PLoS ONE: Integrative Analyser Identificer Osteopontin, LAMB3 og ITGB1 som Kritiske Pro-Metastatisk Gener for Lung Cancer

Abstrakt

Målsætning

At udforske de vigtigste regulerende gener forbundet med lungekræft for at reducere forekomsten og fremskridt gennem tavshed disse vigtige gener.

Metoder

for at identificere de vigtigste regulatoriske gener involveret i lungekræft, vi udførte en kombination af gen array og bioinformatik analyser at sammenligne gen transskription profiler i 3 monoklonalt cellestammer med høj, middel eller lav metastatiske evner, der var adskilt fra SPC-A-1sci og SPC-A-1 cellelinjer ved at begrænse fortynding monoclone assay. Vi analyserede derefter de gener ‘biologiske aktiviteter ved at banke ned deres udtryk i SPC-A-1sci celler ved hjælp siRNA og Lenti-viral shRNA vektorer, efterfulgt af bestemmelser af invasion og migration kapaciteter af de resulterende cellelinjer in vitro samt deres potentiale til induktion forekomst og metastase af lungecancer in vivo. For at undersøge den kliniske relevans af disse fund, vi analyserede ekspressionsniveauerne af de identificerede gener i humane lungecancer væv (n = 135) og matches tilstødende normale væv ved immunhistokemisk (IHC) farvning.

Resultater

Tre monoklonale cellestammer karakteriseret med høj, middel eller lav metastatiske evner blev udvalgt med succes. Gene array og bioinformatik analyser medført, at osteopontin, LAMB3 og ITGB1 var vigtige gener involveret i lungekræft. Knockdown af disse gener undertrykkes human lungecancer celleinvasion og metastase in vitro og in vivo. Klinisk prøve analyser viste, at osteopontin, LAMB3 og ITGB1 protein ekspressionsniveauerne var højere i patienter med lungecancer, sammenlignet med ikke-kræft tilstødende væv, og korreleret med lymfatisk metastaser.

Konklusioner

Vi bekræftede, at osteopontin, LAMB3 og ITGB1 spillede vigtige roller i forekomsten og metastase af lungecancer, således forudsat vigtige spor til at forstå molekylære mekanisme af metastaser og bidrage til den terapeutiske behandling af lungekræft

Henvisning:. Wang XM, Li J, Yan MX, Liu L, Jia DS, Geng Q, et al. (2013) Integrative Analyser Identificer Osteopontin, LAMB3 og ITGB1 som Kritiske Pro-Metastatisk Gener for lungekræft. PLoS ONE 8 (2): e55714. doi: 10,1371 /journal.pone.0055714

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: August 12, 2012; Accepteret: December 29, 2012; Udgivet: 18 februar 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Key Basic Research Program Kina (2009CB521803), og “handlingsplan for innovation” af Shanghai Videnskab og Teknologi fond (10140902400). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft fortsætter med at være den førende årsag til kræft dødsfald i verden (

1 million dødsfald om året på verdensplan) [1] – [2]. Metastase er et tegn og træk ved ondartet lungekræft og er også den vigtigste årsag til lungekræft dødsfald og behandlingssvigt [3]. Selvom over et århundrede af intenst arbejde har fokuseret på at undersøge metastatiske proces, de molekylære mekanismer, der letter progression fra carcinoma in situ til metastatisk karcinom stort set undvigende. Det er sikkert, dog, at metastaser er en dynamisk og progressiv etapevis proces. Flere særskilte trin er tydelige i den biologiske kaskade af metastase: tab af cellulær adhæsion, øget motilitet og invasionsevne, post og overlevelse i cirkulationen, spredes i nyt væv og eventuel kolonisering af et fjernt sted [4]. Betydelige skelsættende undersøgelser har fastslået, at kun visse subpopulationer af en primær tumor har den invasive og metastatiske potentiale til at gennemgå den fulde metastatiske proces af invasion, intravasation og ekstravasation [5] – [6]. Emerging fra disse undersøgelser blev to begreber grundlæggende til vores kræft leksikon: “metastatiske subpopulationer ‘og’ metastatisk ineffektivitet” [7]. Således vil en undersøgelse af de forskellige genekspressionsprofiler mellem metastatiske subpopulationer og metastatisk ineffektivitet ved gen-chip-teknologi afslører de kritiske gener involveret i kræft metastaser.

I vores tidligere arbejde, vi etableret en meget invasiv celle sublinie (SPC -A-1sci) og en svagt invasiv celle sublinie (SPC-a-1) ved in vivo selektion i NOD /SCID-mus [8]. Disse cellelinjer forudsat en passende model til at studere det metastatiske mekanisme for lungekræft. Her vi yderligere adskilt 2 monoklonalt cellestammer fra SPC-A-1sci cellelinje og et monoklonalt celle stamme fra SPC-A-1 (den parentale cellelinje), der er kendetegnet med høje, midterste eller lave metastatiske evner, henholdsvis ved at begrænse fortynding monoclone assay. Vi derefter udført gen-chip kombineret med bioinformatik analyser på disse tre stammer.

Ifølge gen array-resultater, fandt vi 2277 opreguleret og 2257 nedreguleres gener blandt de tre cellestammer. Den bioinformatik analyse viste flere detaljer om de betydelige funktioner, veje, udtryksfulde tendenser og signal strømme af disse forskellige gener. Den resulterende graf fra signalet flow model angivet vigtige regulatoriske roller for SPP1 (eller osteopontin), LAMB3, MAPK1 og JUN i metastase af SPC-A-1sci cellelinie.

Tidligere har det været rapporterede, at cellerne ændrer deres celle-celle adhæsion egenskaber, omarrangere deres ekstracellulære matrix (ECM) miljø, og omlægge deres cytoskelet at lette migration og invasion.A masse beviser har vist, at osteopontin lettede vedhæftning af celler til ECM gennem binding til flere typer af integriner (ints), forøgede ekspression og aktivitet af MMP-2, og fremmet tumorvækst og metastase ved at kalde på overlevelse pathways [9] – [13]. Laminin også fremmet celleadhæsion og migrering ved at interagere med ints [14] – [16]. Her har vi bekræftet, at knock-down af osteopontin, LAMB3 og ITGB1 faldt metastaser i produktresuméet-A-1sci cellelinie gennem en række eksperimenter både in vitro og in vivo. Disse resultater har bekræftet, at osteopontin, LAMB3, og ITGB1 spillede vigtige roller i metastase af lungekræft og tilbyde værdifulde spor til undersøgelse af metastatisk mekanisme for lungekræft.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle dyr eksperiment protokoller, der anvendes i denne undersøgelse blev godkendt af Shanghai Medical Experimental Animal Care Kommissionen på Shanghai Jiaotong Universitet (godkendelse ID ShCI-12-023).

cellelinier

Den menneskelige lunge adeno-carcinom cellelinje SPC-A-1 blev opnået fra Cellular Institute of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina). Denne cellelinje blev oprindeligt isoleret fra de kirurgiske eksemplarer af en kinesisk mand med avanceret lunge adeno-carcinom af Shanghai Bryst Hospital og Cellular Institute of Chinese Academy of Science i 1980 [17]. Den humane høj metastatisk lungecancer-cellelinje SPC-A-1sci blev etableret af Ming Yao (Shanghai Jiaotong Universitet, Shanghai Cancer Institute) [8]. Begge linjer blev dyrket i DMEM medium indeholdende 10% (vol /vol) føtalt bovint serum ved 37? C, 5% CO

2.

begrænsende fortynding Monoclone Isolation

SPC-A -1sci celler blev trypsinbehandlet og resuspenderet i DMEM ved en koncentration på 100 celler pr 10 ml, hvoraf 0,1 ml blev tilsat til hver brønd i 96-brønds plader, der allerede indeholder 0,1 ml 10% FBS DMEM. To uger senere blev hver brønd observeret under et mikroskop, og 20 monoklonale stammer af SPC-A-1sci celler blev selekteret og opformeret.

Microarray Data Analysis

Totalt RNA fra hver cellelinje blev høstet under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Total RNA blev sendt til Shanghai Biotechnology Co., Ltd (Shanghai, Kina). Total RNA blev hybridiseret på Affymetrix U133 plus 2,0 array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) og forarbejdet i henhold til Affymetrix tekniske protokoller. Statistiske algoritmer blev anvendt i analysen af ​​GeneChip udtryk data.

Bioinformatik Analyse

Gene Ontology (GO) analyse.

GO analyse blev anvendt til at analysere de vigtigste funktioner i differentielt udtrykt gener ifølge Gene ontologi, nøglen funktionelle klassificering af NCBI. Generelt Fishers eksakte test og χ

2 test blev brugt til at klassificere GO kategori, og den falske opdagelse sats (FDR) blev beregnet til at korrigere

P

-værdi, med en mindre FDR svarende til en mindre fejl i bedømme

P

-værdi. Den FDR blev defineret som, hvor N

κrefers til antallet af Fishers test

P

-værdier mindre end den χ

2 test

P

-værdier. Vi beregnede

P

-værdier for GO klassifikationer af hver differentielt udtrykte gen. Berigelse giver et mål for betydningen af ​​funktionen: som berigelse stiger, den tilsvarende funktion er mere specifik, som hjælper os til at identificere de oprindelsesgarantier i eksperimentet med mere konkrete funktionelle beskrivelser. Inden for hver væsentlig kategori, blev berigelsen (Re) givet ved:, hvor n

f

er antallet af differentierede gener i den særlige kategori,

n

er det samlede antal gener inden for samme kategori,

N

f

er antallet af differentielt udtrykte gener i hele microarray, og

N

er det totale antal af gener i microarray [18] – [21].

Gå-map.

The Go-map, en vekselvirkning netværk af de betydelige GOs af differentielt udtrykte gener, blev bygget i henhold til Gene ontologi klassifikationer at identificere interaktioner blandt de betydelige GOs direkte og systemisk. Dette kort potentielt opsummerer de funktionelle interaktioner af de differentielt udtrykte gener under sygdomstilstande [22] – [24]

Pathway analyse

Tilsvarende blev pathway analyse anvendes til at bestemme de væsentlige veje for.. de differentielt udtrykte gener, ifølge Kegg, Biocarta og Reatome. Igen, vi udnyttet Fishers eksakte test og χ

2 test for at vælge de betydelige veje, og tærsklen for signifikans blev defineret af

P

-værdi og FDR. Den berigelse blev beregnet efter ligningen ovenfor beskrevne [19], [21].

Sti-Net.

En sti-Net blev bygget til direkte og systemisk identificere interaktioner blandt de væsentlige veje de differentielt udtrykte gener ifølge interaktionerne mellem veje i Kegg databasen. Det gav et sammendrag af pathway interaktioner af de differentielt udtrykte gener under sygdomstilstande og bistået med at bestemme, hvorfor en bestemt sti blev aktiveret [23].

Signal-flow

Ekstern cellulære stimulus påvirker cellulære adfærd og er afspejlet i protein-interaktion og genekspression kinetik. Vi udledte derfor en dynamisk gen regulatorisk netværk, beregnet efter den fold ekspression af gener og interaktion i veje. Relationerne af genekspressionen dataene blev udledt ved anvendelse af en kontinuert tid tilbagevendende neurale netværk (CTRNN) som en abstrakt dynamisk model for genet tilsynsnetværk mediere den cellulære beslutning om at migrere på en ydre stimulus. Modellen beskriver den gensidige påvirkning af gener og deres stimulus respons som dynamiske elementer, uanset hvordan en sådan interaktion eller stimulation er realiseret i konkrete biologiske termer. Den CTRNN modellen er generelt beskrives som, hvor betegner tidskonstanten, betegner den eksterne indgang,

angiver vægten af ​​genet

j

i gen

jeg

, betegner forskydningen af ​​gen

j

betegner sigmoid aktivering funktion, og betegner det gen

jeg

udtryk værdi på

t

tid punkt. Ved hjælp af denne genetiske algoritme, vi skønnede modelparametre [25]

SiRNA transfektion

siRNA oligonukleotider med de følgende sekvenser blev syntetiseret ved selskab (Jima, Shanghai, Kina). Negativ kontrol siRNA, fornuft : 5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3 ‘og antisense: 5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA Att-3′; osteopontin siRNA, sense: 5’-CCA UUC UGA UGA AUC UGA U-3 ‘og antisense: 5′-AUC AGA UUC AUC AGA august G-3′; LAMB3 siRNA, sense: 5’- CCA UUC UGA UGA AUC UGA U-3 ‘og antisense: 5′-AUC AGA UUC AUC AGA august G-3′; ITGB1 siRNA, fornuft: 5’-CCA UUC UGA UGA AUC UGA U-3 ‘og antisense: 5′-AUC AGA UUC AUC AGA august G-3’. Levering af siRNA’er blev opnået ved anvendelse LipofectAMINE 2000 reagens (Invitrogen, Burlington, ON) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt, 3 × 10

5 celler /brønd blev udpladet i 6-brønds plader, dyrket natten over til opnåelse af 50-70% konfluens og derefter vasket med DMEM uden serum og antibiotika. LipofectAMINE 2000 reagens og siRNA blev blandet og tilsat til cellerne i slutkoncentrationer på 5 uL /​​brønd og 2,5 ug /brønd henholdsvis efterfulgt af inkubation ved 37 ° C i 48 timer.

Fremstilling af proteinekstrakter

Proteiner fra de dyrkede SPC-A-1sci cellelinier, der modtog siRNA behandlinger blev høstet og puljet fra 10 brønde i to plader med 6 brønde. Alle proteinekstraktion procedurer blev udført på is. Kort fortalt blev cellerne skyllet med koldt PBS, skrabet af celleskraber, overføres derefter til 1,5 ml rør og lyseret med 200 pi iskold lysepuffer pr rør. Efter en 40-minutters inkubation på is blev Homogenaterne centrifugeres ved 12.000 g i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanterne blev opsamlet efter centrifugation.All proteinekstrakter blev opbevaret ved -20 ° C.

Western blot-analyse

Anvendelse af det samlede protein isoleret ovenfor. SDS-PAGE (12%) geler blev kørt og efterfølgende overført til nitrocellulosemembraner ved 4? C. Membranerne blev blokeret i PBS indeholdende 5% mælk i 2 timer, efterfulgt af tilsætning af primære antistoffer mod osteopontin (1:400), ITGB1 (1:500), LAMB3 (1:500), og β-actin (1: 15000) primære antistoffer blev inkuberet natten over ved 4 ° C efterfulgt af inkubering med passende HRP-konjugerede sekundære antistoffer ved stuetemperatur i 1,5 timer. Membranerne blev derefter vasket med PBST (150 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 0,05% Tween-20), og specifikke proteiner blev påvist under anvendelse af HRP-systemet.

Real-time kvantitativ PCR-analyse

Totalt RNA fra de dyrkede SPC-A-1sci cellelinier, der modtog siRNA behandlinger blev høstet under anvendelse af Trizol reagens ifølge producentens anvisninger. Revers transkription blev opnået ved anvendelse Reverse Transcription Reagenser (Takara) og ifølge producentens anvisninger. Real-time PCR-analyse blev udført på en 7300 Real-Time PCR System med SDS RQ Study software (Applied Biosystems) ifølge producentens instruktioner. cDNA templates blev kombineret med SYBR Green forblanding indeholdende Rox (Takara) for at udføre de kvantitative PCR-reaktioner. Primere anvendt til kvantitativ PCR var som følger: osteopontin fremad: 5′-GACAGCCAGGACTCCATT-3 ‘; osteopontin omvendt: 5′-GATGTCAGGTCTGCGAAA -3 « LAMB3 frem: 5’-AGGCAAGAACTGTGAGCG-3 ‘; LAMB3 omvendt: 5’-GGGTTGGCGTAGGTGAGT-3 ‘; ITGB1 frem: 5’-AATGTAACCAACCGTAGC-3 ‘; ITGB1 omvendt: 5’-CAGGTCCATAAGGTAGTAGA-3 ‘; p-actin fremad: 5’-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3 ‘; p-actin omvendt: 5’-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3 ‘. Genekspression blev normaliseret for p-actin. Alle reaktioner blev kørt i tre eksemplarer.

Scratch-sårheling Assay

ridser ville healing assay blev udført med mindre ændring fra den tidligere beskrevne [26]. Celler blev dyrket til ca. 90% konfluens i plader med 24 brønde derefter sultet i lavt serum-medium (1% FBS i DMEM) natten over. En lige ridse i cellemonolaget blev foretaget under anvendelse af en 200 pi pipettespids for at simulere et sår. Cellerne blev skyllet med PBS og dyrket med 1% FBS i DMEM i yderligere 24 timer. Tre billeder pr brønd blev derefter opsamlet fra tilfældige felter under anvendelse af en CKX41 mikroskop (Olympus, Japan). Procentdelen af ​​sårede område, der var fyldt blev beregnet som følger: {(middel såret bredde – gennemsnitlige resterende bredde) /betyde såret bredde} × 100 (%)

Migration og Invasion Analyser

. cellemigration og invasion assays blev udført under anvendelse af 6,5-mm trans-brønd kamre (8 um porestørrelse, Corning) som tidligere beskrevet, med visse ændringer [27]. Celler blev podet ved 100.000 celler pr langt ind trans-brønd kamre og Matrigelcoatede trans-brønds kamre til migration og invasion assays. Brøndene blev vasket med PBS efter 24 timer for begge assays. De celler, der var migreret og invaderet til det basale side af membranen blev fikseret og farvet med H . E og analyseret for tilstedeværelsen af ​​metastaser

Menneskelige NSCLC væv

Patient prøver i denne undersøgelse blev opnået efter informeret samtykke, ifølge en fastlagt protokol, der er godkendt af etiske komité i Shanghai Jiao-Tong University School. Dataene indeholdt ikke nogen oplysninger, som kan føre til identifikation af patienterne. Matchede par (n = 135) for lungekræft væv og tilstødende noncancerous væv blev anvendt til opførelse af et væv microarray (Shanghai Biochip Co Ltd Shanghai, Kina) som tidligere beskrevet (34). Immunhistokemisk farvning blev udført for at detektere ekspressionen af ​​osteopontin, LAMB3, og ITGB1 i lungekræft væv og matchede ikke-kræft væv. De primære antistoffer mod osteopontin, LAMB3, og ITGB1 blev opnået fra Sigma (1:250), Santa Cruz (1:50), og Abgent (1:50). Scoring blev målt ved procentdelen af ​​positive celler med følgende farvningsintensiteter: mindre end 5% scorede “0”; 5-24% scorede “1”; 25-49% scorede “2”; 50-74% scorede “3”; og mere end 74% scoret “4”.

Statistical Analysis

Resultaterne er vist som middelværdi ± SD. Sammenligninger af kvantitative data blev analyseret ved Students

t-

test mellem to grupper (to-sidede,

P

0,05 blev betragtet som signifikant). Fishers eksakte test blev anvendt til at sammenligne kvalitative variabler. Analyser blev udført med SAS 9.0 til Windows.

Resultater

forskellige stammer af SPC-A-1sci cellelinje vise forskellige metastatisk Potentialer

I vores tidligere arbejde, en højt metastatisk lungecancer-cellelinje (opkaldt SPC-A-1sci) blev etableret fra de dårligt metastatisk humane lungecancer-cellelinie SPC-A-1 til tre cyklusser af in vivo selektion. Den væsentligt højere metastatisk potentiale SPC-A-1sci cellelinje i forhold til SPC-A-1 linje er blevet bevist ved en række forsøg in vivo og in vitro. At udforske årsagerne til den høje metastatiske potentiale cellelinie SPC-A-1sci, vi yderligere fået de monoklonale cellestammer SPC-A-1sci H og SPC-A-1sci M fra SPC-A-1sci celler og det monoklonale SPC -A-1L cellestamme fra SPC-A-1 cellelinie ved begrænsende fortynding klonal analyse som tidligere beskrevet, med mindre ændringer (figur 1A).

(A) Morfologi af fem monoklonale cellestammer valgt blandt SPC-A-1sci og SPC-A-1 cellelinjer ved begrænsende fortynding assay. De forældre SPC-A-1sci celler og SPC-A-1sci H og SPC-A-1sci M celle stammer alle udviser spin-form. (B) motilitet aktiviteter SPC-A1sci, SPC-A1sci H, SPC-A1sci M, SPC-A-1 og SPC-A1 L-celler blev bestemt ved ridser sårheling analyser. (C) Invasion analyser af SPC-A-1sci, SPC-A1sci H, SPC-A1sci M, SPC-A-1 og SPC-A1 L-celler (400 × forstørrelse). (D) Migration analyser af SPC-A-1sci, SPC-A1sci H, SPC-A1sci M, SPC-A-1 og SPC-A1L celler (400 × forstørrelse). Der blev udført tre uafhængige forsøg; Resultaterne udtrykkes som middelværdien + SD; * P 0,05, ** P 0,01, *** P. 0,001

For at udforske de metastatiske potentiale SPC-A-1sciH, SPC-A-1sciM og SPC-A-1L , scratch-sårheling (figur 1B) og migration og invasion assays blev udført (fig 1C, D). Resultaterne viste, at de tre monoklonale cellestammer præsenteret markant forskellige metastatiske potentialer; SPC-A-1sci H havde en metastatisk potentiale ligner den for SPC-A-1sci, SPC-A L havde en metastatisk potentiale svarende til SPC-A-1, og SPC-A-1sciM havde en mellemliggende metastatisk potentiale.

Bioinformatik Analyser af monoklonale Cell Stammer med høj, Mellem og lav metastatisk Potentialer

først identificerede vi gener udtrykkes forskelligt af mindst to i SPC-A-1sciH, SPC-A-1sciM celler sammenlignet henholdsvis til SPC-A-1L celler. Vi fandt, at i alt 4534 gener differentielt blev udtrykt som skæringspunktet mellem SPC-A-1sciH vs. SPC-A-1L og SPC-A-1sciM vs. SPC-A-1L. Af disse gener, blev 2277 gener opreguleres, og 2257 gener blev nedreguleret.

For at mere præcist at identificere de vigtigste gener relateret til lungekræft metastase, blev bioinformatik analyse anvendt til at analysere de funktionelle og pathway forskelle mellem SPC-A- 1sciM vs SPC-A-1L og SPC-A-1sciH vs SPC-A-1L, henholdsvis (figurer S1, S2). Resultaterne præsenteres i Go-map afslørede samspillet og tilskrivninger til de betydelige funktioner i de differentielt udtrykte gener. Med en tærskel

P

-værdi 0,0001, fra den funktionelle analyse af de up-reguleret differentielt udtrykte gener, fandt vi, at væsentlige funktioner hovedsageligt var forbundet med hemidesmosome forsamling, positiv regulering af erythrocyt differentiering, vesikel organisation, synaptogenese, mikrotubuli og cytoskelettet organisering og regulering, cellecyklusstop og regulering, celleadhæsion og endocytose, DNA transskription, inaktivering af MAPK aktivitet, protein aminosyrer dephosphorylering og intracellulært protein transport. Cellulær proliferation, differentiering og apoptose blev også påvirket, ledsaget af tilsvarende immunrespons og betændelse funktioner. Samtidig har de fleste af de nedregulerede differentielt udtrykte gener havde funktioner i celleproliferation herunder: DNA-replikation og regulering under mitose, spindel organisation, centrosom overlapning og cellecyklus-checkpoint, nukleotid og negativ regulering af epitelcelleproliferation samt som respons på DNA skader stimulus gennem DNA-reparation og rekombination, kromatin samling eller adskillelse, kulhydrat, lipid og aminosyrer metabolisme og andre.

Fra vejen analyse og Sti-Net, kom vi til den konklusion, at op -regulated gener deltage hovedsageligt i MAPK signalvejen, Wnt signalvejen, JAK-STAT-signalvejen, TGF-beta-signalvejen, og celleadhæsion. Identificerede gener også påvirke evnen af ​​cellen til at ændre sin cytoskelet og polaritet og er involveret i forekomsten, migration og metabolisme af tumorer. I mellemtiden, ned-regulerede gener primært deltaget i mismatch reparation og homolog rekombination eller var forbundet med PPAR, TGF-beta, og p53 signalveje, ECM-receptor interaktioner og mange metaboliske veje (tærskel

P

-værdi . 0,001) (figur S3, S4)

ifølge de væsentlige veje identificeret ovenfor og interaktioner af de differentielt udtrykte gener, der er involveret i veje (ifølge Kegg databasen), et signal-flow-model var bygget. En kvantitativ regulering netværk, det er beregnet af et neuralt netværk ved hjælp af de signalintensiteter af differentielt udtrykte gener. Bestemmes ud fra vægtforskellen mellem 2 gener og de gener, hvert gen er forbundet med, status SPP1, LAMB3, MAPK1 og Jun som nøgleregulatorer blev påvist (figur 2). Ekspressionsniveauerne af osteopontin, LAMB3, og ITGB1 blev målt ved QRT-PCR, og resultaterne var overensstemmende med genekspressionsprofilerne. Ekspressionsniveauerne af osteopontin, LAMB3 og ITGB1 var højere i SPC-A-1sci H og SPC-A-1sci M cellelinjer end i produktresuméet-A-1 L cellelinje (figur S5).

Signal-flow model af den differentierede genekspression union. Prikken repræsenterer genet og retningen af ​​linien repræsenterer retningen af ​​forordningen. Nummeret på linjen er regulering vægt: jo større vægt, jo tykkere linjen og stærkere lovgivningsmæssige evne. Pilen målfaconen af ​​linjen repræsenterer aktiveringen regulering mode.

SPC-A-1sci celler transficeret med SiRNA Against Osteopontin, LAMB3, og ITGB1 Display Lav Migration og Invasion In Vitro

at udforske roller osteopontin, LAMB3 og ITGB1 i metastaser af lungekræft, vi transficerede SPC-A-1sci celler med siRNA-osteopontin, siRNA-LAMB3 eller siRNA-ITGB1 og udførte migration og invasion assays. RT-PCR og Western blot analyse viste effektiv knock-down af osteopontin, LAMB3, og ITGB1 i SPC-A-1sci celler (figur 3A, B). SPC-A-1sci celler transficeret med enten siRNA-osteopontin, siRNA-LAMB3 eller siRNA-ITGB1 vises signifikant lavere migration og invasion kapaciteter sammenlignet med den parentale cellelinje SPC-A-1 sci (figur 3C, D). Dernæst blev osteopontin mRNA og protein udtryk niveauer målt i SPC-A-1sci som transficeret med siRNA mod LAMB3 og ITGB1, viste resultaterne knock-down af LAMB3 og ITGB1 ekspressionsniveauerne havde ingen indflydelse på OPN proteinekspression. LAMB3 og ITGB1 havde de samme resultater (fig S6A, B). For at bestemme forholdet mellem osteopontin, LAMB3 og ITGB1, vi transficeret SPC-A-1sci celler med siRNA-osteopontin + siRNA-LAMB3, siRNA-osteopontin + siRNA-ITGB1, siRNA-ITGB1 + siRNA-LAMB3 og siRNA-osteopontin + siRNA-LAMB3 + siRNA-ITGB1, migrationen og invasion evnen af ​​disse celler co-transficeret med to eller flere siRNA var betydeligt reducerede sammenlignet med invasionen og migration cellernes evne co-transficeret med en siRNA ((figurerne S6 C, D, E). resultaterne indikerer en trans-regulering rolle osteopontin, LAMB3 og ITGB1 i lungekræft metastase.

(a) RT-PCR blev udført og viste effektiv knock-down af ekspression medieres af siRNA-osteopontin, siRNA-LAMB3 og siRNA-ITGB1. (B) Western blot viste reduceret udtryk for osteopontin, LAMB3 og ITGB1. (C og D) Migration og invasion analyser af SPC-A-1sci, SPC-A1sci /siRNA-osteopontin, SPC-A-1sci /. siRNA-LAMB3 og SPC-A1sci /siRNA-ITGB1 (400 × forstørrelse) blev udført tre uafhængige forsøg, resultater udtrykkes som middelværdien + SD; * P 0,05, ** P 0,01, *** P. 0,001

Knock-down af Osteopontin, LAMB3, og ITGB1 I SPC-A-1sci celler resulterede i lav metastatisk potentiale i vivo

for yderligere at afsløre, om osteopontin, LAMB3 og ITGB1 er involveret i metastase af lungekræft in vivo, 4 til 6 uger gamle kvindelige nøgne mus randomnly var inddelt i 4 grupper og modtog hale vene injektion af 2 × 10

6 SPC-A-1sci celler transficeret med shRNA-negative kontrol, shRNA-osteopontin, shRNA-LAMB3 eller shRNA-ITGB1. Ti uger senere blev lunger indsamlet til immunhistokemisk analyse (figur 4)

Repræsentative histologiske billeder af muselunger inspiceret for tilstedeværelsen af ​​mikroskopiske læsioner (20 ×, øvre, 400 ×, lavere). Ti uger efter bag- vene injektioner med SPC-A-1sci celler stabilt udtrykker shRNAs mod den negative kontrol (shRNA-NC, venstre 1), osteopontin (shRNA-osteopontin, venstre 2), laminin β3 (shRNA-LAMB3, højre 2), og integrin β1 ( shRNA-ITGB1, højre 1).

Vi tælles også mus med lungekræft metastaser og metastatiske knuder i hver gruppe. Som vist i tabel 1, blev der få lunge nodal metastaser påvist i mus injiceret med SPC-A-1sci celler transficeret med shRNA-osteopontin, shRNA-LAMB3 eller shRNA-ITGB1. I modsætning hertil lungemetastaser var tydelige i mus injiceret med negative kontrolceller. Derfor er det klart, at osteopontin, LAMB3 og ITGB1 spiller en vigtig rolle i den metastatiske proces af lungekræft cellelinje SPC-A-1sci.

osteopontin LAMB3 og ITGB1 Expression Niveauer i lungekræft Are associeret med Advanced Clinical Stage, Histologisk Grade, og lymfeknudemetastase

for at validere effekten af ​​osteopontin, LAMB3 og ITGB1 udtryk i lungekræft, vi sammenlignede deres udtryk i menneskelige lungekræft væv (n = 135) og matchede tilstødende normale væv ved immunohistokemisk (IHC) farvning.