chen L, Chen C, Zheng J, Cai Z (2013) Den Tab af miR-26a-medieret posttranskriptionel Regulering af cyclin E2 i kræft i bugspytkirtlen Cell Proliferation og Nedsat Patient Survival. PLoS ONE 8 (10): e76450. doi: 10,1371 /journal.pone.0076450

Redaktør: Vincenzo Coppola, Ohio State University Comprehensive Cancer Center, USA

Modtaget: November 16, 2012; Accepteret: August 27, 2013; Udgivet: 8 oktober 2013

Copyright: © 2013 Deng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (projekt nr 81.172.077) og Shanghai biobank netværk af almindelig menneskelig tumorvæv fond (projekt nr 12DZ2295102). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen, især pancreas kanalen adenocarcinom (PDAC), er den fjerde mest almindelige årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan. Med en median overlevelse på mindre end 6 måneder og en gennemsnitlig 5-års overlevelsesrate på mindre end 5%, dødeligheden-incidens ratio for patienter med kræft i bugspytkirtlen er ca. 99%, med ekstremt dårlig prognose [1], [2] . Derfor molekylære mekanismer involveret i tumor malign transformation proces, herunder rolle microRNA (miRNA), skal forstås for den forbedrede diagnosticering og behandling af bugspytkirtelkræft [3], [4].

miRNA er naturligvis forekommende, små, enkelt-strengede, ikke-kodende RNA, der medierer genekspression på post-transkriptionelle og translationelle niveauer i både planter og dyr [5], [6]. Disse molekyler spiller kritiske roller i menneskelige kræftformer såsom kræft i bugspytkirtlen [7], [8], samt i kræft adfærd, herunder dens spredning, invasion, migration, apoptose, og resistens. Den miRNA funktionelle netværk af kræft er relateret til flere aspekter af tumor patogenese [9]. Dette netværk kan bruges til at vurdere diagnose og prognose af kræft samt at vurdere mulige behandlingsmuligheder.

MIR-26a er en gennemprøvet tumor suppressor, der er betydeligt nedreguleret i hepatocellulært carcinom (HCC) [10]. Nedsat MIR-26a-niveauer har været forbundet med dårlig prognose; disse niveauer er prædikative for det terapeutiske respons for patienter med HCC til interferon-α. Desuden har MIR-26a overekspression blevet korreleret med signifikant tumorregression, indikerer, at MIR-26a genindførelse i patienter med cancer kan være en effektiv behandlingsstrategi [11]. Vores tidligere undersøgelse viste, at det tumorspecifikke MIR-26a overekspression, drevet af en hAFP-TERT dual promoter, nedsat levedygtighed af tumorceller i HCC ved at regulere ekspressionen af ​​østrogenreceptoren (ER) -α, progesteron-receptor (PR) , p53, cyclin D2, og E2 [12]. Den præcise sammenhæng mellem MIR-26a og bugspytkirtelkræft fortsat ukendt.

I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi MIR-26a ekspressionsniveauer i humane PDAC væv. Vi bestemt den kliniske betydning af miR-26a nedregulering og dens roller i cellevækst og cellecyklus distribution. Derudover brugte vi en musemodel for at undersøge den potentielle rolle for miR-26a i bugspytkirtlen tumorigenese. Vores resultater giver grundlæggende oplysninger til bedre at forstå patogenesen af ​​kræft i bugspytkirtlen og dens mulige terapeutiske strategier.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev gennemført i overensstemmelse med den Helsinki retningslinjer for menneskelige omfattet undersøgelser og blev godkendt af institutionelle gennemgang bestyrelse Second Military Medical University, Shanghai, Kina. Underskrevet informeret samtykke blev opnået fra alle undersøgelsens deltagere for prøvetagning og analyse. Alle forsøg med dyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg af Anden Military Medical University.

Patienter og vævsprøver

De data om patienter med PDAC blev hentet over en 3-årig periode (januar 2008 til december 2010) fra Institut for Patologi arkiver Changhai Hospital, Second Military Medical University i Shanghai, Kina og Shanghai Biobank Netværk af almindelig menneskelig tumorvæv. Alle patienter blev behandlet med kirurgi, og i alt blev 106 par af prøver fra PDACs og deres ABPT inkluderet. Desuden blev yderligere 15 par PDAC og deres ABPT udtaget fra patienter under kirurgiske resektioner og opbevaret i flydende nitrogen. De kendetegn patient, klinisk præsentation, mellemstationer, laboratorieresultater, behandling, objektiv respons, overlevelse, og andre relevante oplysninger blev opnået fra hospitalet informationssystem. Patienterne blev evalueret ved standardmetoder, herunder deres historie, fysisk undersøgelse, og biokemisk-hæmatologiske tests. Det TNM blev brugt til at bestemme patientens sygdomsstatus.

morfologisk analyse og konstruktion af Tissue Microarray

Alle prøver blev opnået ved kirurgi, fikseret i formalin og indstøbt i paraffin. Sektioner af 4-um tykkelse blev farvet med hematoxylin og eosin før godkendelse tre patologer til de morfologiske træk ved pancreascancer, ifølge World Health Organization klassifikation af fordøjelsessystemet [13]. Tissue microarrays (TMAS) blev konstrueret som tidligere beskrevet [14]; hver microarray indeholdt to paneler af 106 PDACs og deres ABPT der blev arrangeret på kerner 2,0 mm diameter.

Reverse-Transskription Reaction og Quantitative Real-Time PCR (QRT-PCR)

I alt , 15 par af frosne PDACs og deres ABPT prøver (makro-dissekeret) blev anvendt til QRT-PCR ifølge Invitrogen protokol. U6 blev anvendt som den endogene kontrol til at normalisere mængden af ​​total RNA i hver prøve. QRT-PCR blev udført tre gange, med nontemplate kontroller. Den relative udtryk blev beregnet på grundlag af den sammenlignende Ct-metoden (2

-ΔΔ

Ct

) [12]. De primer sekvenser er anført i tabel S1

miRCURY LNA microRNA Detection

in situ

hybridisering og Survival Analysis

Låst nukleinsyre (LNA) -.

in situ

hybridisering (ISH) blev udført på PDAC TMA ved hjælp af den respektive miRCURY LNA ™ sonder mod har-miR-26a eller har-miR-21 (som positiv kontrol) (Exiqon, Vedbæk, Danmark). Disse prober blev anvendt ifølge producentens protokol, som tidligere beskrevet [15]. Kolorimetrisk påvisning blev udført ved at inkubere prøverne i 30 minutter under anvendelse af et substrat-kromogen-opløsning, med 0,04% DAB (DAKO, Danmark) og 0,05% H

2O

2. Snittene blev modfarvet med hematoxylin inden undersøgelsen under anvendelse af et lysmikroskop (Leica, Tyskland) [16].

LNA-ISH resultater blev semikvantitativt vurderet. Baseret på intensiteten af ​​hybridisering blev prøver scoret som “0” for negativ; “1” for svagt positiv; “2” for moderat positiv; og “3” for stærkt positiv. Procentdelen af ​​positive epitelceller blev scoret som “0” for ≤10%; “1” for 11% -25%; “2” for 25% -50%; og “3” for ≥50%. intensitet og procentvise scoringer De blev summeret for at opnå den endelige ISH score, der var klassificeret som “negative” ( 3) eller “positive” (≥3) [17] Salg

LNA-ISH resultater for. blev analyseret yderligere miR-26a eller miR-21 og de kliniske behandlingsdata af 106 patienter. Behandlingen respons på kemoterapi og strålebehandling, herunder patientens kliniske manifestationer, computertomografi (CT), magnetisk resonans imaging (MRI) resultater og CA19-9 niveauer blev objektivt vurderet. Således er alle de patienter, der indgår i undersøgelsen, blev vurderet for deres reaktion på behandlingen, der blev bedømt som “komplet respons”, “delvis respons”, “stabil sygdom”, “progressiv sygdom”, “tidlig død af sygdom eller toksicitet”, og så videre.

cyclin D2, cyclin E2, og PCNA Immunochemistry i bugspytkirtelkræft Væv

Snittene blev forbehandlet ved 65 ° C i 2 timer, efterfulgt af gradueret afparaffinering. Antigen genfinding blev udført før inkubering med de primære antistoffer af cyclin D2 (1:300 fortynding Millipore), cyclin E2 (1:300 fortynding Millipore), og prolifererende celler (PCNA) (1:300 fortynding; Dako) , natten over ved 4 ° C, med normal IgG som en negativ kontrol. Derefter blev objektglassene inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur med HRP-konjugeret sekundært antistof (1:100; Dako). HRP-aktivitet blev detekteret ved anvendelse af en flydende DAB + Substrat-kromogen System (DAKO). Endelig blev snit modfarvet med hematoxylin og fotograferet. De immunohistokemiske resultater blev vurderet ved anvendelse af en semikvantitativ metode, med de endelige score baseret på intensiteten og procentdelen af ​​positive epitelceller fastsættes som følge immunkemi; disse scoringer blev klassificeret som “negative” ( 3) eller “positiv” (≥3) [17]. De PCNA niveauer blev scoret efter procentdelen af ​​positive epitelceller som “0” for ≤5%; “1” for 5% -25%; “2” for 25% -50%; “3” for ≥50%. Prøverne blev klassificeret i grupper med en “lav proliferativ index” ( 2) eller “høj proliferativ index” (≥2) [13], [17]. De immunhistokemiske resultater blev derefter yderligere analyseret med opfølgende data.

Cell Culture

PDAC cellelinjer Capan-2, SW-1990, og Panc-1, for godt (Grade 1) , moderat (Grad 2), og dårligt (grad 3) differentieret kræft i bugspytkirtlen, henholdsvis blev opnået fra det kinesiske center for Type Culture Collection (Wuhan, Kina). Celler blev dyrket i Dulbeccos minimale essentielle medium (suppleret med 10% føtalt bovint serum) og holdt i en CO 5%

2 atmosfære ved 37 ° C i en inkubator.

plasmider og celletransfektion

PDAC cellelinier Capan-2, SW-1990 og Panc-1 blev podet med 3 × 10

5 celler per brønd i plader med 12 brønde, og transficeret med mIR-26a efterligner, inhibitorer, eller cyclin E2 siRNA (Dharmacon) i en endelig koncentration på 100 nM under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens protokol.

mIR-26a overekspression vektor p-hTERT-mIR-26a (pTM) og dens kontrolvektor p-hTERT (pT) blev konstrueret som tidligere beskrevet [12]. For at generere stabile cellelinjer, 4 × 10

5 celler i hver brønd på en plade med 6 brønde blev transficeret med 2 pg af plasmider (PTM eller Pt) anvendelse af Lipofectamine 2000 i overensstemmelse med producentens anvisninger. Positive kulturer blev udvalgt med 800 ug /ml G418 i 2 uger.

Western blot-analyse

Celler blev vasket med iskold PBS, lyseret, og suspenderes i en lysebuffer (Promega). Den resulterende samlede proteinekstrakt blev separeret ved 12% SDS-PAGE geler. Immunoblotting blev udført på polyvinylidenfluorid membraner. De primære og sekundære antistoffer blev anvendt, var et kanin-anti-humant antistof og et gede anti-kanin IgG, henholdsvis (Sigma). Immunodetektion blev udført under anvendelse af et HRP-baseret kemiluminescens substrat [18]. Tabel S2 viser de anvendte antistoffer i denne undersøgelse.

celledeling og cellecyklus Analyser

proliferative potentiale af celler blev analyseret i overensstemmelse med protokollen af ​​Cell Counting Kit-8 (CCK-8 ) assay (Dojindo, Japan). Cellerne blev trypsiniseret, vasket to gange med PBS, opsamlet ved centrifugering, fikseres i 70% kold ethanol, inkuberet med propidiumiodid, og analyseret ved fluorescens-aktiveret cellesortering (Miltenyi, Tyskland).

I vivo

tumorgenese Assay

SW-1990 celler fra moderat differentieret PDAC blev stabilt transficeret med pTM (p-hTERT-miR-26a) eller pT (kontrol vektor). De transficerede celler blev opsamlet, suspenderet i 200 pi PBS (1 × 10

7-celler), og blev injiceret subkutant hos 4 uger gamle BALB /c nøgne mus (

n

= 8). For at undgå det forud eksisterende forskelle mellem individuelle mus, både de stabile cellelinjer (PTM eller Pt) blev individuelt injiceret i modsatte flanker af samme mus; celler transficeret med pTM blev injiceret i venstre flanke, hvorimod kontrollerne (transficeret med vektoren Pt) blev injiceret i den højre flanke. Musene blev holdt i et specifikt patogenfrit miljø i 5 uger og derefter aflivet. Tumoren volumen

V

blev beregnet ved hjælp af sin længde

L

og bredde

W

, efter ligningen

V

= 0,4

LW

2. Muse xenotransplantattumorer blev fikseret i formalin og indlejret i paraffinvoks for den immunokemiske analyse af cyclin D2, E2, og PCNA.

Statistical Analysis

Data blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse ( SD). De sammenslutninger af miR-26a udtryk med de kliniske patologiske karakteristika blev analyseret ved hjælp af Chi-kvadratiske eller Mann-Whitney test. Overlevelseskurven blev konstrueret ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet under anvendelse af log-rank test. Grupper blev sammenlignet ved hjælp af en Students

t

-test. Korrelation analyse blev udført under anvendelse af Pearson korrelationsanalyse. Alle sandsynlighed værdier blev analyseret ved hjælp af en to-halet test og betragtet som signifikant, når

P

0,05. Analyserne blev udført ved hjælp af SPSS (version 17.0) software (SPSS Inc., Chicago, USA).

Resultater

nedregulering af miR-26a i kræft i bugspytkirtlen væv er forbundet med Survival

de klinisk-patologiske karakteristika 106 tilfælde af PDAC er præsenteret i tabel 1. de fleste af disse patienter var i fase II (70,8%), hvilket indikerer, at resultaterne er vigtige for patienter, der er stadig kirurgisk resektabel med den bedste chance for en 5-års overlevelse. QRT-PCR-analyse viste, at MIR-26a-ekspression var signifikant lavere i PDAC væv end i normalt væv (

n =

15,

P

0,05;. figur 1A), der blev yderligere bekræftet af LNA-ISH analyse af 106 tilfælde af PDAC. LNA-ISH viste, at MIR-26a var til stede i cytoplasmaet i pankreatiske duktale epitelceller (fig. 1C og 1D). Ifølge intensitet og procentvise scoringer af de ISH score kriterier [17], 44 i 106 (41,5%) bugspytkirtelkræft væv og 84 i 106 (79%) tilstødende normale væv (ISH ≥3;

P

0,001) var positive for miR-26a. MIR-21-ekspression som den positive kontrol blev analyseret i de samme patienter. miR-21 var positiv i 99 af de 106 (93,4%) PDAC væv og i 25 af de 106 (23,6%) tilstødende normale væv, baseret på kriterierne ISH scoring (fig 1E og 1F;. ISH ≥3;

P

0,01). Forholdet af kliniske karakteristika med miR-26a udtryk i PDAC væv, som bestemt af LNA-ISH, er vist i Tabel 2.

(A) Gennemsnitlig udtryk niveau af miR-26a i humane PDAC prøver (

n

= 15) og normale pancreas væv (

n

= 15). miRNA overflod blev vurderet ved QRT-PCR og normaliseret til U6 RNA. Værdier er præsenteret som middelværdi ± S.D. (B) Samlet overlevelse efter resektion af kræft i bugspytkirtlen med miR-26a-negative versus miR-26a-positive grupper. MIR-26a-negative gruppe havde signifikant kortere overlevelse end miR-26a-positive gruppe (

P

= 0,029). (C, D)

In situ

hybridisering for miR-26a i bugspytkirtlen læsioner.

In situ

hybridisering viste meget lavere miR-26a udtryk i PDAC væv (C) end i ABPT (D). Det indsatte viser den negative kontrol (krypteret sekvens probe). Cytoplasmatisk farvning i de duktale epitelceller står i kontrast med negativ farvning med scrambled probe. (E, F)

In situ

hybridisering for miR-21 (positiv kontrol) i bugspytkirtlen læsioner.

In situ

hybridisering viste meget stærkere miR-21-ekspression i PDAC væv (E) end i ABPT (F). Det indsatte viser den negative kontrol (krypteret sekvens probe). Cytoplasmatisk farvning i tumorceller står i modsætning til den negative farvning af krypterede probe. Original forstørrelse, 100 ×. Vejviser

Opfølgende data fra 73 af de 106 patienter viste, at i alt 18 patienter blev behandlet med adjuverende kemoterapi af gemcitabin og oxaliplatin, hvorimod de resterende 55 patienter blev ikke behandlet med kemoterapi eller strålebehandling. Blandt de 73 patienter, der fik opfølgning, 68 døde, med 16 patienter i kemoterapi og 52 uden yderligere behandling. Men fem af de 73 opfølgende patienter overlevede. Den målte samlede overlevelse var kræft-specifikke; den mediane overlevelse var 8,7 måneder i miR-26a-negative gruppe ( 3;

n

= 43) og 12 måneder i miR-26a-positive gruppe (≥3;

n

= 30). De 1- og 3-årige overlevelsesrater var 39,5% og 0%, henholdsvis i miR-26a-negative gruppe, men var 50% og 6,3%, henholdsvis i miR-26a-positive gruppe. Den samlede overlevelse analyse viste, at MIR-26a-negative gruppe havde signifikant kortere overlevelse end de positive gruppe (

P

= 0,029, Fig. 1B). Adjuverende kemoterapi var ikke forbundet med overlevelsen af ​​patienter med PDAC (

P =

0,417). Associationen mellem MIR-26a-ekspression og andre parametre (såsom alder, køn, tumormasse beliggenhed, tumorstørrelse, tumorcelledifferentiering, neural invasion, lymfeknude nummer, fjernt metastase) var ikke statistisk signifikante (tabel 2). Den multivariate overlevelsesanalyse (Cox regression model) af konventionelle kliniske prognostiske faktorer og miR-26a hævdede, at miR-26a er en uafhængig prognostisk faktor i bugspytkirtelkræft (

P =

0,001; 95% CI, 0,185-0,650; tabel 3).

cyclin D2, cyclin E2, og PCNA Immunochemistry i kræft i bugspytkirtlen væv og deres forening med Survival

de immunfarvet vævsprøver viste, at både tumorceller og kanal epitelial celler af de tilstødende godartede pancreas væv udtrykte ikke cyclin D2 (fig. 2A og 2D). Imidlertid cyclin E2 viste stærk positiv farvning i tumorcellerne (90/106) og kanalsystemer epitelceller de tilstødende godartede pancreatiske væv (76/106;

P

= 0,024;. Figurerne 2B og 2E). Der var ingen signifikant forskel i den samlede overlevelsesrate mellem de 73 opfølgende patienter, der var positive (

n =

61) eller negative (

n =

12) for cyclin E2 (

P

= 0,676;. figur 2G). Resultaterne præsenteres PCNA-positiv farvning for tumorceller (93/106) og for kanalsystemer epitelceller af de tilstødende godartede pancreas væv (68/106;

P

0,01). Den stærke positiv farvning af PCNA i PDAC væv indikerede et højere celle proliferative aktivitet i pancreascancer (fig. 2C og 2F) sammenlignet med negativ farvning i tilstødende normale væv. Den samlede overlevelse analyse viste, at sager med en PCNA høj proliferativ indeks (

n

= 51) i PDAC væv havde signifikant kortere overlevelse end sager med en PCNA lav proliferativ indeks (

n

= 22;

P

= 0,007, figur 2H).. Patienter med en høj PCNA proliferativ indeks var også cyclin E2 positiv.

PDAC tumorvæv (PDAC) var negative for cyklin D2 (A) og stærkt positiv for cyclin E2 (B), med en høj PCNA proliferativ indeks (C). De tilstødende benigne pancreas væv (ABPT) var negative for cyclin D2 blev (D), og positive for cyclin E2, som observeret i de duktale epitelceller i ABPT (E). PCNA var meget lav i normale pancreas væv (F). Indsatsene af A, B og C viser de negative kontroller. Indsættelsen i D angiver, at cyclin D2 er en positiv kontrol af lunge adenocarcinom. Original forstørrelse, 200 ×. Samlet overlevelse efter resektion af kræft i bugspytkirtlen med cyclinE2-positive versus cyclinE2-negative grupper var ikke signifikant (

P

= 0,676) (G), mens den samlede overlevelse efter resektion af kræft i bugspytkirtlen med PCNA høje proliferative indeks versus PCNA lav proliferative indeks grupper havde en signifikant kortere overlevelse (

P

= 0,007) (H).

en korrelationsanalyse for både miR-26a og cyclin E2 udtryk (Pearson koefficient,

R

2

= 0,004) og for miR-26a og PCNA udtryk (

R

2

= 0,024), viste en signifikant sammenhæng. De scatter diagrammer af korrelationsanalysen er præsenteret i figur S1.

miR-26a Overekspression hæmmede væksten af ​​bugspytkirtelkræftceller ved nedregulering af cyclin E2 og EZH2 Expression

For at undersøge effekten af mIR-26a på pancreas vækst cancercelle, de PDAC cellelinier med forskellige kvaliteter Capan-2, SW-1990 og Panc-1 blev transient transficeret med en mIR-26a efterligner eller inhibitor. Den QRT-PCR-analyse viste, at transkriptionen af ​​MIR-26a i mimic gruppe blev signifikant forøget (4,44-fold i Capan-2, 3,45-fold i SW-1990 og 3,59 gange i Panc-1), hvorimod transkription af mIR-26a i inhibitoren gruppen var signifikant reduceret (0,35-fold i Capan-2, 0,43-fold i SW-1990 og 0,44 gange i Panc-1) sammenlignet med kontrolgruppen cellelinier (

P

0,05;.. 3A-3C)

QRT-PCR-analyse viste transskription af miR-26a i efterligner, hæmmer og kontrolgrupper (A, B, C), og den ekspression af cyclin E2 i cyclin E2 siRNA, kontrol siRNA, og kontrolgrupper (D, E, F). Spredningen af ​​PDAC cellelinier transient transficeret med MIR-26a efterligner, miR26a inhibitor eller cyclin E2 siRNA blev analyseret ved CCK-8 proliferation assay (G, H, I). Reguleringen af ​​cyclin E2 eller EZH2 ekspression af MIR-26a blev analyseret ved Western blot (J, K, L), og Western blot-analyse bekræftede også den forventede effektivitet af cyclin E2 siRNA i tre PDAC cellelinier (M, N, O) .

for at undersøge virkningen af ​​cyclin E2 på pancreas vækst cancercelle, var cyclin E2 siRNA transficeret i hver af de tre PDAC cellelinier, og knockdown blev bekræftet ved QRT-PCR-analyse, som viste at ekspressionen af ​​cyclin E2 i siRNA-transficerede gruppe signifikant var faldet i forhold til kontrolcellerne (0,201-fold i Capan-2, 0,274-fold i SW-1990 og 0,327-fold i Panc-1) (fig. 3D -3F).

for at fastlægge den rolle, miR-26a i bugspytkirtlen vækst kræftcelle blev CCK-8 proliferation assay udført i Capan-2, SW-1990 og Panc-1 celler, der var forbigående transficeret med en mIR-26a efterligner eller inhibitor. Resultaterne viste, at MIR-26a-efterligner inhiberede tumorcellevækst, hvorimod miR26a-inhibitor fremmet tumorcellevækst. Desuden cyclin E2 siRNA havde en lignende rolle som MIR-26a-mimic til inhibering af tumorcelleproliferation (fig. 3G-3I).

MIR-26a blev rapporteret til direkte medierer cyclin E2 og cyclin D2 funktioner i HCC [12] og brystkræft [19]. Ekspressionen af ​​Polycomb protein EZH2 blev forøget i PDAC, hvilket følgelig forøgede celleproliferation og kemoresistens [20]. viste imidlertid vores studier, at cyklin D2 farvning var næsten negativ i bugspytkirtelkræft væv. Således blev forholdet mellem MIR-26a og cyclin E2 eller EZH2 analyseret under anvendelse Western blots. Resultaterne viste, at cyclin E2 og EZH2 niveauer var begge faldet i de MIR-26a mimiske-transficerede celler, men blev forøget i Mir-26a inhibitor-transficerede celler (fig. 3J-3L) sammenlignet med kontrolceller. Western blot-analyse bekræftede den forventede effektivitet af cyclin E2 siRNA i de tre PDAC cellelinier (fig. 3M-3O).

Efterfølgende analyserede vi cellecyklusfordeling af Capan-2, SW-1990 og Panc-1-celler, som blev transfekteret med mIR-26a efterligner eller mIR-26a-inhibitor samt kontrollerne. Cellerne transficeret med MIR-26a mimic akkumuleret i G

1 fase, hvorimod S-fasen befolkningen faldet. Imidlertid blev en modsat resultat observeret i celler transficeret med MIR-26a-inhibitor (fig. 4). Disse resultater tydede på, at den proliferative inhibering af MIR-26a skyldtes delvis et G

1-fasen af ​​de tre pancreas cancercellelinjer.

Celler blev enten transficeret med MIR-26a efterligner eller inhibitorer. Kontrollerne blev efterladt ubehandlet. D, H, og L indikerer den statistiske cellecyklusfordeling for Capan-2, SW-1990 og Panc-1 hhv.

ektopisk ekspression af MIR-26a Hæmmet kræft i bugspytkirtlen Vækst i nøgne mus

in vivo

tumorigenese assay viste, at tumorvækst var signifikant lavere i nøgne mus inokuleret med pTM-transfekterede SW-1990 celler i forhold til nøgne mus podet med pT-transficerede SW -1990 celler (fig. 5A). Dette resultat blev bekræftet ved målinger tumorvolumenet på 5 uger (fig. 5B). Cyclin E2 niveauet var meget lavere i tumorvæv overudtrykker MIR-26a og PCNA-ekspression fulgte et lignende mønster. Cyclin D2 blev opdaget i tumorerne (fig 5C-5H.)

(A) Nøgne mus blev subkutant podet med SW-1990 celler transficeret med pTM (pTM: hTERT-miR-26a plasmid). Eller pT ( pT: hTERT kontrol plasmid), i deres flanker. Billedet repræsenterer tumorer dannet i 8 mus. (B) Vækstkurver for tumorvolumener. Grafen repræsenterer tumorvækst, 5 uger efter podning. Tumorvolumen blev beregnet, og alle data er vist som middelværdi ± S.D. (

n

= 8). (C-H) Ekspression af cyclin D2, cyclin E2, og PCNA blev målt ved immunohistokemi i vævene hos mus inokuleret med pTM- transficeret SW-1990 celler eller kontrolcellerne. Figuren mellemværker i C, E og G angiver en negativ kontrol felt. Celler farvet brun indikerer positiv farvning. Original forstørrelse, 200 ×.

Diskussion

er observeret i 3

s

23 modne sekvens af miR-26a, som er en skrøbelig kromosomal regionen er forbundet med forskellige humane cancere [21] – [23]. Omkring halvdelen af ​​alle menneskelige miRNA er placeret i cancer-associerede genomiske regioner; Således kan de fungere som tumor-suppressor eller onkogene miRNA, afhængigt af deres mål [3] – [5]. Således kan MIR-26a fungere som et onkogen i gliomer men tjener som en tumorsuppressor i leverkræft [12], [23] – [26]. Men til dato, der er begrænsede rapporter om rolle og tumorigenese af miR-26a i bugspytkirtelkræft.

I den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at ekspressionen af ​​miR-26a var signifikant nedreguleret i PDAC væv sammenlignet med den for ABPT. For yderligere at udforske de molekylære mekanismer i cellevækst fremme af miR-26a nedregulering i bugspytkirtelkræft væv, analyserede vi rollen som miR-26a overekspression eller downexpression i bugspytkirtelkræft celleproliferation, cellecyklus, og tumorvækst ,. Vores data viste, at ekspressionsniveauet af MIR-26a påvirker proliferation af tre PDAC cellelinjer af forskellige-kvaliteter. miR-26a niveauer blev forbundet med G

1 anholdelse i bugspytkirtelkræftceller. Desuden MIR-26a overekspression i SW-1990 celler undertrykt pancreas tumorigenese i nøgne mus, som antydede, at MIR-26a fungerer som en tumorsuppressor i denne type af cancer.

cyclin D2 og cyclin E2 er vigtige regulatorer af G

1-til-S faseovergangen under cellecyklussen. Disse cycliner er af særlig interesse i bugspytkirtelkræft. Kota [11] og Zhou [27] rapporterede, at MIR-26a direkte opregulerer ekspressionen af ​​cyclin D2 og cyclin E2-mRNA i HCC. Således begge gener er mulige mål af MIR-26a i bugspytkirtelkræft. På den anden side, blev EZH2 niveauer steg i PDAC at fremme celleproliferation og kemoresistens [20]. Derfor har vi fastslået, om miR-26a kunne regulere bugspytkirtelkræft cellecyklus gennem sine målgener, cyklin D2 og cyclin E2. Cyclin D2 blev ikke detekteret i tumorcellerne og kanaler epitelceller i ABPT, hvorimod cyclin E2 var positivt korreleret med MIR-26a-ekspression i pancreas cancer. Cyclin E2 faldt med MIR-26a opregulering i Capan-2, SW-1990 og Panc-1-celler. De observerede på celledeling og cyclin E2 udtryk effekter var i overensstemmelse med dem, der blev observeret for EZH2 i PDAC celler. Disse data antyder, at MIR-26a nedregulering førte til opregulering af cyclin E2 og EZH2, men ikke af cyclin D2, i PDAC væv. Således nedreguleret MIR-26a bidrog til celleproliferation og ringe overlevelse i bugspytkirtelkræft. Disse resultater stemmer overens med undersøgelser af andre tumorer, såsom HCC, brystcancer, NPC, og lymfomer [12], [27] – [30]. Den ændret ekspression af specifikke miRNA i tumorer er sigende i forbindelse med cancer metastase og dårlig prognose [29] – [32]. Heinzelmann et al., [33] fundet en miRNA signatur, der skelner mellem metastatisk og nonnmetastatisk klar celle nyrecellecarcinomer. En gruppe på 12 miRNA, herunder Lad-7 familie, MIR-30c, og MIR-26a, viste sig at falde i stærkt aggressive primære metastatiske tumorer.