PLoS ONE: Identifikation af prostataspecifikt G-proteinkoblet receptor som en tumor antigen, der genkendes af CD8 + -T-celler til Cancerimmunterapi

Abstrakt

Baggrund

Prostatakræft er den hyppigste kræftform blandt ældre mænd i USA, og immunterapi har vist sig at være en lovende strategi til behandling af patienter med metastatisk kastrationsresistent prostatacancer kræft. Indsats for at identificere hidtil ukendte prostataspecifikke tumorantigener vil lette udviklingen af ​​effektive cancer vacciner mod prostatacancer. Prostata-specifikt G-protein-koblet receptor (PSGR) er et hidtil ukendt antigen, der har vist sig at være specifikt overudtrykt i humane prostatakræft væv. I denne undersøgelse beskriver vi identificering af PSGR peptid epitoper genkendt af CD8

+ T-celler i en HLA-A2-afhængig måde.

Metodologi /vigtigste resultater Salg

Enogtyve PSGR-afledte peptider blev forudsagt af en immuno-informatik tilgang baseret på HLA-A2-bindende motiv. Disse peptider blev undersøgt for deres evne til at inducere peptidspecifikke T-celle-responser i mononukleære blodceller (PBMC’er) perifere opnået fra enten HLA-A2

+ raske donorer eller HLA-A2

+ prostatacancerpatienter. Anerkendelse af HLA-A2 positive og PSGR udtrykkende LNCaP-celler blev også testet. Blandt de 21 PSGR-afledte peptider, tre peptider, PSGR3, PSGR4 og PSGR14 ofte induceret peptidspecifikke T-celle-responser i PBMC’er fra både raske donorer og prostatacancerpatienter. Vigtigere er, disse peptid-specifikke T-celler genkendes og dræbt LNCaP prostata cancerceller i en HLA klasse I-begrænset vis.

Konklusioner /Signifikans

Vi har identificeret tre hidtil ukendte HLA-A2-begrænsede PSGR -afledte peptider genkendes af CD8

+ T-celler, som igen, genkender HLA-A2

+ og PSGR

+ tumorceller. De PSGR-afledte peptider identificeret kan anvendes som diagnostiske markører samt immun mål for udvikling af anticancer-vacciner

Henvisning:. Matsueda S, Wang M, Weng J, Li Y, Yin B, Zou J, et al. (2012) Identifikation af prostataspecifikt G-proteinkoblet receptor som en tumor antigen, der genkendes af CD8

+ -T-celler til Cancerimmunterapi. PLoS ONE 7 (9): e45756. doi: 10,1371 /journal.pone.0045756

Redaktør: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, USA

Modtaget: Maj 11, 2012; Accepteret: August 24, 2012; Udgivet: 20 September, 2012

Copyright: © Matsueda et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra National Cancer Institute, National Institute of Health og Cancer Research Institute, og The Methodist Hospital Research Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er blevet den mest almindelige kræftform blandt mænd i USA og er den næststørste årsag til kræftdødsfald i amerikanske mænd [1]. Standarden af ​​omsorg for de fleste patienter med prostatakræft er kirurgi og /eller strålebehandling. Imidlertid sygdomstilbagefald efter operation eller strålebehandling stadig sted i op til 30% af patienterne. Selvom androgen-deprivation terapi er en effektiv behandling mod tilbagevendende sygdom, de fleste af disse patienter med tiden udvikle androgen prostatacancer, som er ufølsom overfor traditionelle behandling. Derfor er der et presserende behov for mere effektive og mindre giftige behandlinger. Immunterapi har vist sig at være en lovende fremgangsmåde til behandling af prostatacancer, især for patienter med metastatisk kastrationsresistent prostatacancer [2] – [4]. Udnyttelse immunsystemet til at udrydde maligne celler er en lovende fremgangsmåde til cancerterapi, men indtil for nylig er blevet mødt med kun sporadisk klinisk succes [4] – [6]. Seneste Food and Drug Administration (FDA) godkendelse af immunterapi-vaccine /drug sipuleucel-T

(

Provenge) og Ipilimumab (Yervoy) repræsenterer milepæle inden for cancerimmunterapi [7], [8]. Desuden et klinisk fase III forsøg med gp100 peptid til melanom også produceret meget opmuntrende kliniske resultater [9]. Imidlertid har de kliniske fordele rapporteret for disse midler faldet langt fra komplette responser og permanente kur. I tilfælde af sipuleucel-T, overlevelse fordel for patienter var kun 4,1 måneder, uden objektiv tumorregression eller væsentlige ændringer i prostata specifikt antigen (PSA) niveauer. En nylig undersøgelse ved hjælp af dyremodeller yderligere afslører betydningen af ​​tumor-specifikke antigener i at fremkalde immunrespons mod et udviklingsland tumor [10], ansporet flere bestræbelser på at identificere sådanne antigener for cancer immunterapi. Da nogle store afvisning antigener kan gå tabt eller ændres på grund af T-celle udvælgelse og drab [11], den bedste strategi er at målrette flere tumor antigener, som er til stede på individuelle tumorer for immunterapi.

Til dato, en række prostataspecifikke tumorantigener er blevet veldefineret, herunder PSA [12], [13], prostein [14], [15], prostata stamcelle antigen (PSCA) [16], prostataspecifikt membran-antigen (PSMA ) [17] – [19], prostatasyrephosphatase (PAP) [20] og forbigående receptor potentielle p8 (trp-p8) [21]. Desuden har HLA-klasse I-begrænsede epitoper afledt fra disse tumorantigener blevet beskrevet [22]. En ulempe ved enkelt tumorantigen-baseret immunterapi er, at der kan forekomme immune escape. Derfor er der behov for identifikation af yderligere prostatacancer-specifikke antigener til udvikling af mere effektive og antigenspecifikke vacciner til patienter med metastatisk prostatacancer. Prostata-specifikt G-protein-koblet receptor (PSGR) er et medlem af G-protein-koblede odorantreceptor familie, og er overudtrykt i prostatacancerceller sammenlignes med normale prostataceller [23] – [25], hvilket antyder, at PSGR kan være målrettet til udvikling af nye immunterapeutiske strategier mod prostatacancer.

i et forsøg på at fastslå, om PSGR kan genkendes af T-celler, beskriver vi identificering af PSGR-afledte T-celleepitoper for T-celle genkendelse af et immun -bioinformatics tilgang. Enogtyve peptider, som blev forudsagt at binde til HLA-A2 molekylet blev selekteret og syntetiseret. Alle disse peptider blev evalueret

in vitro

for deres evne til at stimulere T-celler i PBMC’er fra både raske forsøgspersoner og prostata patienter baseret på interferon-γ (IFN-γ) frigivelse målt ved ELISA eller ELISPOT-analyser. Tre peptider viste sig at inducere IFN-γ-frigivelse i perifere T-celler fra både raske forsøgspersoner og prostatacancerpatienter. Vigtigere, kan disse peptidspecifikke T-celler genkender HLA-A2

+, PSGR-udtrykkende LNCaP-celler i en HLA-klasse I-afhængig måde.

Materialer og metoder Salg

raske donorer og prostatakræft patienter

Ten HLA-A2

+ prostatakræft patienter og ti HLA-A2

+ raske forsøgspersoner blev inkluderet i denne undersøgelse efter skriftligt informeret samtykke blev opnået. Alle protokoller blev godkendt af Institutional Review Board (IRB) for Baylor College of Medicine, før studiestart. 20 ml perifert blod blev opnået fra hver person, og mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) blev isoleret ved densitetsgradientcentrifugering ved anvendelse af Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norge). De frisk isolerede PBMC’er blev kryokonserveret til senere brug i 1 ml frysemedium indeholdende 90% FCS og 10% dimethylsulfoxid (DMSO) ved -140 ° C. Ekspressionen af ​​HLA-A2-molekyler på PBMC’er opnået fra kræftpatienter og raske forsøgspersoner blev verificeret ved flowcytometri med FITC-mærket HLA-A2 mAb BB7.2 (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA).

cellelinier

T2-celler (en HLA-A2

+ TAP-deficiente cellelinie), PC3-celler (en HLA-A2-negative prostatacancer cellelinie), og LNCaP-celler (en HLA-A2 positive prostatacarcinom-cellelinie) blev alle anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA). Alle cellelinier blev opretholdt i RPMI-1640 medium (Mediatech, Manassas, VA, USA), suppleret med 10% FBS, 1% L-glutamin og 1% penicillin og streptomycin

Peptider

Enogtyve PSGR-afledte peptider (tabel 1) blev forudsagt under anvendelse BIMAS (https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/), SYFPEITHI (https://www.syfpeithi.de/), og Rankpep (https://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html) baseret på HLA-A2-bindende motiv. Kun epitoper, som blev forudsagt af mindst to af disse algoritmer blev udvalgt til yderligere afprøvning. Peptiderne blev syntetiseret ved en fast-fase metoden i en peptidsynteseapparat (AApptec, Inc .; Louisville, KY, USA), oprenset ved omvendt-fase højtydende væskekromatografi og valideres ved massespektrometri. De syntetiserede peptider blev opløst i DMSO ved en koncentration på 10 mg /ml og opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.

In vitro

Stimulering af peptid-specifikke T-celler i PBMC’er Salg

PBMC’er (1 × 10

5 celler /brønd) fra enten raske forsøgspersoner eller prostatacancer patienter blev inkuberet med standard peptidkoncentrationer på 20 ug /ml pr peptid [26] – [28] i 96-brønds U-bund mikroplader (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) i 200 pi T-celle-medium (TCM) bestående af RPMI 1640 (Mediatech, Manassas, VA, USA), 10% humant AB-serum (Valley Biomedical, Winchester, USA), 50 uM 2-mercaptoethanol, 100 U /ml interleukin-2 (IL-2), 0,1 mM MEM ikke-essentiel aminosyreopløsning (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Halvdelen af ​​TCM blev fjernet og erstattet med frisk TCM indeholdende peptider (20 ug /ml) hver 5 dage. Efter 14 dages dyrkning blev cellerne høstet og testet for deres evne til at producere IFN-γ som reaktion på T2-celler (1 x 10

4 celler /brønd), der var præ-fyldt med enten PSGR peptid (5 ug /ml) eller en kontrol-peptid (et irrelevant HLA-A2 bindende peptid: NLLTHVESL) som en negativ kontrol. Efter 18 timers inkubation blev supernatanter opsamlet, og IFN-γ frigivelse blev bestemt ved ELISA-assay.

Rapid Expansion Protocol (REP) for PSGR Peptid-specifikke T-celler Salg

PSGR peptidspecifik T-celler blev udvidet med en hurtig udvidelse protokol (REP) som tidligere beskrevet [29] med en mindre ændring. Kort fortalt, på dag 0, 0,1-0,5 × 10

6 PSGR peptidspecifikke T-celler blev dyrket i en T25-kolbe med 20 ml RPMI-1640 suppleret med 10% humant AB-serum, 50 uM 2-mercaptoethanol og 30 ng /mL OKT3 antistof (Ortho Biotech, Bridgewater, NJ), sammen med 20 × 10

6 bestrålede allogene PBMC’er og 5 × 10

6 bestrålet Epstein-Barr-virus (EBV) transformerede B-celler som feeder-celler. Kolber blev inkuberet opretstående ved 37 ° C i 5% CO

2. IL-2 (300 IU /ml) blev tilsat på dag 1, og på dag 5, blev halvdelen af ​​cellekultursupernatanten fjernet og genopfyldes med frisk medium indeholdende 300 IU /ml IL-2. 14 dage efter påbegyndelse af REP blev celler høstet og kryopræserveret for fremtidige eksperimenter

ELISA Assay

Cytokinfrigivelse blev målt ved at coate 96-brønds ELISA-plader (Thermo Fisher Scientific;. Rochester, NY , USA) med 1 pg /ml anti-human IFN-γ (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) natten over ved 4 ° C. Pladen blev vasket seks gange med PBS indeholdende 0,05% Tween-20 (vaskeopløsning) for at fjerne ubundet coating-antistof, og blokeret med 1% BSA /PBS ved stuetemperatur i 2 timer. Derefter blev 50 pi supernatant tilsat til hver brønd og inkuberet ved stuetemperatur i 1 time, hvorefter 50 pi 0,5 pg /ml biotinyleret anti-human IFN-γ (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) blev tilsat, og pladerne blev inkuberet i yderligere 1 time ved stuetemperatur. Efter inkubation blev pladerne vasket og inkuberet i 30 min med Poly-HRP-streptavidin (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA) fortyndet 1:5000 i PBS /1% BSA. Plader blev vasket og 100 pi TMB-substrat-opløsning (Sigma-Aldrich Co .; St. Louis, MO, USA) blev tilsat per brønd. Den kolorimetriske reaktion blev stoppet ved anvendelse af 2 N H

2SO4 og pladerne blev aflæst ved 450 nm med en ELISA-pladelæser.

IFN-y ELISPOT assay

IFN-y ELISPOT assay blev udført som tidligere beskrevet [27] at kvantificere peptidspecifikke cytotoksiske T-lymfocytter (CTL’er) efter

in vitro

ekspansion. Kort fortalt, 96 brønde ELISPOT-plader (Millipore, Bedford, MA, USA) blev overtrukket natten over ved 4 ° C med 7,5 ug /ml anti-human IFN-γ (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Pladerne blev vasket seks gange med sterilt PBS for at fjerne ubundet coating-antistof. T-celler blev podet ved 1 x 10

5 celler per brønd og inkuberet med T2-celler alene, T2-celler pulseret med et PSGR peptid (5 ug /ml) eller et irrelevant peptid som negativ kontrol. Celler stimuleret med 5 ug /ml OKT3-antistof (Ortho Biotech, Bridgewater, NJ, USA) blev anvendt som positiv kontrol. Efter inkubering prøver i 18 – 20 timer ved 37 ° C og 5% CO

2, blev pladerne vasket med vaskeopløsning. 0,75 ug /ml biotinyleret anti-human IFN-γ (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) blev tilsat, og pladerne blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur. Efter inkubation blev pladerne vasket med vaskeopløsning og inkuberet yderligere med Poly-HRP-streptavidin (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA) fortyndet 1:1000 i PBS /1% BSA i 1 time. Plader blev vasket og 200 pi af 4-chlor-1-naphthol-substrat (Sigma-Aldrich Co .; St. Louis, MO, USA) blev tilsat til hver brønd. Endelig blev pladerne vasket under rindende vand og tørret ved stuetemperatur. IFN-y pletdannende celler (SFC) blev optalt ved anvendelse af en ELISPOT-læser (CTL Technologies, Minneapolis, MN, USA).

RNA-ekstraktion og RT-PCR

RNA-ekstraktion og RT- PCR blev udført som tidligere [30] rapporterede. Kort fortalt blev totalt RNA ekstraheret fra prostatacancerceller med 1 ml Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Tre mikrogram RNA blev revers-transkriberet til cDNA i 30 pi volumen og 1 pi af hver cDNA blev anvendt i efterfølgende PCR-reaktion med et par PSGR specifikke primere: Primer 1: 5′-GAAGATCTATGAGTTCCTGCAACTTC-3 ‘, primer 2: 5’ -CCCAAGCTT TCACTTGCCTCCCACAG-3 ‘. β-actin blev anvendt som ladningskontrol: primer 1: 5’-CATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCG-3 ‘; Primer 2: 5’-CAGACTATGCTGTCCCTGTACGC-3 ‘. PCR-reaktionen blev udført under følgende betingelser: 94 ° C i 2 min, 94 ° C i 30 s, 56 ° C i 30 s, 72 ° C i 1 min 20 s, total 35 cykler, 72 ° C i 10 min, og β-actin blev kørt i 25 cykler. Lige store mængder PCR-produkter blev dernæst påført og påvises ved gelelektroforese.

cytotoksicitetsanalyse

PSGR afledt peptid-specifikke T-celler blev testet for cytotoksicitet mod både PC3 og LNCaP af en lactat dehydrogenase (LDH ) assay (Promega, Madison, WI, USA). Assayet blev udført i overensstemmelse med producentens anvisninger. LDH frigivelse blev beregnet på grundlag af følgende formel:

cytotoksicitet (%) = (Experimental – Effector Spontan – Target Spontan LDH frigivelse) /(Target Maximum – Target Spontan LDH frigivelse) × 100.

Spontan frigivelse blev bestemt ved anvendelse af supernatanten af ​​målcellerne alene eller effektorceller alene, og den maksimale frigivelse blev bestemt ved anvendelse af supernatanten af ​​målceller inkuberet med en lyseopløsning inkluderet i LDH kit. For at bestemme om T-celle-genkendelse er HLA-I begrænsede, anti-HLA-I anti-HLA-II, eller anti-CD19 mAb (alle fra ATCC, Manassas, VA, USA) blev tilsat til brøndene ved initiering af kulturen .

Intracellulær IFN-γ Cytokine Farvning

PSGR-afledte peptid specifikke T-celler (0,5-1 × 10

6) blev dyrket med 0,5 × 10

6 T2 celler pulset med eller uden peptid (5 ug /ml) i nærvær af GolgiStop (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) i en 48-brønds plade i 4 timer ved 37 ° C. Celler blev farvet med anti-CD8 og anti-IFN-γ og analyseres med en FACScalibur maskine.

Statistik

t-test blev anvendt til at analysere kvantitative forskelle mellem de eksperimentelle brønde og kontroller i ELISA og ELISPOT assays. P 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Induktion af PSGR afledt peptid-specifikke CTL’er i raske donorer

For at bestemme om PSGR-reaktive T-celle forstadier er til stede i sund. emner, vi opnåede PBMC’er fra 10 HLA-A2

+ raske donorer og stimuleret dem

in vitro

med hver af de 21 PSGR-afledte peptider indeholdende HLA-A2-bindende motiv (tabel 1). Efter 2 uger af peptid stimulering blev supernatanter fra peptid-stimulerede T-celler analyseret ved ELISA-assay til påvisning af IFN-γ frigivelse som reaktion på T2-celler pulset med eller uden tilsvarende peptider. Som vist i tabel 2, 13 PSGR-afledte peptider var i stand til at inducere peptidspecifikke T-celleresponser i mindst én af 10 raske forsøgspersoner. Vigtigere, kunne PSGR3, PSGR4 og PSGR14 fremkalde T-celle responser i 7 ud af 10 raske forsøgspersoner, hvilket indikerer, at disse 3 peptider er immunogene og potentielt i stand til at udvide antigen-specifikke T-celler hos raske forsøgspersoner.

Tilstedeværelse af PSGR peptid specifikke CTL’er i prostatacancerpatienter

Da peptid-specifikke T-celler mod PSGR3, PSGR4 og PSGR14 blev fundet i mere end 70% af raske forsøgspersoner, vi ræsonnerede, at CTL forstadier, der genkender disse 3 peptider kan også være høj i PBMCer fra patienter med prostatacancer. For at teste hypotesen, vi undersøgte, om disse tre peptidkandidater kan fremkalde peptidspecifikke CTL’er fra PBMCer fra HLA-A2

+ prostatacancerpatienter. PBMC’er fra prostata cancer patienter blev indsamlet og stimuleret

in vitro

med PSGR3, PSGR4 eller PSGR14 peptider. Som vist i tabel 3, PSGR3, PSGR4 og PSGR14 faktisk induceret peptid CTL’er fra PBMCer fra patienter med prostatacancer.

Anerkendelse af prostatakræft cellelinier ved PSGR afledte peptid-specifikke T-celler

for at opnå et stort antal PSGR peptidspecifikke T-celler til yderligere analyse, vi udvidet PSGR peptidspecifikke T-celler identificeret i tabel 2 og 3. for at bestemme en effektiv koncentration af peptid til lastning T2-celler til T-celle genkendelse udførte vi peptid titreringsforsøg. Som vist i figur 1A, for alle 3 peptider et peptid koncentration på 5 ug /ml var tilstrækkeligt til at mætte bindingsstederne af HLA-A2-molekyler på T2-celler for T celle genkendelse. Derfor vi konsekvent brugt dette peptid koncentration for pre-loading T2 celler i ELISA og /eller ELISPOT-analyser. De ekspanderede T-celler opretholdt antigen-specificitet og udskilles signifikante mængder af IFN-γ efter stimulering med T2 celler pulset med de tilsvarende peptider, men ikke med en kontrol-peptid (figur 1A, B, C, D). ELISPOT-analyse bekræftede tilstedeværelsen af ​​PSGR peptid-specifikke T-celler i udvidet T-celler (figur 1E, F, G) yderligere

Anerkendelse af T2-celler pre-loaded med titrerede koncentrationer af peptider (0-20 ug /ml) ved ekspanderede PSGR peptidspecifikke T-celler blev testet ved ELISA-assay (A). De ekspanderede PSGR3 T-celler (B og E), PSGR4 T-celler (C og F) og PSGR14 T-celler (D og G) var henholdsvis co-inkuberet med T2-celler (1 x 10

4 celler /brønd) alene i komplet medium (CM), eller med T2-celler præinstalleret med enten en tilsvarende peptid (5 ug /ml) eller et kontrol-peptid som negativ kontrol. Celler blev inkuberet i 18 -24 timer, blev IFN-γ-sekretion i supernatanten bestemt ved ELISA-assay (B, C og D). IFN-y pletdannende celler (SFC) blev optalt ved ELISPOT-analyse (E, F og G). Data er plottet som middel ± SD. Resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001 versus kontroller (T2 celler alene eller T2 celler pulset med en kontrol peptid).

for at bestemme om PSGR-afledte peptid-specifikke T-celler var i stand til at genkende og dræbe HLA-A2

+, PSGR-udtrykkende prostata kræftceller, vi brugte en HLA A2 negativ PC3 cellelinie og et HLA-A2 positive LNCaP prostatacancer-cellelinie. Ekspressionen af ​​PSGR i disse to cellelinjer blev undersøgt ved RT-PCR. I overensstemmelse med en tidligere rapport [31], PSGR blev stærkt udtrykt i LNCaP, men ikke i PC3, DU145 eller en normal prostata-cellelinje PNT1A (Figur 2 A). Som vist i figur 2B, PSGR3-, PSGR4- eller PSGR14-specifikke T-celler fra både raske donorer og patienter kunne genkende og dræbe HLA-A2 positive, PSGR udtrykkende LNCaP, men ikke HLA-A2 negativ PC3-celler. Disse resultater antyder, PSGR-specifikke T-celler genkender T-celle epitoper, som endogent bearbejdes og præsenteres af prostata tumorceller.

Ekspressionen af ​​PSGR mRNA i forskellige cellelinier, blev bestemt ved RT-PCR (A). PSGR afledte peptid-specifikke T-celler blev testet for cytotoksicitet mod både PC3 og LNCaP ved LDH-assay (B). Data fra B plottes som middelværdi ± SD. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. *

P

0,05 versus kontrol

T-celler genkender PSGR peptider i en HLA-I Begrænset Manner

For at teste, om de svar induceret. ved PSGR-afledte peptider er afhængige af CD8

+ T-celler, vi co-dyrkede PSGR-afledte peptid-specifikke T-celler med T2-celler pulset med eller uden tilsvarende peptider i nærvær af GolgiStop i 4 timer. Farvning for CD8-molekyler og intracellulær IFN-γ blev efterfølgende udført. Kun CD8

+ T-celler viste sig at frembringe IFN-γ som reaktion på T2-celler pulset med tilsvarende peptider (figur 3A), mens CD4

+ T-celler producerede ikke IFN-γ (data ikke vist).

PSGR-afledte peptid-specifikke T-celler blev co-dyrket med T2-celler pulset med eller uden et givet peptid i nærvær af GolgiStop i en 48-brønds plade i 4 timer ved 37 ° C. Celler blev farvet med anti-CD8 og anti-IFN-γ, derefter analyseret på en FACScalibur maskinen (A). PSGR-afledte peptid-specifikke T-celler blev co-inkuberet med LNCaP-celler alene i medium, eller med LNCaP-celler i nærvær af enten anti-HLA-I mAb (W6 /32), HLA-II mAb eller et kontrol-mAb (anti -CD19 mAb). Efter 4 timers inkubation blev cytotoksicitet over LNCaP bestemt ved LDH-assay (B). Data fra B plottes som middelværdi ± SD. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. *

P

. 0,05, versus kontrol

For at afgøre, om anerkendelsen af ​​LNCaP celler ved PSGR-afledte peptid-specifikke T-celler er HLA-I begrænset, vi co- dyrkede LNCaP-celler med PSGR-afledte peptid-specifikke T-celler i nærvær af enten anti-HLA-i mAb (W6 /32) eller kontrol-mAb’er (HLA-II mAb eller anti-CD19 mAb). Som vist i figur 3B, blev cytotoksiciteten af ​​disse peptid-specifikke T-celler inhiberes fuldstændigt ved tilsætningen af ​​anti-HLA-I mAb, men ikke af anti-HLA- II (HLA-DR) eller et kontrol-mAb (anti-CD19 ), hvilket tyder på, at anerkendelsen af ​​LNCaP celler ved PSGR-afledte peptid-specifikke T-celler er HLA-i begrænset.

diskussion

det er velkendt, at CD8

+ T-celler spiller en kritisk rolle i kontrollen tumorudvikling og progression. Peptidepitoper afledt af tumor-associerede antigener (TAA’er) kan genkendes som antigener af T-celler i forbindelse med MHC-I-molekyler [32], [33]. Identifikation af TAA’er og deres peptider, der genkendes af T-celler er afgørende for udviklingen af ​​effektive cancervacciner.

Formålet med den aktuelle undersøgelse var at identificere HLA-A2 bindende PSGR-afledte epitoper genkendt af CD8

+ T-celler i PBMCer fra raske forsøgspersoner og prostata cancer patienter. Tre forskellige computerbaserede prædiktionsalgoritmen herunder BIMAS, SYFPEITHI, og Rankpep blev anvendt til at scanne PSGR proteinsekvensen for HLA-A2 bindende peptider baseret på HLA-A2-bindende motiv. Kun peptider, der blev forudsagt med succes af mindst 2 af 3 af de forskellige computerbaserede prædiktionsalgoritmen blev medtaget. Enogtyve 9mer eller 10-mer peptider blev valgt i denne undersøgelse i henhold til dette kriterium. Alle disse peptider blev testet for deres evne til at stimulere PBMC’er fra enten raske forsøgspersoner eller prostatacancerpatienter at frigive IFN-γ. Af 21 peptider, tre peptider ofte induceret specifikke T celle responser i PBMC’er opnået fra enten raske forsøgspersoner eller kræftpatienter, og disse peptid-specifikke T-celler også anerkendt HLA-A2

+ PSGR-udtrykkende LNCaP-celler, hvilket antyder, at disse peptider er naturligt behandles af prostatacancerceller

PSGR er en prostata vævsspecifik gen med homologi til G-protein-koblede odorantreceptor genfamilien og det udtrykkes specifikt i humane prostatavæv [23] -. [25]. Ekspressionen af ​​PSGR er betydeligt højere i humane prostata intraepitelialneoplasi og prostatatumorer end normale væv [25]. Interessant nok selv PSGR er blevet anset for at være et hidtil ukendt mål for prostatakræft immunterapi, T-celle epitoper afledt PSGR er ikke blevet identificeret. Dette er, så vidt vi ved, den første rapport til at identificere og karakterisere PSGR-afledte epitoper genkendt af CD8

+ T-celler. Identifikationen af ​​PSGR-afledte epitoper genkendt af T-celler validerer yderligere PSGR som et lovende mål for udviklingen af ​​cancervacciner.

De fleste TAA’er er selv-antigener [34], således, self-tolerance kan forekomme i en forsøge at beskytte individet fra udvikling af autoimmunitet. Dette anses for at være en stor hindring i induktionen af ​​TAA-specifikke T-celler i stand til at udrydde tumorer

in vivo.

Men i vores undersøgelse, selvom PSGR udtrykkes i normal prostatavæv, immuntolerance mod PSGR kan blive brudt, da T-celle responser mod PSGR-afledte epitoper var ofte påvises i PBMC’er fra enten raske personer eller prostata cancer patienter.

Et stort antal immunterapi kliniske forsøg baseret på vaccinationer med tumorlysater, TAA proteiner, TAA peptider og RNA eller DNA, der koder TAA er allerede gennemført. Imidlertid har de fleste af disse forsøg ikke opnået ønskelige resultater. En af grundene er, at ekspression af disse TAA’er er heterogen blandt tumorer fra forskellige patienter og kan variere selv blandt metastaser opnået fra en patient [35], [36], således immune escape kan forekomme, når det immunterapeutiske strategi er kun baseret på én TAA. For at undgå immun flugt, vaccine-baserede immunterapeutiske strategier, der er målrettet flere tumorantigener er afgørende for udviklingen af ​​succesfulde cancervacciner. Således identifikation af yderligere prostata specifik tumor antigener, såsom PSGR, for T-celle-baserede immunterapi er stadig behov for, på trods af at en række af prostata specifikke tumorantigener herunder PSA [12], [13], PSCA [16], PSMA [ ,,,0],17] – [19]., PAP [20], Prostein [14], [15] og trp-p8 [21], er blevet identificeret i de sidste par år

FDA har for nylig godkendt en kræft vaccine, Sipuleucel-T, til behandling af patienter med fremskreden prostatacancer baseret på en fase III-undersøgelse [8]. Sipuleucel-T fremstilles ud fra autologe PBMC’er indeholdende antigen-præsenterende celler, der er inkuberet med et rekombinant protein bestående af et PAP forbundet med granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF). Sipuleucel-T virker formentlig delvist ved at øge PAP-specifikke CD8

+ T celle responser, hvilket yderligere understreger vigtigheden af ​​tumorantigen-specifik CD8

+ T-celler induceret af cancervacciner. Hidtil Sipuleucel-T er den første cellulære immunoterapeutiske middel godkendt af FDA, der skal anvendes til behandling af cancerpatienter. FDA godkendelse af Sipuleucel-T som en terapeutisk vaccine kræft ikke kun validerer effekten af ​​kræft immunterapi, men også giver et stærkt incitament inden for kræft immunologi [37]. Derfor identifikation og udvikling af mere roman TAA’er herunder PSGR og peptid derivater genkendes af CTL’er er absolut afgørende for at fremme udviklingen af ​​effektive cancer vacciner mod prostata kræft samt andre typer af kræft i fremtiden.

Desuden de epitoper genkendt af CD8

+ T-celler kan anvendes som diagnostiske værktøjer til at overvåge peptidspecifikke CD8

+ T-celler i individer under immunisering for at finde ud optimale tidsramme for immunisering under behandling, herunder hvorvidt efterfølgende der er behov for vaccinationer i individer, når anti-tumor-immunitet falder.

sammenfattende har vi identificeret tre nye PSGR-afledte CTL-epitoper. Da PSGR udtryk er stærkt opreguleret i humane prostatakræft, kan PSGR peptider tjene som diagnoseværktøj eller immunterapeutiske mål for anticancer-vacciner alene eller i kombination med andre epitoper, der er afledt fra andre prostata-specifikke antigener.

tak

Vi vil gerne takke Drs. Adebusola Alagbala Ajibade og Audrea M. Burns til kritisk læsning af dette manuskript og Hui En for assistance i figur forberedelse.