PLoS ONE: High-Throughput MicroRNA (miRNA) Arrays Løs Prognostisk rolle MIR-211 i bugspytkirtlen Cancer

Abstrakt

Baggrund

Kun en delmængde af radikalt resektion pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC ) patienter gavn af kemoterapi, og identifikation af prognostiske faktorer er berettiget. For nylig miRNA opstået som diagnostiske biomarkører og innovative terapeutiske mål, mens high-throughput arrays åbner nye muligheder for at vurdere, om de kan forudsige klinisk resultat. Den foreliggende undersøgelse vurderes, om omfattende miRNA udtryk profilering korreleret med samlet overlevelse (OS) i reseceret PDAC patienter.

Metode /vigtigste resultater

høj opløsning miRNA-profiler blev opnået med Toray s

3D-Gene

™ -miRNA-chip, afsløre mere end 1200 menneskelige miRNA. RNA blev succesfuldt isoleret fra paraffinindlejrede primære tumorer af 19 ud af 26 etape-pT3N1 homogent behandlede patienter (adjuverende gemcitabin 1000 mg /m

2 /dag, dag-1/8/15, hver 28 dage), omhyggeligt udvalgt efter til deres udfald (OS 12 (N = 13) vs. OS 30 måneder (N = 6), dvs. kort /lang-OS). Meget strenge statistik t-test, afstand matrix med Spearman-rangeret korrelation, og iterative metoder. Uovervåget hierarkisk analyse afslørede, at PDACs grupperet efter deres korte /lange OS klassificering, mens funktionen udvælgelsesalgoritmen RELIEF identificeret top 4 diskriminerende miRNA mellem de to grupper. Disse miRNA målrette mod mere end 1500 udskrifter, herunder 169 målrettet efter to eller flere. MIR-211 opstod som den bedste diskriminerende miRNA, med betydeligt højere udtryk i lang- vs. korte OS patienter. Udtrykket for denne miRNA blev efterfølgende vurderet ved kvantitativ-PCR i en uafhængig kohorte af laser-mikrodissekeret PDACs fra 60 resektion patienter behandlet med den samme gemcitabin regime. Patienter med lav miR-211 udtryk ifølge medianen havde en signifikant kortere median OS (14,8, 95% CI = 13,1-16,5, vs. 25,7 måneder, 95% CI = 16,2-35,1, log-rank-P = 0,004). Multivariat analyse viste, at lav miR-211 udtryk var en uafhængig faktor for dårlig prognose (hazard ratio 2,3, P = 0,03) efter justering for alle de faktorer, der påvirker resultatet.

Konklusioner /Betydning

Gennem omfattende microarray analyse og PCR validering vi identificeret mIR-211 som prognostisk faktor i resekteret PDAC. Disse resultater prompt yderligere prospektive undersøgelser og forskning på den biologiske rolle miR-211 i PDAC

Henvisning:. Giovannetti E, van der Velde A, Funel N, Vasile E, Perrone V, Leon LG, et al. (2012) High-Throughput MicroRNA (miRNA) Arrays Løs Prognostisk rolle MIR-211 i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 7 (11): e49145. doi: 10,1371 /journal.pone.0049145

Redaktør: Nathan A. Ellis, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: Juli 3, 2012; Accepteret: 4 Oktober 2012; Udgivet: November 14, 2012 |

Copyright: © 2012 Giovannetti et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra Holland Organisation for videnskabelig forskning, VENI tilskud (projekt nummer 91.611.046 (Elisa Giovannetti)) og Stimuleringfonds Open Access (Elisa Giovannetti), CCA-VICI Foundation tilskud (Elisa Giovannetti, Amir Avan, Godefridus J Peters) , AIRC Marie Curie International Fellowship (Elisa Giovannetti), og italienske minister for forskning, PRIN-2009 (Elisa Giovannetti, Niccolå Funel, Ugo Boggi). Toray Industries, Inc. er en bidragyder grundet ansættelse af Hiroko Sudo, der ydet teknisk støtte til at gennemføre dette projekt, men havde ikke en rolle i studie design. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser. I denne undersøgelse, forfatterne bruger produkter fra Toray Industries, Inc., 3D-GeneTM “til miRNA microarray, men dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om deling af data og materialer.

Introduktion

med en 5-års overlevelse på mindre end 5%, pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC), herunder mere end 90% af pancreascancer, er den mest dødbringende blandt de store solide tumorer [1]. I de senere år har der været vigtige fremskridt i forståelsen af ​​molekylær biologi af kræft i bugspytkirtlen, såvel som i diagnose og stadieinddeling. Dog er opnået, minimal fremgang i forebyggelse, tidlig diagnosticering, behandling og resultater [2].

Kirurgisk resektion er den eneste helbredende modalitet for PDAC, men kun 15-20% af patienterne har resektabel sygdom på det tidspunkt for diagnosen. Ikke desto mindre er prognosen for patienter efter fuldstændig resektion er fattige, med 3-års sygdomsfri overlevelse (DFS) hastighed, 27% (95% konfidensinterval (CI): 23-32%) og median samlet overlevelse (OS) på 15 -19 måneder [3].

Kun en delmængde af radikalt resektion PDAC patienter gavn af kemoterapi, og adjuvans behandlinger kan have betydelige toksiciteter [4]. Derfor er nye biomarkører for følsomhed over for adjuverende behandling hurtigst muligt berettiget for at individualisere den kliniske ledelse og forbedre terapeutisk resultat [5].

Omfattende undersøgelser har karakteriseret de komplekse genetiske netværk og transcriptomics ændringer ligger til grund for udviklingen og progressionen af ​​PDAC [6]. Den nylige opdagelse af microRNA (miRNA) har givet yderligere indsigt potentielt forklarer den kløft, der findes mellem tumor genotype og fænotype

miRNA er en klasse af små ikke-kodende evolutionært bevarede RNA [19] -. [23 nukleotider] der er blevet fundet i dyre- og planteceller. Som i dag, er 1921 unikke modne menneskelige miRNA opført i miRBase databasen (Release 18, november 2011) [7]. MiRNA gener transkriberes som ikke-kodende transkripter, og behandles gennem en serie af sekventielle trin, der involverer RNAse III enzymer, drosha og Dicer. De forarbejdede microRNA endelig inkorporeres i RNA-inducerede silencing kompleks (RISC) at vejlede denne komplekse at nedregulere genekspression via binding til 3’UTR af de målrettede mRNA’er. Plant og nogle dyr miRNA danner perfekte basepar med deres mål mRNA, hvilket resulterer i deres nedbrydning. Men de fleste af de menneskelige miRNA binder til deres mål 3’UTRs med ufuldkomne komplementaritet og derfor fremkalde translationel undertrykkelse [8].

Den afgørende regulerende rolle hver miRNA kontrollere ekspressionen af ​​flere gentranskripter tilbyder en unik mulighed identificere kritiske miRNA som informative biomarkører for påvisning, diagnose og prognose af tumorer, der skyldes deregulering af flere gener [9]. Denne underliggende biologiske mekanisme var sandsynligvis grunden til, at ekspressionsmønstre af 217 miRNA viste sig at klassificere kræfttyper mere præcist end de oplysninger baseret på udtryk profil ~16000 mRNA [10].

rolle miRNA i styring af proliferation /differentiering og apoptose, og deres afvigende udtryk i mange tumorer, viste, at de kunne fungere som tumor undertrykkere og onkogener, hvilket tyder på deres anvendelse til diagnostiske og terapeutiske formål. Endvidere kan udvalgte miRNA påvirke tumor ondartet adfærd og respons på kemoterapi [11].

Vores tidligere undersøgelser, der fokuserer på miR-21 viste, at både kaukasiske og asiatiske patienter huser høj ekspression af denne miRNA i deres PDAC prøver havde en væsentligt kortere overlevelse [12], [13]. Denne miRNA er blevet omtalt som en “OncomiR” (det vil sige en miRNA med onkogene egenskaber), fordi det er næsten allestedsnærværende og overudtrykt i humane tumorer. Seneste

in vivo

studier i miR-21 overudtrykkende mus model oprettet ved Cre /Tet-off teknologier, vist sin onkogene rolle, viser sin betydelig indvirkning på tumor initiering, vedligeholdelse, overlevelse og invasion [14].

Men højt gennemløb teknologiske innovationer i at opdage hundredvis af microRNA giver nye effektive måder at optrævle rolle andre centrale miRNA regulerer flere gener, der kan forklare, hvorfor patienter med lignende klinisk-patologiske karakteristika kan have betydelig variation i de kliniske resultater. Derfor, i den foreliggende undersøgelse, vi vurderet, om omfattende miRNA udtryk profilering, ved hjælp af en miRNA chip afsløre mere end 1200 typer af menneskelig miRNA, kan skelne mellem PDAC patienter med meget kort OS i forhold til langsigtede overlevende.

I især vi nøje udvalgt 26 PDAC patienter med homogene klinisk-patologiske karakteristika som gennemgik resektion med helbredende hensigt og blev behandlet med tre cyklusser af standard gemcitabin adjuverende regime. Halvdelen af ​​disse patienter havde en dystre prognose, døende inden for 1 år af diagnose, mens de øvrige 13 patienter overlevede mere end 30 måneder. Den miRNA microarray analyse blev udført i 19 prøver, der gik RNA kvalitet kriteriet, herunder 13 patienter med kort overlevelse og 6 patienter med lang overlevelse. Siden miR-211 udtryk status sig som den mest prædiktive biomarkør for behandling udfald i disse patienter, blev yderligere analyse af miR-211-ekspression udføres i en anden kohorte af 60 patienter, alle behandlet med den samme adjuverende behandling. Denne uafhængige sæt bekræftede signifikant association af miR-211 udtryk status med både OS og DFS.

Metoder

Patienter

Patienter, der fik foretaget radikal kirurgisk resektion med helbredende hensigt (pancreatico -duodenectomy, total pankreatektomi og distal pankreatektomi) ved Institut for Almen Kirurgi og Transplant, University Hospital of Pisa (Pisa, Italien), mellem 2000 og 2010 blev retrospektivt revideret ved hjælp af elektroniske patientjournaler. Blandt dem, for høj opløsning miRNA udtryk profilering vi valgt 26 patienter med lignende patologiske fund, kliniske karakteristika og behandling, men betydelig variation i de kliniske resultater. Især halvdelen af ​​disse patienter havde en meget dårlig prognose, døende inden for 1 år af diagnose og blev klassificeret som “short-OS”, mens de øvrige 13 patienter overlevede mere end 30 måneder, og blev klassificeret som “long-OS”. Kendetegnene for disse 2 grupper er rapporteret i tabel 1.

validering kohorte bestod af andre 60 radikalt resektion PDAC patienter diagnosticeret og behandlet i samme periode, med deres egenskaber også er beskrevet i tabel 1 . Alle disse patienter gennemgik gemcitabin adjuverende behandling, som tidligere beskrevet [15].

Etik

Alle patienter gav deres skriftligt informeret samtykke til indsamling og analyse prøve, og undersøgelsen har modtaget godkendelse fra den etiske komité i Pisa Universitetshospital som en opfølgende undersøgelse af forsøgsprotokollen titlen “Farmakogenetik af gemcitabin-relaterede gener i bugspytkirtelkræft: korrelation med det kliniske resultat og tolerabilitet” [15]. De ansvarlige efterforskere sikre, at denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen, de europæiske retningslinjer for god klinisk praksis og relevante nationale og regionale myndigheders krav.

Væv

Formalin Fixed Paraffin Embedded ( FFPE) sektioner blev nøje gennemgået for diagnose og tumor indhold. På grund af den lange erfaring med vores patologi laboratorium på store kohorter af radikalt resektion PDAC patienter, var der ingen problemer i at vælge områder med morfologiske defineret cancerceller [16]. De tumorer blev klassificeret og vurderet for tumor iscenesættelse og sortering som foreslået af WHO, som angivet i tabel 1.

RNA ekstraktion fra FFPE glider

Histologiske sektioner (10 um) blev fremstillet fra hver FFPE eksemplar. Paraffin blev fjernet ved xylen behandling og væv blev vasket med ethanol to gange for at fjerne xylen. Væv blev derefter behandlet med proteinase K ved 37 ° C natten over. Efter centrifugering blev supernatanten behandlet med en silicabaseret spinkolonne (Nye grænser Research Laboratories, Toray Industries Inc., Kanagawa, Japan) for at opnå oprenset totalt RNA. Graderne af RNA tværbinding og RNA-nedbrydning blev analyseret ved elektroforese under anvendelse af en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Prøverne, der viste at størstedelen af ​​RNA på 4.000 nukleotider på grund af krydsbinding, eller flertallet af RNA på 1.000 nukleotider grundet nedbrydning i elektroforese mønstre var uegnet til miRNA analyse og dermed ikke brugt. Af de 26 undersøgte prøver, 19 prøver bestået dette kriterium og anvendtes i miRNA profilering.

I de 60 prøver, der anvendes som en uafhængig validering sæt blev gennemsnitligt 5000 neoplastiske celler blev derpå dissekeret under anvendelse af Leica LMD6500 instrument (Leica, Wetzlar, Tyskland), som tidligere beskrevet [17]. Præcisionen af ​​snævre fokus af laserstrålen resulterede i fangst af individuelle celler med høj grad af nøjagtighed (fig S1). RNA blev succesfuldt isoleret under anvendelse RECOVERALL Total Nucleic Acid Isolation kit (Ambion, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), i henhold til producentens anvisninger. RNA udbytter og renhed blev kontrolleret ved 260 og 280 nm med NanoDrop®-1000 Detektor (NanoDrop-Technologies, Wilmington, USA).

miRNA

Vi udnyttet Toray 3D-Gene ™ (Toray Industries, Japan) menneskelig microRNA chips til miRNA udtryk profilering. Reproducerbarheden og sammenlignelighed til Taqman RT-PCR, og de eksperimentelle procedurer Toray s mikroarray, blev beskrevet tidligere [18], [19]. Kort fortalt blev 500 ng totalt RNA ekstraheret fra FFPE sektion analyseret for miRNA profilering hjælp microarray, 3D-Gene® miRNA oligo chip V.16 (Toray Industries) i henhold til fabrikantens protokol vE1.10. Antallet af monterede miRNA på denne microarray er 1212 i alt. Microarray blev scannet, og de opnåede billeder blev nummereret ved hjælp 3D-Gene® scanner 3000 (Toray Industries). Udtrykket for hver miRNA blev globalt normaliseret ved hjælp baggrunden-korrigeret signal intensitet af hele miRNA i hvert microarray (Beskrivelse S1).

Alle microarray data fra dette studie er i overensstemmelse med Minimum oplysninger om en Microarray Experiment (MIAME) og offentligt tilgængelig via NCBI s Gene Expression database Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/) under serien rekord GSE38781.

Samlet klyngedannelse

at udforske forskelle i ekspressionsmønstre mellem de to grupper af prøver, valgte vi miRNA, der viste en signifikant forskel i udtryk. T-testen blev udført på den lange OS og korte OS grupper for alle miRNA og dem, der ikke synes at være signifikant forskellige (p 0,05) er blevet filtreret ud. Hierarkisk ukontrollerede cluster analyse blev udført på de resterende 170 miRNA. To-halet Spearman rangeret korrelation blev anvendt til at generere en afstand matrix. Efterfølgende afstanden matrix blev brugt til at generere klynger til både miRNA og prøver ved hjælp af en hierarkisk klyngedannelse algoritme, baseret på gennemsnitlig kobling [20] – [21].

Analyse med nødhjælp og iterativ RELIEF

En funktion udvælgelse algoritme, RELIEF [22] – [24], var ansat på de fuldstændige datasæt for at finde de mest kræsne miRNA. RELIEF er en iterativ algoritme, som tildeler vægte til funktioner (dvs. miRNA udtryk værdier) i henhold til afstande mellem funktioner i og mellem grupper. Ud af de 1212 Mirs blev 703 Mirs, der har højst en manglende værdi i alle prøver valgt. Relieffet algoritme blev anvendt for at vælge de 10 højest vejer miRNA. I en følgende analyse genereret vi 100 tilfældige sæt af 6 af 13 prøver, der er klassificeret som kort. På hver tilfældig sæt prøver, kombineret med de 6 prøver klassificeret som længe RELIEF algoritmen blev anvendt til at vælge de 10 højest vejer Mirs. For alle miRNA optræder i top 10 en score blev holdt, og de 10 mest vises miRNA blev udvalgt.

Top miRNA målgener

En søgning blev udført på de forudsagte mål for de mest kræsne miRNA identificeret i vores undersøgelse ved hjælp af

Targetscan

web interface V.6.1 (https://www.targetscan.org/) og miRDB version 4.0 (https://mirdb.org/miRDB/index.html) . Efter sammenligning af alle datasæt, blev en undergruppe af gener, der var målrettet ved mere end én miRNA genereret.

revers transkription (RT) og kvantitativ-PCR-analyse af MIR-211 og MIR-4321

for at validere resultaterne af microarray analyse, vurderet vi udtryk for de mest kræsne miRNA, miR-211, samt af de sjældent undersøgt miR-4321, i en uafhængig kohorte af PDAC patienter. RNA (10-100 ng) blev revers transkriberet og den resulterende cDNA blev amplificeret under anvendelse af specifikke tilpassede TaqMan®-mikroRNA-assays (Applied Biosystems) for MIR-211 og MIR-4321. Vi udførte en foreløbig analyse af 3 endogene kontrol (RNU1, RNU6 og RNU43) i en serie på 10 PDAC celler. Da værdierne af RNU6 var tættest på de geometriske middelværdier for disse gener, brugte vi denne husholdning til en normalisering af alle følgende analyse. PCR-reaktionerne blev udført i 7500HT Sequence Detection System (Applied Biosystems) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Prøver blev amplificeret in duplo med relevante ikke-template kontroller. Amplification data blev normaliseret til RNU6 udtryk. Kvantificering af relative ekspression (rapporteret som arbitrære enheder [A.U.]) blev udført under anvendelse af ACt-metoden. Kvantitative-PCR data viste en variation koefficient på Ct altid lavere end 2% af middelværdier.

Korrelation af miR-211 og miR-4321 med resultatet

Sammenligning af klinisk information og miRNA ekspressionsniveauerne blev fremstillet under anvendelse Pearson χ

2 test og Wilcoxon test. Forholdet mellem miRNA ekspression og resultatet blev evalueret ved at stratificere patienterne i forhold til medianen ekspression værdi (høj versus lav ekspression). Analyserne af prøverne blev udført i et blindet måde i forhold til det kliniske resultat.

OS blev beregnet fra datoen for kirurgi til datoen for død, DFS blev defineret som tiden fra datoen for kirurgi til datoen af første tilbagefald eller død. Overlevelseskurver blev konstrueret ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden, og forskelle blev analyseret ved anvendelse log-rank test. De væsentlige prognostiske variabler af OS og DFS i univariat analyse indgik i multivariate analyser, ved hjælp af Cox ‘proportionale farer model.

Forholdet mellem miR-211 udtryk og resultatet blev også evalueret ved hjælp af den ukontrollerede klyngedannelse algoritme k- betyder. Denne algoritme skillevægge datapunkter i k grupper i en iterativ måde, givet et foruddefineret antal klynger k (k = 2, maksimum iterationer = 1000).

For Pearson χ

2 test, Wilcoxon-test , Kaplan-Meier kurver, log-rank test og multivariat analyse blev data analyseret ved hjælp af

SPSS V.17

statistisk software (SPSS, Inc., Chicago, IL), mens alle de andre beregningsmæssige analyser blev udført i

R Hotel (

R v.2.10.1

, pakker: statistik, dprep). Yderligere oplysninger om metoder og statistik findes i de Supplerende data.

In vitro

undersøgelser

De humane PDAC cellelinier ASPC-1, Capan-1, CFPAC-1 , HPAC, HPAF-II, MIA PaCa-2, PANC-1, PL45, og Su86.86 blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), mens fem primære cellekulturer (LPc006, LPc028, LPc033, LPc067, og LPc111) blev isoleret fra patienter på Universitetshospitalet i Pisa (Pisa, Italien), som tidligere (17) beskrevet. Cellerne blev dyrket i RPMI-1640-medier suppleret med 10% FBS og 1% penicillin (50 IU /ml) og streptomycin (50 ug /ml) (Gibco, Gaithersburg, MD). Celler blev holdt ved 37 ° C under en atmosfære af 5% CO

2 i 75 cm

2 vævskulturkolber (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Tyskland) og høstet med trypsin-EDTA i deres eksponentielt voksende fase . RNA blev ekstraheret under anvendelse af et Trizol-chloroform protokol (Sigma, St. Louis, MO). RNA udbytter og renhed blev kontrolleret ved måling af optisk densitet ved 260/280 nm med en Nanodrop® spektrofotometer. Det basale ekspression af MIR-211 blev vurderet ved QRT-PCR, som beskrevet ovenfor for PDAC væv. Amplifikationsprodukter data blev normaliseret til RNU6 ekspression, og kvantificering af relative ekspression blev udført under anvendelse af ACt-metoden.

Virkningen af ​​MIR-211 på kemosensitivitet blev evalueret i MIA PaCa-2 og LPc028 celler, ved transfektion af disse celler med forstadiepartiklerne og antisense-oligonukleotider (præ-mIR-211 og anti-mIR-211) anskaffet fra Ambion-Applied Biosystems (Assay ID, MC10168 og MH10168 henholdsvis) ved 30 nM slutkoncentration. Celler blev udpladet med 5000 celler /brønd i 200 pi RPMI med 10% FBS og 1% antibiotika. Efter 24 timer blev cellerne udsat for 0,9 pi oligofectamine (Invitrogen, Paisley, UK) i serum-frit medium, blandet i 10 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af tilsætning af 0,3 pi 6,25 pM MIR-211 precursor eller inhibitor. Celler blev også inkuberet med miRNA negative kontroller (Ambion). Efter eksponering natten over blev mediet fjernet fra brøndene og erstattet med RPMI med 10% FBS, uden antibiotika. Derefter Cellerne fik lov at vokse i yderligere 48 timer i stoffri medium eller behandlet med 1 pM gemcitabin, som beskrevet ovenfor. Yderligere kontrolbrønde blev anvendt til RNA-ekstraktion, for at evaluere transfektionseffektiviteten.

Endelig i præliminære funktionelle analyser af potentielle mål for MIR-211 forudsagt af

Targetscan

, valgte vi ribonukleotidreduktase subunit 2 (RRM2), som er en vigtig cellulær mål for gemcitabin [25]. Derfor udførte vi en RT-PCR-analyse af ekspressionen af ​​RRM2 i cellerne transficeret med præ-MIR-211 og anti-MIR-211, som beskrevet ovenfor. Disse PCR-reaktioner blev udført med primere og probe fra Applied Biosystems Assay-on-Demand genekspressionsproduktet Hs0035724, anvendelse af en tidligere valideret metode [15]. Amplifikationer blev normaliseret til GAPDH, og kvantificering af genekspression blev udført under anvendelse beregningen ΔΔCT, hvor CT er tærskelcyklen; mængden af ​​mål-genet, normaliseret til GAPDH og i forhold til de kalibrator (ubehandlede kontrolceller), er givet som 2

-ΔΔCT. Prøver blev opformeret i tre eksemplarer med relevante ikke-skabelon kontroller, og variationskoefficienten var 1% for alle replikater

Resultater

Karakteristik af patienterne

Tabel. 1 opsummerer de klinisk-patologiske karakteristika for alle de PDAC patienter evalueret i nærværende undersøgelse. De fleste patienter havde stadium-T3 klasse-2 tumorer, med positive lymfeknuder og perineurale invasion.

miRNA microarray analyse blev udført i 19 prøver, der passerede kriterium RNA kvalitet. Disse patienter omfattede 13 patienter med OS kortere end 1 år (median OS, 8,0, 95% CI, 5.4-10.6) og 6 patienter, som overlevede mere end 30 måneder (median OS, 31,0, 95% CI, 30.6-31.4). De Kaplan-Meier-kurver over disse grupper er rapporteret i Figur S2.

En yderligere gruppe på 60 patienter blev brugt som en validering kohorte, med median OS og DFS af 20,9 og 11,9 måneder, respektivt (se figur S3 for Kaplan-Meier plot). Arrangementet sats var 66,7%, og den mediane follow-up for overlevende patienter var 21,4 måneder. I denne kohorte var OS signifikant længere (p = 0,009) for patienter huser klasse 1/2 tumorer (median OS, 25,2, 95% CI, 14,7-35,7) end patienter med grad 3 PDACs (median OS, 14,8, 95% CI, 11,3-18,3) data om resultaterne efter patienternes egenskaber er rapporteret i tabel S1

miRNA microarray analyse:. samlet klyngedannelse

Efter de analytiske procedurer for normaliseringen af ​​de rå data fra microarray analyse (beskrevet i beskrivelse S1) udførte vi en t-test analyse, som resulterede i en liste over 170 miRNA som viser signifikante forskelle i ekspression mellem de to grupper (p 0,05) (tabel S2). For at udføre hierarkisk klyngeanalyse efterfølgende konstrueret vi en afstand matrix under anvendelse af to-halet Spearman korrelation test, på grund af den ikke-normal fordeling af ekspression inden prøverne. Denne klynge analyse viste en god adskillelse mellem de to grupper af prøver (kort-OS vs. lang OS), på grundlag af de væsentligt forskellige miRNA (figur 1).

For at udføre hierarkisk klyngeanalyse vi konstrueret en afstand matrix under anvendelse af to-halet Spearman korrelation test, på grund af den ikke-normal fordeling af ekspression inden prøverne. Klyngen analyse viser en god adskillelse mellem de to grupper af prøver, baseret på de meget forskellige miRNA. De udtryk data microRNA var centreret ved 2 retninger (dvs. ved miRNA og patienter). Rød og gul repræsenterer lav og høj miRNA udtryk henholdsvis

miRNA microarray analyse:. RELIEF og iterativ RELIEF

RELIEF algoritme blev ansat på det komplette datasæt, som beskrevet i metoder. Denne algoritme tildelt scoringer til hver miRNA efter, hvor godt det diskriminerede de to grupper af prøver (fx prøver fra korte OS

versus

prøver fra lange-OS patienter). Dette resulterede i en top 10 af mest kræsne miRNA. Figur S3 viser klyngen analyse baseret på de 10 miRNA, mens tabel 2 viser denne gruppe af top 10 miRNA og deres tildelte scores.

Efter at have observeret, hvordan pointene blev fordelt (figur S4), valgte vi de første fire (miR-211, miR-4321, miR-1207-3p og miR-326) blandt denne top 10 og udført en klyngeanalyse.

Som det fremgår af figur 2, denne top 4 miRNA klart adskilte de to grupper af patienter. Med undtagelse af et tilfælde (S2), som viste meget høje ekspressionsniveauer værdier for alle de undersøgte miRNA, de to vigtigste klynger på X-aksen svarer til de to grupper (kort /lang-OS). Især da farverne i Heatmap viste den relative ekspression af miRNA tværs af alle prøver, vi observerede to typer udtryk profiler, et, hvori ekspressionen var lavere i patienter med en kort-operativsystem (for MIR-211, miR -1207-3p, mIR-326) og én, som mønsteret var overfor (for mIR-4321). Omvendt patienter med længerevarende OS havde højere udtryk værdier for miR-211, miR-1207-3p, miR-326, og lavere ekspression værdier for miR-4321.

Farverne er normaliseret, og kan kun sammenlignes venstre mod højre.

for at bekræfte de mest diskriminerende miRNA vi udført en ekstra analyse ved hjælp iterativ RELIEF. Som observeret fra tabel S3, top 10 Mirs var de samme, bortset fra miR-1200 og miR-766, der erstattede miR-197 og miR-1296. Men rækkefølgen af ​​de iterative RELIEF scoringer viste, en klarere adskillelse mellem top 4, og de nederste 6 mest diskriminerende miRNA (figur S6). På den måde viste vi, at de øverste 4 miRNA ikke var forudindtaget mod nogen bestemt prøve. Som rapporteret i tabel 2, de miRNA, der dukkede op i top 4 ved hjælp af RELIEF tilgang optrådte også i top 4 i den iterative RELIEF analyse, hvilket tyder på, at udtrykket profil af disse 4 miRNA kan bruges til trygt at skelne mellem patienter med short-OS og patienter med længerevarende OS.

Target forudsigelse for de øverste miRNA kandidater

identitet, kromosomale placering og antal målgener af miRNA kandidater identificeret i vores undersøgelse er sammenfattet i tabel 3. for at få yderligere indsigt i de biologiske veje potentielt reguleret af miRNA, vi næste udført en omfattende sammenligning mellem de forudsagte målgener for vores top 4 miRNA kandidater i henhold til

Targetscan

og

miRDB

. Vigtigere er det, i

Targetscan

forudsigelse omkring 10% af disse gener blev forudsagt at være rettet med 2 miRNA, med 13 gener målrettet med tre miRNA og et gen målrettet efter alle de fire forskellige miRNA (tabel S4).

analyse af den prognostiske rolle miR-211 og miR-4321 i en uafhængig kohorte af PDAC patienter

RT-PCR-analyse af miR-211-ekspression i 60 uafhængige PDAC prøver blev anvendt at validere den prognostiske betydning af denne miRNA. Denne validering gruppe ikke adskiller sig væsentligt i forhold til klinisk-patologiske karakteristika sammenlignet med den oprindelige kohorte af patienter (tabel 1).

udtryk for miR-211 kunne påvises i alle disse prøver, og patienterne blev oprindeligt kategoriseret efter medianen ekspression værdi mIR-211 (12,8 AU), ifølge den gaussiske fordeling af udtrykket værdier, som beskrevet i figur S7.

Bemærkelsesværdigt mIR-211-ekspression varierede signifikant mellem klasse 1/2 ( N = 30) og grad 3 (N = 30) tumorer (P = 0,006 i Wilcoxon-rank-sum-test). I modsætning hertil blev der ingen forskel påvist i miR-21 ekspressionsniveauerne ifølge andre klinisk-patologiske parametre (tabel S5).

En stærk korrelation af miR-211 udtryk status og kliniske resultat blev demonstreret. Den høje MIR-211 ekspression gruppe havde en bedre prognose end den lave ekspression gruppen. Patienter med miR-211-ekspression under median (lav miR-211) havde en signifikant kortere median OS (14,8 måneder, 95% CI, 13.1-16.5 måneder) sammenlignet med patienter med MIR-211 udtryk højere end median (median OS, 25,7 måneder , 95% CI, 16.2-35.6 måneder, HR = 3,0, 95% CI, 2,1-8,9, P 0,001). Lignende resultater blev opnået med DFS kurverne for patienter med MIR-211 ekspression over medianen, med en median DFS på 16,7 sammenlignet med 9,3 måneder hos patienter med den laveste MIR-211-ekspression (P = 0,004). De OS og DFS Kaplan-Meier kurver er vist i figur 3A-B.

Omvendt blev ekspression af miR-4231 ikke korreleret til resultatet i samme kohorte af patienter (figur S8). Patienter med miR-4231 udtryk under medianen kun havde en tendens til en betydelig længere median OS sammenlignet med patienter med miR-4231 udtryk over medianen (25,8 måneder, 95% CI, 18.2-32.3 måneder, vs 16,7 måneder, 95% CI, 13.7-19.7 måneder, P = 0,194). Ligeledes blev der ikke observeret signifikante forskelle for median DFS (13,0 måneder, 95% CI, 8.4-17.6 måneder vs 10,0 måneder, 95% CI, 2.0-17.9 måneder, P = 0,581).

Men i betragtning af, at der var en god korrelation mellem ekspressionen af ​​MIR-211 og OS, som vist i figuren S8 (r = 0,724) vi analyseret yderligere MIR-211 udtryk data under anvendelse K-means gruppering (k = 2).