PLoS ONE: Co-Indført Funktionel CCR2 forstærker in vivo Anti-Lung Cancer funktionalitet medieret af T-celler Dobbelt Gene-modificeret til at udtrykke WT1-specifikke T-celle Receptor

Abstrakt

Baggrund og formål

Selvom gen-modificering af T-celler til at udtrykke tumor-relateret antigen-specifik T-celle-receptor (TCR) eller kimært antigen receptor (CAR) har klinisk bevist løfte, stadig der plads til at forbedre den kliniske effektivitet af omdirigeret T celle-baseret antitumor adoptiv terapi. For at opnå mere objektive kliniske respons ved hjælp ex vivo-ekspanderede tumor-responsive T-celler, de infused T-celler har brug for at vise tilstrækkelig lokaliseret infiltration ind i tumoren.

Metode /vigtigste resultater

Menneskelig lungecancerceller forskellig udtrykker et tumorantigen, Wilms ‘tumor genprodukt 1 (WT1), og en inflammatorisk kemokin, CCL2. Imidlertid CCR2, den relevante receptor for CCL2, er sjældent udtrykt på aktiverede T-lymfocytter. En HLA-A2402

+ human cellelinje lungecancer, LK79, som udtrykker store mængder af både

CCL2

WT1

mRNA, var ansat som mål. Normale CD8

+ T-celler blev retroviralt gen-modificerede til at udtrykke både CCR2 og HLA-A * 2402-begrænset og WT1

235-243 nonapeptid-specifikke TCR som en effektor. Anti-tumor-funktionalitet medieret af disse effektorceller mod LK79 celler blev vurderet både in vitro og in vivo. Endelig indvirkning CCL2 på WT1 epitop-responsive TCR-signalering medieret af effektorcellerne blev undersøgt. Indført CCR2 blev funktionelt valideret med genmodificerede Jurkat-celler og humane CD3

+ T-celler både in vitro og in vivo. Dobbelt gen-modificerede CD3

+ T-celler med succes demonstreret både CCL2-tropisk tumor menneskehandel og celledræbende reaktivitet mod LK79 celler in vitro og in vivo. CCL2 augmented WT1 epitop-responsive TCR signalering vist ved relevant luciferase produktion i dobbelt genmodificerede Jurkat /MA celler til at udtrykke luciferase og WT1-specifikke TCR, og CCL2 også dosisafhængigt augmented WT1 epitop-responsive IFN-γ produktion og CD107a udtryk medieret af disse dobbelt gen-modifiedCD3

+ T-celler.

Konklusion /betydning

Indførelse af CCL2 /CCR2 akse succes forstærkede in vivo anti-lungekræft reaktivitet medieret af CD8

+ T-celler dobbelt gen-modificerede til at udtrykke WT1-specifikke TCR og CCR2 ikke kun via CCL2-tropisk tumor menneskehandel, men også CCL2-forstærket WT1-lydhørhed

Henvisning:. Asai H, Fujiwara H, An J , Ochi T, Miyazaki Y, Nagai K, et al. (2013) Co-Indført Funktionel CCR2 forstærker in vivo Anti-Lung Cancer funktionalitet medieret af T-celler Dobbelt Gene-modificeret til at udtrykke WT1-specifikke T-celle-receptor. PLoS ONE 8 (2): e56820. doi: 10,1371 /journal.pone.0056820

Redaktør: Nupur Gangopadhyay, University of Pittsburgh, USA

Modtaget: September 30, 2012; Accepteret: 14 januar 2013; Udgivet: 18 februar 2013

Copyright: © 2013 Asai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan til HF og MY, og en Grant-in-Aid for Cancer Research fra Sundhedsministeriet, Labor og Velfærd til MY. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne undtagen SO, JM og HS har erklæret, at ingen konkurrerende interesse eksisterer. SO og JM er ansat af Takara Bio, Inc .. HS er forsynet med forskningsmidler fra Takara Bio, Inc .. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

på trods af de seneste terapeutiske fremskridt, den samlede overlevelse af patienter med fremskreden lungekræft stadig dårlig [1], og derfor udforskning af nye behandlingsformer er fortsat et ønskeligt mål. Resultater fra kliniske forsøg med anti-tumor adoptiv behandling med ex vivo-udvidede tumor-responsive T-celler, har primært tumor-infiltrerende T-lymfocytter (TIL), til behandling af fremskreden modermærkekræft demonstreret en imponerende klinisk respons. På den anden side er der visse ulemper, såsom den komplicerede procedurer og vanskeligheder med at bevare den terapeutiske kvalitet af langsigtet-dyrkede T-celler [2]. Den seneste tekniske fremskridt involverer genmodifikationer at indføre tumor-responsive receptorer i terapeutiske T-celler – såsom tumor antigen-specifik T-celle-receptor (TCR) og kimære antigen receptor (CAR) – har i vid udstrækning overvinde disse ulemper [3] – [5 ]. Men som intervallet passende responsive tumorer stadig er begrænset, har vi foreslået nogle nye muligheder, såsom HLA-A * 2402-begrænset WT1-specifikke TCR [6] og HLA-A * 0201-begrænset Aurora kinase A (AURKA) -specifik TCR [7], til behandling af humane leukæmier. En anden teknisk fremskridt vi har foreslået, er et hidtil ukendt TCR vektorsystem, der samtidig leverer shRNAs for endogen TCR α /p-generne (siTCR vektor) [8], og dermed reducere dannelsen af ​​mispaired TCR, den potentielle risiko for letal akut GVHD [9].

WT1 er et velkendt tumorantigen udtrykt i forskellige grader af humane lungecancerceller [10], og WT1-ekspression er blevet vist klinisk at have prognostisk værdi i lungekræftpatienter [11]. Ved hjælp af en xenotransplanteret musemodel, har vi tidligere udforsket anti-lungekræft terapeutiske potentiale af en ex vivo-ekspanderede klonal cytotoksisk T cellelinje (CTL) [12], TAK-1, som specifikt genkender WT1

235-243 nonamer epitop i forbindelse med HLA-a * 2402 [13].

på den anden side, utilstrækkelig infiltration af terapeutiske T-celler i lokaliserede tumorsteder er en hindring for vellykket behandling [14]. For at forøge tumoren trafficking aktivitet af infunderede terapeutiske T-celler, er deres modtagelighed for passende kemokiner produceret af tumorceller eller tumor-infiltrerede immunceller påkrævet. Først ved Kershaw et al. [15], er der gennemført en række prækliniske undersøgelser baseret på dette begreb [16] – [19]. Men det vigtigste spørgsmål om hvilken chemokin-kemokinreceptor par bør vælges til klinisk anvendelse stadig, der skal afregnes. I den foreliggende undersøgelse for at undersøge de potentielle fordele ved co-introduktion af en kemokin-kemokinreceptor akse for antitumor adoptiv immunterapi anvendte vi som model genetisk omdirigeret T-celler rettet mod WT1 til behandling af human lungecancer.

I denne undersøgelse fandt vi, at CC-kemokin 2 (CCL2) blev produceret til variable grader af humane lunge cancer cellelinjer, og at LK79, en HLA-a * 2402

+ småcellet lungecancer (SCLC) cellelinje overekspression

WT1

mRNA, produceret ekstremt høje mængder af CCL2. LK79 blev dræbt af CD8

+ T celler gen-modificerede til at udtrykke WT1-specifikke TCR stammer fra TAK-1. På den anden side, CCR2, den specifikke receptor for CCL2, var næppe udtrykkes på disse transfektanter. Tilsammen foreslog de data, for at demonstrere vores proof-of-concept, ville det være fornuftigt at ansætte CCR2-CCL2 akse i fastsættelsen af ​​omdirigeret T-celler rettet mod WT1 og lungekræft. Fordi behandling af SCLC stadig udfordrende [20], vi fandt, at brugen af ​​LK79, en SCLC cellelinie, som et mål, kan åbne en ny vej for terapi for SCLC.

I den foreliggende undersøgelse, vi undersøgt i detaljer anti-lungecancer funktionalitet medieret af dobbelt-transficerede CD8

+ T-celler til at udtrykke WT1-specifik TCR og CCR2 mod LK79 celler, både in vitro og in vivo. Baseret på vores observationer, diskuterede vi den kliniske gennemførlighed af denne strategi for adoptiv immunterapi mod human lungekræft.

Materialer og metoder

1. Etik Statement

Godkendelse til denne undersøgelse blev opnået fra Institutional Review Board of Ehime Universitetshospital. Skriftligt informeret samtykke blev givet af alle raske frivillige i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen. Alle in vivo muse eksperimenter blev godkendt af Ehime University dyr pleje udvalg.

2. Celler

Jurkat-celler (ATCC) og humane lungecancer-cellelinjer var positive for enten HLA-A * 2402

+, WT1 mRNA eller begge blev anvendt. Sidstnævnte indgår LC99A (storcellet carcinom oprindelse) [21], LK79 (småcellet karcinom) [21], RERF-LC-A1 (planocellulært karcinom) [21] og LC11-18 (adenocarcinom) [22]. PC-9 (adenocarcinom) [21] var positiv for HLA-A * 2402

+ men negative for WT1 mRNA, Sq-1 (planocellulært karcinom) [21], LC65A (småcellet karcinom) [21], QG56 (planocellulært karcinom) [21], LK87 (adenocarcinom) [21], og 1-87 (adenocarcinom) [21] var negative for HLA-A * 2402. Alle disse tidligere offentliggjorte lungekræft cellelinier blev venligst stillet til rådighed af Dr. Akio Hiraki (Okayama University Graduate School, Okayama, Japan), og dyrkes som tidligere [12] rapporteret. Den Jurkat /MA-cellelinie (venligst stillet til rådighed af prof Erik Hooijberg, Vrije Universiteit Medisch Centrum, Amsterdam, Holland) er en Jurkat celle underklon forudgående er oprettet ved Prof. Erik Hooijberg og kolleger, der mangler endogen TCR udtryk og stabilt udtrykker både det menneskelige CD8a-genet (

hCD8α

) og en

NFAT-luciferase

genkonstruktion til påvisning af signalering via nyindførte TCR’er [23].

HLA-A * 2402

gen-transduceret C1 R-cellelinie (C1 R-A24) blev også dyrket i RPMI1640-medium suppleret med 10% føtalt kalveserum og 0,5 mg /ml hygromycin B (Invitrogen). B-lymfoblastoide cellelinjer (B-LCLS) etableret ved transformation af perifere blod B-lymfocytter med Epstein-Barr-virus. Perifere, mononukleare blodceller (PBMC’er) fra raske frivillige blev isoleret og opbevaret i flydende nitrogen indtil anvendelse.

3. Mus

Seks uger gamle NOD /SCID /yc

null (Nog) hunmus blev købt fra det centrale institut for forsøgsdyr [24] og vedligeholdes i den institutionelle dyr facilitet på Ehime Universitet.

4. Flowcytometri

overflademarkører af transfektanter eller ikke-genmodificerede T-celler blev mærket med anti-CD8, anti-CD4, anti-CD3 og anti-CD45 mAb’er (BD Biosciences), anti-CD25 og anti CD69 mAbs (BioLegend), anti-Vβ5.1 mAb (Beckman Coulter), anti-CCR2 mAb (R Efterfølgende blev GaLV-pseudotype retrovirale vektorer opnået ved sekventiel transfektion af disse vektorer i PG13 cellelinje (Takara Bio).

6. Transduktion af

TCR

og

CCR2

gener

Jurkat /MA celler og raske donor T-celler blev gen-modificerede til at udtrykke WT1-specifikke TCR og CCR2 som tidligere beskrevet [ ,,,0],6]. Kort fortalt, på dag 1, 1 × 10

6 T brønd i GT-T503 (Takara Bio) med 5% humant serum, 0,2% humant albumin, 50 U /ml rekombinant human IL-2 (R ATCC) eller et kontrol-anti-HLA-DR-mAb (L243, ATCC). Efter 5 timers inkubering med effektorceller blev 100 pi supernatant opsamlet fra hver brønd. Procentdelen af ​​specifik lyse blev beregnet som:. (Eksperimentel frigivelse cpm-spontan cpm frigivelse) /(maksimal frigivelse cpm-spontan frigivelse cpm) x 100 (%)

10. IFN-γ-sekretion assay

Fem hundrede tusinde dobbelt-transficeret normale perifere CD8

+ T celler, der udtrykker både WT1-specifikke TCR og CCR2 blev co-inkuberet med 1 × 10

5 WT1 peptid-pulserede (1 uM) eller unpulsed C1 R-A24-celler i 24 timer i forskellige koncentrationer af CCL2. IFN-γ i kultursupernatanten blev målt på samme måde under anvendelse af et ELISA-kit (R forskelle på

s

. 0,05 blev betragtet som signifikante

Resultater

1. Produktion af forskellige mængder af CCL2 af humane lungecancer-cellelinjer, og sjældne ekspression af det tilsvarende receptor CCR2 på T-celler aktiveres med OKT-3 og IL-2

Udtrykket profiler af de 12 udvalgte chemokin mRNA’er produceret af hver af de humane lungecancer-cellelinjer vurderes af QRT-PCR er opsummeret i tabel 2. som vist i figur 1A, forskellige mængder CCL2 protein blev produceret i alle lungekræft cellelinier vurderes, blandt hvilke LK79, en SCLC cellelinie , produceret specielt store mængder af CCL2. Den tilsvarende receptor, CCR2, blev sjældent udtrykt på overfladen af ​​både hvilende T-celler eller dem aktiveres ved anvendelse af OKT-3 /IL-2 (n = 5). Aktiverede T-celler blev gated med CD69 positivitet. Et repræsentativt eksempel blandt 5 tilfælde er vist i figur 1B. Ekspressionsniveauerne for hvilende og aktiverede celler var: CD8, 0,83 ± 0,72% og 0,75 ± 0,51%, og CD4, 0,66 ± 0,45% og 0,5 ± 0,26% (middel ± SD) henholdsvis. Derudover QRT-PCR viste, at ekspressionsniveauerne af

CCR2

mRNA i aktive og hvilende T-celler (n = 5) var ikke forskellig i enten CD4

+ eller CD8

+ T-celler (data ikke vist). På den anden side, effektor CD8

+ T-celler dobbelt-transficeret til at udtrykke HLA-A * 2402-begrænset og WT1

235-243-specifikke-TCR held dræbt kandidat human lung cancer cellelinjer i en HLA-A * 2402-begrænset vis (fig. 1C og 1D). Taget sammen foreslår dataene, at valget af de CCR2-CCL2 akse og parring af CTL’er omfattende effektorceller gen-modificeret til at udtrykke WT1-specifik TCR med LK79 målceller, der var følsomme over for celledræbende aktivitet medieret af den transficerede CTL var rimeligt egnet til at demonstrere proof-of-concept med denne undersøgelse. Derfor er disse dobbelt-transficeret effektor CD8

+ T celler parret med target LK79 celler var beskæftiget i de efterfølgende eksperimenter.

(A) ELISA-assay viste, at 10 humane lunge cancer cellelinjer undersøgte produceret forskellige mængder af CCL2 i kultursupernatanten. Fejl- søjler repræsenterer SDS. (B) I lighed med transduktion af WT1-specifikke

TCR

gen, CD69-positive CD8

+ og CD4

+ T-celler aktiveret med IL-2 og OKT-3 sjældent viste celle-overflade CCR2. Et repræsentativt eksempel på 5 tilfælde er vist. (C) CD8

+ T-celler gen-modificeret til at udtrykke HLA-A * 2402-begrænset og WT1

235-243 nonamer-specifik TCR held vises celledræbende aktivitet over lungekræft cellelinie celler i et HLA-A * 2402-begrænset måde, som bestemt ved standard

51Cr release assay. Fejl- søjler repræsenterer SDS. MFI angiver gennemsnitlige fluorescensintensitet, n.d indikerer mindre end detekterbar. (D) En sådan anti-lungecancer aktivitet (vs. LK79 og LC99A) blev inhiberet af anti-HLA klasse I ramme mAb (klon W6 /32), men ikke af anti-HLA-DR-mAb (klon L243), igen illustrerer, at det indførte WT1-specifik TCR-medieret tumordræbende aktivitet var HLA-klasse i-begrænsede. Fejl- søjler repræsenterer SDS. (E) Tetramer assay viste, at effektorceller i disse forsøg anvendte var positive for WT1 /HLA-A * 2402-tetramer. HIV /HLA-A * 2402 tetramer var ansat som negativ kontrol.

2. Funktionel validering af indført CCR2

For det første blev funktionel validering af indførte CCR2 udført ved hjælp af

CCR2

transficerede Jurkat celler (Jurkat /CCR2) i Transwell eksperimenter. Jurkat /CCR2, men ikke parentale Jurkat-celler, med succes viste CCL2-medieret migration aktivitet på en dosis-afhængig måde. Figur 2 viser antallet af celler, der migrerer i forhold til, at der på en CCL2 koncentration på 12,5 ng /ml. Jurkat /CCR2 celler ligeledes vises migration aktivitet over LK79, LK87, LC11-18, LC65A og LC99A celler udsået i de nederste brønde i henhold til niveauet af CCL2 produceret af hver cellelinje (fig. 1A). Endelig dette kemotaxi medieret af Jurkat /CCR2 dybt LK79 blev fuldstændigt inhiberet af anti-CCR2-mAb (fig. 2B). Dernæst bruger en xenotransplanteret NOG musemodel, tumor antigen-uafhængig in vivo tumor handel medieret af

CCR2

luciferase

dobbelt-transficeret normale CD3

+ T-celler blev undersøgt ved hjælp af bioluminescens imaging . En dag efter intravenøs infusion, disse luciferase-mærket CCR2-udtrykkende CD3

+ T-celler begyndte at akkumulere på det sted, inokulerede LK79 celler i den forreste bugvæg, hvorimod luciferase-mærket CD3

+ T celler, der mangler CCR2 var dispergeret i hele kroppen i løbet af observationsperioden (fig. 2C). Dernæst validering af funktionen af ​​dobbelt-transficeret normale CD8

+ T-celler til at udtrykke både WT1-specifikke TCR og CCR2 blev udført. Først, vi vurderet, om co-introduktion af CCR2 forringet WT1-specifikke celledræbende aktivitet mod lungekræft celler medieret af dobbelt-transficeret effektor CD8

+ T-celler. Som vist i figur 3A og 3B, WT1-peptid-responsiv cytocidal aktivitet og anti-lungecancer aktivitet mod HLA-A * 2402

+ LK79 celler (men ikke at mod HLA-A * 2402

– LK87 celler som negativ kontrol) medieret af disse effektor celler, bliver dobbelt-positive for Vβ5.1 og CCR2 (fig. 3C), blev ikke kompromitteret i forhold til, at medieret af WT1-specifikke

TCR

single-transficeret CD8

+ T-celler (fig. 1C). Dernæst den kombinerede antitumor funktionalitet mod LK79 celler medieret ved at dobbeltklikke transficeret CD8

+ T-celler, der omfatter både øget tumor handel aktivitet og WT1-specifik celledræbende aktivitet, blev undersøgt ved hjælp af en modificeret Transwell eksperiment. Disse dobbelt-transficerede CD8

+ T-celler (n = 3), men ikke WT1-si

TCR

single-transficerede CD8

+ T-celler (n = 3), i den øvre brønd effektivt migreret ind i bunden godt, hvor LK79 celler var blevet podet og præinkuberet i 24 timer. Både dobbelt- og WT1-si

TCR

single-transfekterede effektorceller indlæst i de øverste brønde var lige 90-92% positive for Vβ5.1, og 70-72% af de dobbelt-transfektanterne udtrykte CCR2 (data ikke vist). Derfor signifikant (

s

0,05) flere LK79 celler blev ødelagt af migreret dobbelt transficeret CD8

+ T-celler end ved WT1-si

TCR

single-transfektanterne, som repræsenteret ved forhøjede niveauer af LDH i kultursupernatanterne (fig. 4A). Ved afslutningen af ​​disse transwell eksperimenter, afslørede flowcytometrisk analyse, at 3,4 gange flere Vβ5.1-positive effektor celler forblev i bunden godt behandlet med dobbelt-transficeret CD8

+ T-celler 7,91 ± 0,51 (× 10

4 ) til dobbelt-transfektanter, og 2,35 ± 0,13 (× 10

4) for enlige-transfektanter, henholdsvis), der understøtter resultaterne af LDH-analysen. Mikroskopisk undersøgelse bekræftede en større grad af ødelæggelse af LK79 celler i bunden godt efter behandling med dobbelt-transficerede effektorceller, end med enkelt-transficerede celler. Endvidere konfokal mikroskopisk undersøgelse demonstrerede rød-mærket migrerede CCR2-udtrykkende effektorceller i bunden godt efter behandling med dobbelt genmodificerede effektorceller. Et repræsentativt eksempel blandt tre eksperimenter er vist i figur 4B.

(A)

CCR2

-transduced jurkatceller, men ikke forældre jurkatceller, viste dosisafhængige Transwell CCL2-kemotaksi. Antallet af celler migrerer er vist i forhold til, at der på en CCL2 koncentration på 12,5 ng /ml. Fejl- søjler repræsenterer SDS. (B) Tilsvarende er antallet af migrerende

CCR2

-transduced jurkatceller for hver kræft cellelinje vises. Migrationen af ​​

CCR2

-transduced Jurkat-celler var naturligvis inhiberet af anti-CCR2-mAb, hvilket tyder på, at antallet af migrerende celler var afhængig af graden af ​​CCL2 produceret af hver cellelinje (i fig. 1A) og Mediated af den indførte CCR2 på Jurkat-celler. Fejl- søjler repræsenterer SDS. (C) CCL2-baserede mål-antigen-uafhængig in vivo tumor handel i retning af podede LK79 celler medieret af

CCR2

transficerede CD3

+ T-celler blev succesfuldt demonstreret i en xenotransplanteret musemodel. Intravenøst ​​infunderet luciferase-mærket CD3

+ T-celler, der udtrykker CCR2 (CD3 /CCR2 /luc) (lavere), men ikke af dem mangler CCR2 (CD3 /luc) (øvre), begyndte at migrere til LK79 celler straks på dag 1 efter infusion, og deres målrettede migration blev opretholdt i hele observationsperioden.

(A) Under anvendelse af standard

51Cr frigivelsesassay, disse dobbelte-transficerede effektorceller tilstrækkeligt lyseret 1 pM WT1-peptid-belastet, men ikke losset, C1 R-A24 celler, der udtrykte HLA-A * 2402. E /T-forhold indikerer effector:target ratio. Fejl bar indikerer SDS. (B) Disse dobbelt-transficerede effektorceller også tilstrækkeligt lyseret HLA-A * 2402

+ LK79 celler, men ikke LK87 celler, der mangler HLA-A * 2402-molekyle anvendes som en negativ kontrol. (C) Double-transficerede CD8

+ T-celler med succes udtrykt både celleoverflade-CCR2 og Vβ5.1, kim-linie komponent i WT1-specifikke TCR β-kæde. [15].