PLoS ONE: Effekter af internaliseret Guld Nanopartikler med Respekt til cytotoksicitet og Invasion aktivitet i lungekræft Cells

Abstrakt

Effekten af ​​guld nanopartikler på lungekræft celler er endnu ikke klart. I denne undersøgelse undersøgte vi cytotoksicitet og celleinvasion aktivitet af lungecancerceller efter behandling med guld nanopartikler og viste, at små guld nanopartikler kan endocytose af lungecancerceller og at de letter celleinvasion. Væksten af ​​A549-celler blev inhiberet efter behandling med 5-nm guld nanopartikler, men celleinvasion forøget. Endocytose guld nanopartikler (størrelse, 10 nm), navnlig fremmet invasionen aktivitet 95D celler. Alle disse virkninger af guld nanopartikler blev ikke set efter behandling med større partikler (20 og 40 nm). Den forøgede invasion aktivitet kan være forbundet med den øgede ekspression af matrixmetalloproteinase 9 og intercellulær adhæsionsmolekyle-1. I denne undersøgelse opnåede vi bevis for effekten af ​​guld nanopartikler på lungekræft celleinvasion aktivitet in vitro. Endvidere matrixmetalloproteinase 9 og intercellulært adhæsionsmolekyle-1, centrale modulatorer af celleinvasion, viste sig at være reguleret af guld nanopartikler. Disse data viser også, at reaktionerne fra A549 og 95D celler til guld nanopartikler har en bemærkelsesværdig forhold til deres unikke størrelse-afhængig fysisk-kemiske egenskaber. Derfor er denne undersøgelse giver et nyt perspektiv for cellebiologi forskning i nanomedicin

Henvisning:. Liu Z, Wu Y, Guo Z, Liu Y, Shen Y, Zhou P, et al. (2014) Virkninger af internaliseret Guld Nanopartikler med Respekt til cytotoksicitet og Invasion aktivitet i Lung Cancer Cells. PLoS ONE 9 (6): e99175. doi: 10,1371 /journal.pone.0099175

Redaktør: Hidayatullah G. Munshi, Northwestern University, USA

Modtaget: Februar 28, 2014 Accepteret: 12. maj 2014 Udgivet: 5 juni 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af tilskud fra National Science Foundation of China (No.81270428 og 81.300.999). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tidligere studier identificeret, at guld nanopartikler (Au-NPS) viser lidt cytotoksicitet trods deres effektive optagelse i humane celler ved endocytose [1], [2], hvilket gør dem egnede kandidater til nanomedicin. Udover deres biokompatibilitet, ændre det faktum, at de er nemme at syntetisere, karakterisere, og overflade med til at tiltrække stor opmærksomhed i forskellige biomedicinske anvendelser. Au-nationale parlamenter er blevet undersøgt som drug delivery køretøjer og fototermisk terapi og molekylære billeddiagnostiske værktøjer til potentiel biodiagnosis [3], [4]. Nanopartikel-baserede terapeutiske strategier for cancerbehandling er hovedsagelig baseret på levering af kemoterapeutiske midler til at inducere apoptose [5]. De primære grunde til at bruge nanopartikler som bærere til terapeutisk levering er at gøre det muligt for multimodale funktionaliteter, såsom billedbehandling eller specifik målretning, for at øge væv permeabilitet og stedsspecifik akkumulering, og for at mindske bivirkninger til raske væv [6]. I øjeblikket er AU-NP’er bruges i forskellige biomedicinske anvendelser: de ikke alene kan anvendes som stillads til stadig mere potent levering cancer drug men de kan også tjene som transfektionsreagenser midler til selektiv genterapi og som iboende antineoplastiske midler [7] – [9] . Dreaden et al. [8] har vist, at målrettet Au-nationale parlamenter er i stand til at ændre cellecyklus, herunder celledeling, signalering, og spredning.

På trods af den udbredte anvendelse af Au-nationale parlamenter, en klar forståelse af, hvordan biologiske systemer reagerer til nanopartiklerne er afgørende, og karakterisering af de unikke størrelse-afhængige fysisk-kemiske egenskaber Au-NP’er er en kritisk komponent. En tidligere undersøgelse beviste, at overfladen størrelse på Au-NP’er spiller en stor rolle i deres terapeutiske virkning [10]. Au-NP’er af meget lille diameter ( 2 nm) kan trænge celler og cellulære rum, såsom kernen og være yderst giftigt [11]. For eksempel blev det konstateret, at sfæriske Au-NP’er med en diameter på 1,4 nm inducere nekrose og mitochondriebeskadigelse i forskellige cellelinier via oxidativ stress mekanismer, der kan være forbundet med deres velkendte katalytiske aktivitet ved denne størrelse [12]. En nylig undersøgelse fra Connor et al. [1] rapporterede, at betydelige mængder af større Au-NP (fx 18 nm i diameter) trænge ind i celler, men at disse AU-NP’er er ikke i sig selv toksiske for humane celler. Chithrani et al. [13] studerede forholdet mellem Au-NPS og HeLa-celler og foreslog, at Au-NP’er trådte cellerne via receptormedieret endocytose i en tærskeldosis størrelse på ca. 50 nm. Da der er ingen sikkerhedsmæssige forskrifter endnu, kræver effekten af ​​Au-nationale parlamenter på celler yderligere undersøgelse.

Invasion og metastase er vigtige patologiske træk af kræftceller. Invasiv kapacitet er den vigtigste træk, der adskiller godartet fra maligne læsioner [14]. Faktisk kan invasive tumorceller undslippe kirurgisk resektion og være ansvarlig for tumor tilbagefald. Trods fremskridt i kirurgi, kemoterapi og strålebehandling, tilbagefald er næsten uundgåeligt i nærvær af en aggressiv metastatisk spredning [15], [16]. Processen for invasion og metastase omfatter celleproliferation, dissociation fra de primære læsioner, nedbrydning og permeation ind i den ekstracellulære matrix (ECM), migration i blodet eller lymfen stream, adhæsion og vækst i en sekundær organ [17]. Tidligere rapporter har beskrevet, at intercellulær adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1) og matrixmetalloproteinase 9 (MMP-9) er involveret i cancer celleadhæsion, invasion, og migration, som bidrager til cancermetastase [18]. Disse faktorer er blevet betragtet som prognostiske biomarkører for lungekræft progression [19]. Yderligere undersøgelser af virkningen af ​​Au-nationale parlamenter på ekspressionen af ​​disse proteiner er nødvendige.

Da cytotoksicitet ikke kan være den eneste effekt, at nanopartikler kan fremkalde, i denne undersøgelse har vi fokuseret på celleproliferation, invasion aktivitet, og proteinekspression, som alle kan påvirkes af tilstedeværelsen af ​​Au-NP’er. For at undersøge betydningen af ​​partikelstørrelse i nanomedicin, valgte vi fire forskellige Au-NPS størrelser (dvs. 5 nm, 10 nm, 20 nm, 40 nm) for en grundig analyse af dette system.

Endelig vi valgte at studere disse effekter på to humane lunge cancer cellelinjer (dvs. A549 og 95D), fordi lungekræft er en stor ondartet svulst i Kina og har stigende forekomst i de fleste byer. I 2010 var der ca. 600.000 nye tilfælde af lungekræft i Kina [20]. Satserne for sygelighed fortsætte med at stige hurtigt på grund af den alvorlige luftforurening [21]; dog viden om de biologiske vekselvirkninger og reaktioner fra Au-NP’er med humane lungecancerceller er meget begrænset. Desuden at opnå en grundlæggende forståelse af de involverede processer, vi følte, at det var vigtigt i første omgang at fokusere på effekterne af nanopartikler på individuelle kræftceller, snarere end på hele organer, hvor andre faktorer kan komplicere fortolkningen af ​​resultaterne. Derfor er målet med denne forskning var at give et vigtigt grundlag for at anvende Au-nationale parlamenter i lungekræft terapi.

Metoder

Forberedelse og karakterisering af citrat-afsluttet Au-nationale parlamenters

Au-NP’er (5 nm og 10 nm) blev syntetiseret under anvendelse af en garvesyre /citratopløsning, hvori garvesyre spiller rollen som et reduktionsmiddel og citrat virker som et stabiliserende middel [22]. For hver syntese blev to indledende opløsninger kræves: (a) 1 ml 1% (vægt /volumen) HAuCl

4-opløsning, som blev sat til 79 ml vand; og (b) en blanding bestående af 4 ml 1% (vægt /volumen) citratopløsning, 0,7 ml eller 0,1 ml 1% garvesyre, og vand (til opnåelse af et slutvolumen på 20 ml). Både (a) og (b) opløsninger blev opvarmet til 60 ° C i vandbad, og derefter opløsning (b) sættes til (a) under konstant omrøring. Den resulterende Au-NP’er blev afkølet til stuetemperatur (RT) i efterfølgende eksperimenter.

Synteser af 20-nm og 40 nm Au-NP’er stabiliseret ved citrationer blev udført ved anvendelse af klassiske citrat reduktion metode [23] . For hver syntese, 100 ml 0,01% HAuCl

4-opløsning blev opvarmet til kogning. Udvalgte volumener (4,5 ml eller 1,0 ml) af 1% citratopløsning blev tilsat, og kogning blev fortsat, indtil opløsningens farve blev til rubinrød. Den citrat-udjævnede Au-nationale parlamenter opløsning afkøles naturligt til RT

morfologi Au-NP blev observeret ved hjælp af transmission elektronmikroskopi. (TEM, JEM-2100EX, JEOL, Tokyo, Japan) ved accelerationsspænding på 200 kV. Ultraviolet-synlig (UV-Vis) spektre blev erhvervet med Shimadzu UV-3600 spektrofotometer i intervallet 300-1100 nm.

Cell Culture

A549 og 95D-celler (Shanghai Institutes for Biologisk Sciences, Chinese Academy of Sciences) blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (alle fra GIBCO, Invitrogen) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2. Celler blev præ-dyrket i mediet natten over og derefter behandlet enten med eller uden 50 ug /ml Au-NP’er opløsning i yderligere 48 timer. Cellerne blev høstet ved trypsin-ethylenediamintetraacetic (EDTA; GIBCO, Invitrogen) frigørelse ved den logaritmiske vækstfase og centrifugeret. Cellerne blev derefter resuspenderet i DMEM med 10% FBS for subkultur eller andre anvendelser.

Optagelse og TEM Studies

Optagelsen af ​​Au-nationale parlamenter blev også undersøgt ved hjælp af TEM. Før eksponering til AU-nationale parlamenter blev A549 celler og 95D celler forgyldt i en koncentration på 1 × 10

6 celler pr skål på en 100 mm kultur fad (Corning, USA), der indeholder vækstmediet og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO

2 i 24 timer. Au-nationale parlamenter blev derefter tilsat. Efter eksponering for Au-NP’er i 48 timer blev cellerne fikseret i 3,7% (v /v) paraformaldehyd i phosphatbufret saltvand (PBS) i 20 minutter ved stuetemperatur. Efterfølgende blev celler forberedt til TEM-analyse som følger: celler blev fikseret i 1% (vægt /volumen) osmiumtetroxid i 2 timer, dehydreres i en gradueret serie af 30%, 50%, 70%, 80% og 90% ethanol og behandlet tre gange med 100% ethanol i 15 minutter hver. Prøverne blev derefter indlejret i en blanding af harpiks i propylenoxid polymeriseret ved 80 ° C. Ultratynde snit til TEM blev fremstillet under anvendelse af en diamant kniv og prøverne blev analyseret ved anvendelse af et transmissionselektronmikroskop.

Cell Levedygtighed Assay

A549 og 95D-celler blev podet i 96-brønds plader på et lavt konfluens (2000 celler /brønd), fik lov at binde natten over og behandlet med Au-NP (kontrol, 5 nm, 10 nm, 20 nm og 40 nm). Efter 24 timer, 48 timer og 72 timer, et celleviabilitetstest reagens (Celletælling kit-8, Kaiji, Nanjing) blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 1, 2, 3, og 4 t. Absorbansværdier ved 450 nm blev optaget med et mikrokultur pladelæser (BioRad) og cellelevedygtigheden udtrykt i procent af den ubehandlede kontrol (100% cellelevedygtighed). Virkningen af ​​Au-NP’er med forskellige størrelser på levedygtigheden af ​​cellerne blev målt i tre eksemplarer, og forsøgene blev gentaget mindst tre gange.

Apoptose Detektion af Annexin V /propidiumiodid (PI) Farvning

celler i log-fase blev podet på en 6-brønds dyrkningsplade med en tæthed på 1 x 10

5 celler per brønd, inkuberet ved 37 ° C i en CO

2 inkubator, og fik lov at vedhæfte natten over. Efter behandling med Au-NP (kontrol, 5 nm, 10 nm, 20 nm og 40 nm) i 48 timer, apoptose og nekrose blev analyseret med Annexin V-PI (BD Biosciences) apoptose afsløring kit ifølge producentens anvisninger. Prøverne blev analyseret under anvendelse af en BD FACS CantoII instrument (BD Biosciences).

flowcytometrianalyse af cellecyklussen

Cellerne blev høstet under anvendelse af 0,25% trypsin med 1 mM EDTA-opløsning og fikseres i 12 timer i 70% ethanol ved 4 ° C. De fikserede celler blev derefter centrifugeret ved 3000 rpm i 15 min for at fjerne ethanolen grundigt. Cellerne blev derefter vasket to gange med 3 ml PBS, resuspenderedes i 1 ml PI farveopløsning, og inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur. Farvningsopløsningen bestod af 20 ug /ml PI og 0,2 mg /ml RNase A i PBS. Prøverne blev efterfølgende analyseret ved hjælp af en BD FACS CantoII instrument (BD Biosciences). Tyve tusinde hændelser blev indsamlet fra hver prøve. Procentdelene af celler i G0 /G1, S og G2 /M-faser af cellecyklus blev bestemt under anvendelse af ModFit software (BD Biosciences).

Invasion Assay

I invasionen assay , hængende cell culture inserts (8,0-um porestørrelse) blev præ-coatet med 50 ug /ml Matrigel (BD Biosciences) på den øvre overflade. Celler blev præ-dyrket i mediet natten over og derefter behandlet enten med eller uden 50 ug /ml Au-NP’er løsning til yderligere 48 timer, derefter blev cellerne høstet og 2,5 × 10

5-celler blev udpladet i 200 pi DMEM suppleret med 0,2% bovint serumalbumin (BSA) i toppen af ​​kammeret. Bunden af ​​brønd blev tilsat 750 pi af DMEM indeholdende 5% FBS. Invasionen assay blev udført i 48 timer i cellekultur inkubator.

Cellerne blev fikseret ved at erstatte dyrkningsmediet i bunden og toppen af ​​kammeret med 4% formaldehyd opløst i PBS. Efter fiksering i 15 minutter ved stuetemperatur, blev kamrene skyllet i PBS og farvet med 0,2% krystalviolet i 10 minutter. Efter vask af kamrene fem gange ved at dyppe dem i et stort bægerglas fyldt med dH

2O blev cellerne (nu blåt) i toppen af ​​Matrigel membranen fjernet ved hjælp af flere Q-tips. Celler blev fjernet, indtil der ikke mere blåt farvestof kunne fjernes med Q-tips. Derefter blev cellerne, der forblev var dem, der havde invaderet og havde nået bunden af ​​membranen.

Vi kvantificeret også invasionen celler ved anvendelse af QCM ™ 24-brønds celleinvasion fluorometrisk assay (Millipore) med ECMatrix-coatede indsætter, ifølge producentens instruktioner. Dette assay tilvejebringer et effektivt system til kvantitativ evaluering af invasionen af ​​tumorceller gennem en basalmembran model. A549 og 95D-celler blev dyrket i 2 dage i komplet medium, enten i fravær (kontrol) eller i nærvær af Au-NP’er (5 nm, 10 nm, 20 nm, 40 nm). Ved afslutningen af ​​behandlingen blev cellerne suspenderet i serum-frit medium og podes (2,5 x 10

5 celler /250 pi) i hver indsats af en flerlags plade kammer. Serum (10%) blev tilsat til serumfrit medium i det nedre kammer som kemoattraktant. Efter en 48-h inkubationsperiode ved 37 ° C blev ikke-invaderende celler fjernet fra toppen af ​​indsatserne. Derefter blev inserterne anbragt i en ren brønd indeholdende en forvarmet Cellefrigørelse opløsning og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter. Indsatsene blev fjernet fra brøndene, og lysepuffer /farvestof blev tilsat til mediet indeholdende de løsnede celler i 15 minutter ved stuetemperatur. Blandingerne blev derefter aflæst med en fluorescenspladelæser (Bio-Tek, Synergy HT) under anvendelse af en 480/520 nm filtersæt. Fluorescens målinger blev rapporteret som relativ fluorescens enhed (RFU) værdier.

Kvantitativ Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (QRT-PCR) Analyser

Total RNA blev isoleret fra ubehandlet og Au-nationale parlamenter-behandlede A549 og 95D-celler under anvendelse af Trizol Reagent (Invitrogen Life Technology). Revers transkription (RT) reaktion blev udført under anvendelse af 1 ug af total RNA, som revers transkriberet til cDNA under anvendelse af oligo dT primer og derefter qRT- PCR blev udført ved anvendelse af SYBR Green Mix (Applied Bio-systems). Primersekvenserne anvendt til PCR var som følger: ICAM-1, frem ACACTAGGCCACGCATCTGAT, omvendt AGCATACCCAATAGGCAGCAA; MMP-9, frem GGCTACGTGACCTATGACATCCT, omvendt TCCTCCCTTTCCTCCAGAACA; glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), frem GGAGCCAAACGGGTCATCATCTC, omvendt GAGGGGCCATCCACAGTCTTCT. PCR blev udført ved 95 ° C i 30 s, ved 60 ° C i 30 s, og 1 min ved 70 ° C i 35 cykler. Den sammenlignende Ct metode blev anvendt til at beregne den relative forekomst af mRNA’et og resultaterne for målgenekspression blev sammenlignet med dem for GAPDH-ekspression. Resultaterne blev opnået fra tre uafhængige forsøg.

Protein Kvantitative Assays Salg

MMP9 proteinekspression i supernatanten og cellelysatet blev målt under anvendelse af et MMP Panel 2 magnetiske perler kit baseret på Luminex teknologi. Kort fortalt blev MMP9 capture-antistoffer (Millipore) konjugeret til Luminex-perler (perler område 33). MMP9 afsløring antistoffer (Millipore) blev konjugeret til biotin gennem skik service leveret af Millipore. Celler blev lyseret i MILLIPLEX MAP lysispuffer (Millipore) og fortyndet med samme volumen MILLIPLEX MAP celleassay buffer (Millipore). MMP9 indfangende antistof perler blev fortyndet i 25 pi MILLIPLEX MAP-celleassay puffer og sættes til en magnetisk plade (Millipore). Derefter blev 25 pi af den fortyndede cellelysat eller cellekultursupernatant overført til hver brønd i den faste plade og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur under omrystning. Efter inkubationen blev perlerne vasket to gange med vaskebuffer, og 25 pi detektionsantistoffer blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur under omrystning. Derefter blev 25 pi MILLIPLEX MAP streptavidin-phycoerythrin (Millipore) og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur under omrystning. Endelig kondomvæske blev tilsat efter vask, og signalet blev aflæst under anvendelse af en Luminex FlexKort 3D ™.

Western blot-analyse

I western blot-analyse, A549 og 95D-celler blev udpladet på dyrkningskolber og behandlet med Au-nationale parlamenter (kontrol, 5 nm, 10 nm, 20 nm og 40 nm). Efter 48 timer, 5-10 × 10

6 celler blev høstet og lyseret med iskold lysepuffer. Lige store mængder protein blev separeret ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og elektroforetisk overført til polyvinyliden fluorid membraner. Membraner blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk i 2 timer og inkuberet natten over ved 4 ° C med kanin-anti-MMP-9-antistof (1:1000, Abcam), kanin-anti-ICAM-1-antistof (1:500, Cell Signaling), eller muse-anti-GAPDH antistof (1:10000, Abmart). GAPDH blev anvendt som husholdningsgen kontrol og ekspressionsniveauerne af MMP9 og ICAM-1 blev normaliseret i forhold til GAPDH. Proteinerne blev detekteret med peberrodsperoxidase-konjugeret anti-kanin eller anti-mus-sekundære antistoffer og visualiseret med kemiluminescens reagenser leveret med ECL kit (BioRad, USA). Immunoreaktive bånd blev påvist ved forøget kemiluminescens og kvantificeres ved hjælp af et ChemiDoc XRS molekylær imager (BioRad).

Statistisk analyse

GraphPad Prism 5 statistiske analyser software blev brugt i alle statistiske analyser udført i denne undersøgelse ( GraphPad Prism-version 5.00 til Windows, GraphPad Software, San Diego Californien, USA). Alle resultater er blevet præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (SD). Statistiske sammenligninger blev udført ved anvendelse envejs variansanalyse (ANOVA), efterfulgt af Dunnetts

t

-test for sammenligning med kontrolgruppen. Forskelle blev betragtet signifikant ved P. 0,05

Resultater

Syntese og karakterisering af Au-nationale parlamenters

Au-nationale parlamenter syntetiseret med citrat reduktion metoden uden yderligere ændringer blev brugt for alle de studier, og som her benævnes ikke-modificerede nanopartikler. At bestemme forholdet mellem størrelsen og den biologiske funktion af nanopartiklerne, vi brugte Au-NPs af fire forskellige størrelser (5, 10, 20 eller 40 nm) og karakteriseret dem ved TEM og UV-Vis spektre (figur 1). Partiklerne blev vist at være alle områder med smalle størrelsesfordelinger. Den høje elektron tætheder af Au-NP’er samt homogeniteten af ​​deres form og størrelse gjort dem meget tydeligt under transmission elektronmikroskop.

Transmission (TEM) billeder af Au-NP’er med diametre på (A ) 5 nm, (B) 10 nm, (C) 20 nm, eller (D) 40 nm. De mellemværker vise billeder i høj opløsning. Scale barer, 20 nm og 100 nm (som markeret). E: UV-vis spektra af Au-nationale parlamenter med 5-nm, 10 nm, 20 nm, og 40-nm diametre

internalisering af Au-nationale parlamenters

. for at undersøge om AU-NP’er med forskellige størrelser krydsede cellemembranen og hvor de befinder sig, blev A549 og 95D-celler inkuberet i 48 timer i nærvær af Au-NP’er (5, 10, 20 og 40 nm) i komplet celledyrkningsmedium . Figur 2 viser internalisering af det anderledes størrelse Au-NP’er. De fleste af partiklerne blev fundet i membranbundne vesikler eller i perinukleære region i cellerne.

TEM billeder ved 200-nm forstørrelse viser internaliseringen af ​​25 ug /ml Au-NP’er med forskellige størrelser (5 nm , 10 nm, 20 nm og 40 nm) i (A) A549 og (B) 95D celler efter 48 timers behandling.

Måling af cytotoksicitet Au-NP’er

Næste, forsøgte vi at bestemme virkningen af ​​disse AU-NP’er på proliferationen af ​​to forskellige lungecancer-cellelinjer, A549 og 95D-celler. Den cytotoksiske virkning på de fire Au-NP’er med forskellige diametre blev testet ved den samme koncentration. Vores resultater viste, at 5-nm Au-NP’er spille en central rolle i inhibering af proliferation af både A549 og 95D-celler ved 48 timer og 72 timer (figur 3A og B). Au-NP’er med diametre på 20 nm og 40 nm udviste bemærkelsesværdige virkningsfuldhed fra 24 timer og frem for at fremme proliferation af A549-celler, hvorimod der ikke blev observeret fremme i 95D-celler (figur 3A og B). Au-nationale parlamenter med en diameter på 10 nm havde ingen effekt på udbredelsen af ​​både A549 og 95D celler. Inhibering af celleproliferation, øget celle apoptose, og standsning celler i G0 /G1-cyklus manifesteret cytotoksiciteten af ​​5-nm Au-NP’er. Der var ingen signifikant forskel (P 0,05, ** P 0,01, *** P. 0,001

Invasion Assay

En basalmembran model blev brugt til at vurdere invasionen aktivitet af celler. Resultaterne er vist i figur 4. Vores resultater indikerede, at celleinvasion blev fremmet betydeligt efter behandling af A549 med 5-nm Au-NPs og 95D celler med 10-nm Au-NP’er (P 0,05). I modsætning hertil blev cellerne internaliserede med 20-nm eller 40-nm Au-nationale parlamenter ikke signifikant påvirket af invasion aktivitet (figur 4). Disse resultater foreslog klart, at invasionen virkninger var partikel størrelse-og celletype-afhængig.

Billederne repræsenterer A549 celler (A) og 95D celler (B), der har passeret porerne i Matrigel invasion kammer og tilsvarende resultater fluorescens intensitet. * P 0,05. Fejllinjer angiver SD værdier fra tre uafhængige forsøg.

Virkninger af Au-nationale parlamenter på ekspressionen af ​​MMP9 og ICAM-1 i lungekræft Celler

For at få en dybere forståelse af dette fænomen, QRT-PCR blev udført for at måle mRNA niveauer for MMP9 og ICAM-1 efter behandling med Au-NP’er. Resultaterne viste, at 5-nm og 10 nm Au-NP’er især lette mRNA-ekspression af ICAM-1 i begge cellelinier (figur 5B og D, P 0,05). MRNA-ekspression af MMP9 steg i 5-nm Au-NP’er-behandlede A549-celler og 10-nm Au-NP’er-behandlede 95D-celler men forskellene var ikke statistisk signifikante (figur 5A og C). Vi udførte derefter en Luminex-baseret eksperiment i nærvær af MMP9 magnetiske perler at kvantificere protein ekspression af MMP9 både i cellelysatet og kultursupernatanten. Vores resultater viste, at behandling med 5-nm Au-NP’er markant øgede niveauerne af MMP9 i lysatet af A549-celler, mens MMP9 navnlig blev opreguleret i lysatet af 95D-celler ved behandling med 10-nm Au-NPS (figur 6 A- B). De sammenligninger med niveauet af MMP9 i supernatanten afslørede, at der ikke var nogen signifikant forskel (p 0,05). Mellem Au-NP-behandlede og Au-NP-ubehandlet A549 og 95D (figur 6 C-D)

Resultater af QRT-PCR for (A-B) A549 og (C-D) 95D celler efter 48 timers inkubation med 5-nm, 10 nm, 20 nm, eller 40-nm Au-NP’er. * P 0,05, *** P 0,001 over for kontrol. Fejlsøjler angiver SD værdier fra tre uafhængige forsøg.

Kvantificering af ekspressionen af ​​MMP9 i cellelysatet (A-B), og supernatanten (C-D) af A549 og 95D-celler, henholdsvis blev udført ved anvendelse Luminex teknologi. * P 0,05. Fejlsøjler angiver SD værdier fra tre uafhængige forsøg.

Desuden undersøgte vi proteinekspression under anvendelse western blotting. Resultaterne viste, at MMP9 og ICAM-1, blev opreguleret i lysaterne af A549 og 95D-celler ved behandling med 5-nm og 10 nm Au-NP, henholdsvis (figur 7); i modsætning hertil blev MMP9 og ICAM-1 nedreguleres ved behandling med 40-nm Au-NP, hvilket antyder, at Au-NP’er partikelstørrelse spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​disse proteiner. Disse resultater gav bevis for, at MMP9 og ICAM-1, centrale modulatorer af celle invasion, kunne reguleres af Au-NP’er.

Repræsentative resultater, der viser effekten af ​​Au-nationale parlamenters behandling på ekspressionen af ​​MMP9 og ICAM 1 i A549 (A) og 95D (B) celler. Relativ band tæthed af MMP9 og ICAM-1 til middelværdien for kontrolgruppen (C-H). Værdier er udtrykt som relativ intensitet normaliseret til GAPDH intensitet og er givet som middel ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0,01, *** P. 0,001 vs. kontrol

Diskussion

De lave omkostninger produktion og relativt let at syntetisere Au-nationale parlamenter gøre dem muligt for fremtidige biomedicinske anvendelser. Men med overgangen fra Au-nationale parlamenter fra stationære til klinikken, er langt mere viden, der kræves om de grundlæggende interaktioner mellem nanoskala materialer og biologiske systemer. Den biosikkerhed og biokompatibilitet Au-nationale parlamenter er vitale bekymringer, bør godtgøres, inden sådanne materialer anvendes på biologiske systemer. I lighed med mange andre rapporter [24], [25], i denne undersøgelse, Au-nationale parlamenter blev let taget op af A549 og 95D celler via uspecifik endocytose og lokaliseret i cytoplasmiske vesikler. I denne undersøgelse har vi vist, at små Au-NP’er med en diameter på 5 nm udviser høj virkningsfuldhed til inhibering af proliferation, fremme apoptose, og standse cellecyklussen ved G0 /G1-fasen i to lungekræft cellelinier. I modsætning hertil blev der ikke indlysende cytotoksicitet observeret i 10 nm, 20 nm, og 40 nm Au-NP-behandlede celler, hvilket er i overensstemmelse med resultaterne af andre forskergrupper. Tidligere undersøgelser har vist, at overfladen størrelse, og ikke overfladeladning, spiller en stor rolle i den terapeutiske virkning af Au-NP’er [26]. Generelt Au-NP’er for drug delivery og fototermisk terapeutiske anvendelser have dimensioner større end 10 nm, hvilket er tilstrækkeligt til at formindske overfladen reaktivitet og dermed gøre guld kerner godartede. En størrelse større end 6-8 nm er også optimal for hinder renal udskillelse og dermed mindske kredsløbssygdomme halveringstid [27]. Uventet viste vores resultater, at spredning af A549 celler blev forfremmet efter 24-h behandling med Au-nationale parlamenter på 20 nm eller 40 nm i diameter. Dette fænomen blev ikke observeret i 95D celler. Desuden 5-nm Au-NPs og 10-nm fremmes signifikant invasionen af ​​A549 og 95D celler, hvorimod den invasive evne ikke blev påvirket i nærvær af partikler med en størrelse større end 20 nm. Disse resultater understøtter den opfattelse, at AU-nationale parlamenter ikke universelt målrette alle celletyper [28]. Coulter et al. fandt, at den overlevende fraktion for Au-nationale parlamenter-behandlede celler viste en stærk afhængighed af celletype sammenlignet med ubehandlede celler i forhold til strålingssensibilisering potentiale [24].

I vores undersøgelse, den forbedrede invasion evne var ledsaget af en bemærkelsesværdig opregulering af ICAM-1 og MMP-9-ekspression. Invasion gennem ECM er et vigtigt skridt i tumor metastase. Kræftceller indlede invasion ved at overholde og spredning langs blodkar væggen. Matrixmetalloproteinaser er endopeptidaser, som er i stand til at nedbryde ECM komponenter, som tillader kræftceller at få adgang vaskulaturen og lymfesystemet [29] – [31]. MMP-9 har tiltrukket sig megen opmærksomhed for sin evne til at nedbryde type IV collagen, den grundlæggende element i basalmembranen [32]. Forøget ekspression af MMP-9 i patienter med ikke-småcellet lungecancer er blevet rapporteret [33], [34]; kunne derfor midler undertrykker ekspressionen af ​​MMP’er inhibere kræft cellemigration og invasion [35]. ICAM-1 er en repræsentativ adhæsionsmolekyle involveret i interaktionen mellem tumorceller, endotelet og ECM. Høj ekspression af ICAM-1 i humane lungecancer prøver blev korreleret med en større risiko for fremskredne kræftformer (trin III og IV). A549 /ICAM-1-celler blev vist at inducere in vitro celleinvasion og in vivo tumormetastase [36]. Denissenko et al. observeret, at ICAM-1 nedregulering ved mRNA og protein niveauer førte til stærk suppression af humane bryst- celleinvasion gennem en Matrigel matrix [37]. Vi fandt, at 5-nm og 10 nm Au-nationale parlamenter fremmes effektivt udtryk for ICAM-1 og MMP9 i A549 og 95D celler henholdsvis som delvis forklares den øgede virkning af partiklerne på kræft celle invasion.

da opregulering virkninger af Au-NPs på MMP-9 og ICAM-1-ekspression i A549 og 95D celle foreslog, at små partikler kan besidde evnen til at lette invasionen af ​​lungecancerceller, yderligere in vivo-undersøgelser er nødvendige for at bekræfte mekanismerne. Sammenfattende behandling med 5-nm Au-NP’er inhiberes effektivt celleproliferation og fremmet apoptose, men det opreguleres også ekspressionen af ​​ICAM-1 og MMP9, samt øget invasionen af ​​A549-celler. I modsætning hertil Mukherjee et al. rapporterede, at Au-NP’er (5 nm i diameter) udviste antiangiogene egenskaber (dvs. hæmmede tumorigen vækst af nye blodkar) både in vitro og in vivo [38].