PLoS ONE: PD-1 blokade og OX40 Udløsning Synergistisk Beskytter mod tumorvækst i en murin model af kræft i æggestokkene

Abstrakt

co-hæmmende receptor Programmeret Død-1 (PD-1) begrænser immunreaktioner og forhindre autoimmunitet, men tumorer udnytte denne vej at flygte fra immun ødelæggelse. Den co-stimulatoriske receptor OX40 opreguleres på T-celler efter aktivering og øger deres klonal ekspansion, overlevelse og cytokinproduktion ved indgreb. Selvom antagonistisk anti-PD-1 eller agonistiske anti-OX40-antistoffer kan fremme afstødning af adskillige murine tumorer, nogle dårligt immunogene tumorer var refraktære over for denne behandling. I den foreliggende undersøgelse vurderede vi de antitumorvirkninger og mekanismerne i kombinatorisk PD-1 blokade og OX40 udløsning i en murin ID8 ovariecancer model. Selvom individuelle anti-PD-1 eller OX40 mAb behandling var ineffektiv i tumor beskyttelse mod 10-dages etableret ID8 tumor, kombineret anti-PD-1 /OX40 mAb behandling markant inhiberede tumorudvækst med 60% af musene tumorfri 90 dage efter inokulation af tumor . Tumor beskyttelse var forbundet med en systemisk immunrespons med hukommelse og antigenspecificitet og krævede CD4

+ -celler og CD8

+ T-celler. Anti-PD-1 /OX40 mAb behandling øget CD4

+ og CD8

+ celler og nedsat immunosuppressiv CD4

+ foxp3

+ regulatoriske T (Treg) celler og CD11b

+ GR 1

+ myeloide suppressor celler (MDSC), der giver anledning til væsentligt højere forhold mellem både effektor CD4

+ og CD8

+ celler til treg og MDSC i bughulen; Kvantitative RT-PCR-data viste yderligere induktion af en lokal immunstimulerende milieu af anti-PD-1 /OX40 mAb behandling. Miltcentret CD8

+ T-celler fra kombineret mAb-behandlede mus producerede høje niveauer af IFN-γ upon tumorantigen stimulering og udviste antigenspecifik cytolytisk aktivitet. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse teste antitumorvirkninger af kombineret anti-PD-1 /OX40 mAb i en murin ovariecancer model, og vores resultater tilvejebringer et rationale for kliniske undersøgelser, der evaluerede ovariecancer immunterapi ved hjælp af denne kombination af mAb.

Henvisning: Guo Z, Wang X, Cheng D, Xia Z, Luan M, Zhang S (2014) PD-1 blokade og OX40 Udløsning Synergistisk Beskytter mod tumorvækst i en murin model af kræft i æggestokkene. PLoS ONE 9 (2): e89350. doi: 10,1371 /journal.pone.0089350

Redaktør: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, Japan

Modtaget: November 10, 2013; Accepteret: 20 Jan 2014; Publiceret: 27 feb 2014

Copyright: © 2014 Guo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Free Forsker projekt af Shengjing Hospital (No.200806). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Baggrund

Ovariekarcinom (OC) er den mest dødbringende malignitet hos kvinder, med 22,280 nye tilfælde og 15,460 dødsfald anslået i USA for 2012 [1]. Den høje dødelighed fra OC skyldes primært den avancerede stadium af sygdommen på diagnosetidspunktet. kræftformer tidlige fase kan helbredes i op til 90% af patienter med de nuværende behandlinger [2], men denne sats falder væsentligt for fremskreden sygdom med ca. 30% af patienter med fremskreden OC overlever 5 år efter første diagnose [3]. Standarden behandling for kræft i æggestokkene er kirurgisk debulking efterfulgt af platin-taxan kemoterapi [4]. Selv om de fleste patienter reagerer på kemoterapi ved første, vil hovedparten af ​​dem til sidst har et tilbagefald og dø af sygdommen. Derfor er et presserende behov for nye strategier til at forbedre resultaterne af kræft i æggestokkene.

Akkumulerende tyder på, at immunterapi bør være effektive til OC behandling [5]. For det første OC celler udtrykker mange tumorassocierede antigener mod hvilke der er detekteret specifikke immunresponser [6] – [10]. For det andet, de undersøgelser, banebrydende ved Coukos og kolleger angiver tumor immunrespons er en kritisk faktor for kliniske resultater hos patienter med OC, der understøttes af den tætte sammenhæng mellem overlevelse for patienter og tumor infiltration med CD3

+ T-celler i den store kommenteret kliniske prøver [11]. For det tredje, selv om OC er en ødelæggende sygdom, metastaser ofte begrænset til peritonealhulen hvor tumormikromiljøet er direkte tilgængelig, hvilket fjerner behovet for systemisk levering af immunstimulerende behandlinger [12]. På trods af den rigelige beviser til støtte OC immunterapi, har klinisk succes med immun-baserede terapier for OC generelt været beskeden [13].

Programmeret Død 1 (PD-1) protein er en vigtig coinhibitory receptor på T-celler med en struktur, der svarer til den for CTLA-4, men med en distinkt biologisk funktion og ligandspecificitet [14]. PD-1 fungerer primært i perifere væv, hvor T-celler kan støde den immunsuppressive PD-1-ligander PD-L1 (B7-H1) og PD-L2 (B7-DC), der udtrykkes af tumorceller, stromale celler eller begge dele [15], [16]. Blokade af interaktionen mellem PD-1 og PD-L1 potentierer T-celle-immunresponser in vitro og medierer præklinisk antitumoraktivitet [16] – [18]. PD-L1 er den primære PD-1 ligand, som opreguleres i faste tumorer, hvor det kan inhibere cytokinproduktion og den cytolytiske aktivitet af PD-1

+ tumor-infiltrerende CD4

+ og CD8

+ T-celler [14], [19]. Disse funktioner gør PD-1 /PD-L1 vej et lovende indgriben mål for tumor immunterapi, der er valideret af den nyligt rapporteret resultater fra to kliniske undersøgelser, der viser mAbs specifikke for PD-1 og PD-L1 udløse en imponerende antitumor effekt i ikke- småcellet lungecancer, melanom og renal-celle cancer med fuldstændig regression opnået hos nogle patienter [20] – [22]

OX40 (aka CD137) er et costimulerende molekyle, der tilhører TNF-receptorfamilien udtrykt primært på. aktiverede effektor T (T eff) celler og naive regulatoriske T-celler [23]. Ligering af OX40, primært på CD4

+ T-celler, aktiverer NF-KB-vejen og opregulerer antiapoptotiske molekyler fra Bcl-2-familien, hvilket fører til T-celle klonal ekspansion, aktivering, hukommelse og cytokinproduktion [24] – [26]. OX40 engagement på CD4

+ foxp3

+ Treg celler fører til ekspansion, deaktivering, eller celledød afhængig af den lokale miljø [27] – [30]. Da OX40 udløsning kan potent stimulere T-celler og potentielt blokere /fjerne regulatoriske T-celler, der OX40 agonister blevet undersøgt i flere prækliniske tumormodeller [31] – [34] og et anti-humant OX40 monoklonale antistof undersøges i øjeblikket i kliniske forsøg (registreringsnumre kliniske forsøg numre NCT01303705, NCT01416844, NCT01862900, NCT01644968 og NCT01642290).

Selvom antagonist PD-1 eller agonistiske OX40 antistoffer kan fremme afvisning af nogle murine tumorer, men dårligt immunogene tumorer såsom ID8 ovariecancer ikke reagerer på antistof terapi alene [35]. Vi antager, at kombineret PD-1 blokade og OX40 aktivering vil fremme antitumor immunitet. Her, under anvendelse ID8 murine ovariecancer model, viser vi, at kombineret anti-PD-1 /OX40 mAb behandling undertrykte signifikant de 10 dage etableret peritoneal ID8 tumorvækst, hvilket resulterer i 60% af behandlede mus tumorfri 90 dage efter tumorinjektion. Nærmere undersøgelse afslørede, at kombineret anti-PD-1 /OX40 mAb fremtrædende øgede effektor T-celler og svækkede de immunsuppressive celler i tumor sites med induktion af systemisk antigen-specifik CTL-respons.

Metoder

Mus

Kvindelige C57BL (6-8 uger gamle) blev købt fra Animal Forsøgscenter i Kina Medical University. brug Animal blev godkendt af Institutional Review Board of China Medical University

Cell Culture

ID8, en klon af den MOSEC ovariekarcinom af C57BL /6 oprindelse var en gave fra Dr. George Coukos ( University of Pennsylvania, Philadelphia, USA) [36]. Murine B16 melanomceller, TC1 lungekræft og T-cellelymfom EL4-celler blev erhvervet fra ATCC (Manassas, VA). Tumorceller blev dyrket i komplet DMEM-medium suppleret med 10% FBS (Thermo Scientific, Rockford, IL), blev 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin før cellesuspensioner fremstillet og transplanteret til mus. De EL4-celler og splenocyter blev holdt i et komplet medium af RPMI-1640 suppleret med 10% FBS, 25 mM HEPES, 2 mM glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin.

monoklonale antistoffer ( mAb’er)

Terapeutisk anti-OX40 (klon OX-86; Catalog #: BE0031), anti-PD-1 (klon RMT3-23; Catalog # BE0115), anti-CD4 (klon GK1.5; Catalog #: BE0003-1), anti-CD8 (klon 2,43; Catalog #: BE0061), anti-NK1.1 (Clone PK136; Catalog #: BE0036) og kontrol rotte-IgG2a-mAb (klon 2A3; Catalog #: BE0089) blev indkøbt fra BioXcell (West Lebanon, NH). Antistoffer anvendt til flowcytometri blev købt fra Tianjing Sungene (Tianjing, Kina) og eBioscience (San Diego, CA).

Dyreforsøg

Mus (5 eller 10 mus /gruppe) blev injiceret intraperitonealt (ip) med 1 × 10

6 ID8 celler i 0,1 ml PBS. På dag 10, 14 og 18 efter podning med tumoren, hver mus modtog i.p. injektion af 200 ug af kontrol, anti-PD-1, anti-OX40 eller anti-PD-1 /OX40 mAb i 200 pi PBS. Musene blev vejet to gange ugentligt og kontrolleres dagligt for kliniske tegn på hævede maver vejledende af ascites dannelse og for tegn på toksicitet såsom åndedrætsbesvær, mobilitet, vægttab, diarré, krum kropsholdning, og manglende spise, mens histopatologi blev udført på vigtige organer (dvs. lever, nyre, tarme, lunger, og colon). Efter institutionelle retningslinier blev mus dræbt, da de udviklede ascites og havde en vægtforøgelse 30%. De peritoneale tumorer blev opsamlet og vejet, blev overlevelsen af ​​hver mus registreres og samlet overlevelse blev beregnet.

I immunologisk hukommelse evaluering, samlet (2 uafhængigt forsøg) 12 langsigtede overlevende mus (90 dage efter første tumor injektion) fra kombineret anti-PD-1 /OX40-terapi gruppe eller alders-matchede naive mus (der tjente som kontrol) blev provokeret ip eller subkutant (s) med 1 × 10

6 ID8 celler eller 1 × 10

6 syngene men antigent forskellige TC1 celler. Tre vinkelrette diametre af s.c. tumorer blev målt hver anden dag under anvendelse af en skydelære og tumorvolumener blev beregnet ifølge formlen: 1/2 × (længde) x (bredde)

2. Mus blev aflivet, når de syntes døende eller deres tumorer nåede 10 mm i diameter. Overlevelsen af ​​hver mus blev registreret og samlet overlevelse blev beregnet.

I udtømning af lymfocytundergrupper blev mus injiceret i.p. med 500 ug mAb mod CD8, CD4, eller NK1.1, 1 dag før og to dage efter tumorprovokation, efterfulgt af injektion af 200 ug hver 5 dage under hele forsøget. Effekten af ​​cellereduktion blev verificeret ved farvning perifere blodleukocytter for specifikke delmængder efter depletion (data ikke vist).

Evaluering af peritoneale immunceller (PIC)

Mus, der var blevet transplanteret i.p. med ID8 celler blev aflivet 7 dage efter, at de var blevet behandlet med kontrol, single eller kombineret mAb kombination beskrevet som i dyreforsøg. Til opnåelse PIC, 3 ml PBS blev injiceret i peritonealhulen af ​​mus med ID8 tumorer umiddelbart efter eutanasi, deres mave blev masseret og fluidet blev fjernet, filtreret gennem en 70 uM cellesigte (BD Biosciences), vasket og immune celler blev isoleret ved anvendelse af en muse-lymfocyt isolation puffer (Cedarlane, Burlington, Ontario) ved at følge producentens instruktioner, og de fleste af de resulterende celler ( 95%). var CD45-positiv immunceller som bekræftet ved flowcytometrisk analyse (figur S1)

i flowcytometrisk farvning blev enkeltcellesuspensioner af PIC vasket med FACS-farvning buffer og inkuberet med muse-Fc-receptor bindende inhibitor (eBioscience) i 10 minutter før farvning med mAb’er (Tianjing Sungene) mod muse CD45 (klon 30-F11), CD3 (klon 145-2C11), CD4 (klon GK1.5), CD8 (klon 53-6.7), CD19 (klon eBio1D3), CD11b (klon M1 /​​70) og Gr-1 (klon RB6-8C5), CD44 ( klon 1M7) og CD62L (klon MEL-14) i 30 minutter. For intracellulær farvning af foxp3 (klon FJK-16 s; eBioscience) blev cellerne fikseret, permeabiliseret og farvet efter instruktion af Cytofix /Cytoperm kit (BD Bioscience). Flowcytometri blev udført under anvendelse FACSCalibur (BD Biosciences) og populationen af ​​immunceller blev valgt af gating CD45-positive celler. Dataene blev analyseret under anvendelse Flow Jo software (Tree Star, Ashland, OR). Alle flowcytometri eksperimenter blev udført mindst 3 gange.

Kvantitativ RT-PCR

Totalt cellulært RNA blev ekstraheret under anvendelse af RNeasy Mini Kits (Qiagen, Hilden, GA) og revers transkriberet til cDNA ved anvendelse SuperScript III revers transkriptase (Invitrogen). Udtryk for gener af interesse blev analyseret i PIC på dag 7 efter den tredje injektion af mAb. Primerne til alle testede gener, herunder intern kontrol GAPDH, blev syntetiseret af Invitrogen, Shanghai, Kina. Primersekvenser var som follows:GAPDH:For:5′-GTGGAGATTGTTGCCATCAACG-3′,Rev:5′-CAGTGGATGCAGGGATGATGTTCTG-3′;T-bet:For:5′-CGGTACCAGAGCGGCAAGT-3′, Rev: 5′-AGCCCCCTTGTTGTTGGTG-3 ‘; Foxp3: Til: 5’-CAGCTGCCTACAGTGCCCCTAG-3 ‘, Rev: 5′-CATTTGCCAGCAGTGGGTAG-3′; IFN-γ for: 5’-AAAAACCTAAAAAATCTAAATAACT-3 ‘, Rev: 5′-ATCAACAACAACTCCTTTTCCACTT-3′; IL-10: Til: 5’-CTCTTACTGACTGGCATGAGG-3 ‘, Rev: 5′-CCTTGTAGACACCTTGGTCTTGGAG-3’. Kvantitativ real-time PCR blev udført via ABI PRISM 7500 Real-Time PCR systerm (Applied Biosystems) med 1 × SYBR Green Universal PCR Mastermix (Takara). Transkriptniveauer blev beregnet i henhold til den 2-ΔΔCt metode, normaliseret til ekspressionen af ​​GAPDH, og udtrykt som fold ændring i forhold til kontrollen.

Analyse af IFN-γ og IL-10 produktionen af ​​PIC

Mus injiceret ip med 1 × 10

6 ID8 celler 10 dag tidligere blev injiceret tre gange på 4 dages interval med 200 ug kontrol eller anti-PD-1 /OX40 mAb. Syv dage efter den sidste mAb injektion, samlet PIC (2 × 10

6 /brønd) høstet fra behandlede mus blev derefter stimuleret med 50 ng /ml PMA og 1 ug /ml ionomycin i 6 timer før analysen af ​​IL- 10 og IFN-γ-sekretion i kultursupernatanter af muse-IFN-γ /IL-10 Quantikine ELISA Kit ifølge manualen. (R alle fra genscript, Nanjing, CA) i 3 dage. IFN-γ i supernatanterne blev bestemt ved Mouse IFN-γ Quantikine ELISA Kit (R Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas) plus sekundært antistof eller sekundært antistof alene blev anvendt som positiv eller negativ kontrol. Forholdene mellem gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) fra positiv kontrol eller sera til MFI fra negativ kontrol blev beregnet.

Statistik

Resultaterne blev udtrykt som gennemsnit ± SEM. Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af GraphPad Prism 5. Students t-test blev anvendt til at sammenligne statistisk forskel mellem to grupper og envejs ANOVA blev anvendt til at sammenligne tre eller flere grupper. Overlevelsesrater blev analyseret under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og evalueres med log-rank test med Bonferroni korrektion. Signifikante forskelle blev accepteret ved p. 0,05

Resultater

Kombineret anti-PD-1 /OX40 mAb behandling inducerede en synergistisk antitumor effekt i ID8 tumor-bærende mus

Vi evalueret antitumorvirkningen af ​​enkelt eller kombineret anti-PD-1 og anti-OX40-mAb i C57BL /6-mus transplanteret ip 10 dage tidligere med 1 × 10

6 ID8 celler. Ubehandlede mus og mus behandlet med en kontrol mAb udviklet ascites omkring 30 dage efter inokulation af tumor og måtte ofres som tidligere [38] beskrevet. Som vist i figur 1A, enten enkelt mAb havde lidt indvirkning på væksten på 10 dage, der er etableret ID8 tumor, der fører til ascites-dannelse på næsten samme tid som ubehandlede eller kontrol-mAb-behandlede mus; dog kombineret anti-PD-1 /OX40 mAb behandling signifikant øget samlet overlevelse af mus med 60% (6 ud af 10 mus) af mus tumorfrie (bekræftet ved laparotomi) 90 dage efter tumor injektion (p 0,001 kombineret mAb sammenlignet til enkelt eller kontrol mAb), og selv mus bukkede under for tumorvækst havde også signifikant forlænget gennemsnitlig overlevelsestid (MST) i forhold til kontrol eller enkelt mAb behandlede mus (figur 1B, MST 30,90, 34,00, 34.00and 75,75 dage til kontrol, anti- PD-1, anti-OX40 og anti-PD-1 /OX40 gruppe; p 0,001 kombineret mAb sammenlignet med enkelt eller kontrol-mAb). Vægten af ​​tumormasser fra mus behandlet med kombineret mAb også i høj grad faldt sammenlignet med det fra kontrol- eller enkelt mAb-behandlede mus (figur 1C). En gentagelse af forsøget gav lignende resultater (data ikke vist). I disse dyreforsøg, vi ikke observere nogen indlysende toksicitet såsom vægt eller hårtab hos mus, der fik en enkelt eller kombineret anti-PD-1 /OX40 mAb. Desuden har vi heller ikke registrere nogen udtryk for PD-1 og OX40 molekyler og deres respektive ligander PD-L1 /PD-L2 og OX40L på overfladen af ​​ID8 ovariecancer celler (data ikke vist), med undtagelse af muligheden for, at hæmning af ID8 tumorvækst

in vivo

direkte medieret af anti-PD-1 eller anti-OX40 mAb.

A, mus (10 mus per gruppe) transplanteret ip med 1 × 10

6 ID8 celler 10 dag før blev behandlet tre gange med 200 ug af kontrol, anti-PD-1, anti-OX40 og anti-PD-1 /OX40 mAb ved 4 dages interval og samlet overlevelse af mus var registreres. B, gennemsnitlige overlevelsestid for mus med tumorvækst blev beregnet. C, den peritoneale tumormasser blev vejet når mus blev aflivet med hver prik repræsenterer hver mus. D, Langsigtet overlevende (90 dage efter første tumor udfordring) mus (4 mus pr gruppe) fra 2 mAb behandlingsgruppe de igen fik ID8 celler givet i.p. eller subkutant eller med syngene ubeslægtede TC1 celler transplanteret subkutant og derefter samlet overlevelse af mus blev registreret. E, Mus (5 mus pr gruppe) behandlet med kombineret anti-PD-1 /OX40 mAb blev også injiceret med et anti-CD4, anti-CD8, anti-NK1.1, eller kontrol-mAb med 500 ug af hvert mAb pr mus 1 dag før og to dage efter tumorprovokation efterfulgt af injektion af 200 ug hver 5 dage derefter for varigheden af ​​eksperimenterne. Tumorbærende ubehandlede mus var som negative kontroller (UNT). Samlet overlevelse af mus blev registreret. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg undtagen D og E, som var fra et eksperiment. *** P 0,001 kombineret mAb over for kontrol eller enkelt mAb-behandlede mus i A-C; *** P 0,001, s.c. eller i.p.ID8 vs s.c.TC1 i C; * P 0,05, kontrol eller NK1.1 vs UNT, CD4 eller CD8 i D.

Mus afvise ID8 celler efter kombineret behandling var resistente over for en efterfølgende fornyet behandling i.p. eller subkutant med den samme cellelinie, men ikke s.c. med uafhængige TC1 lunge kræftceller (Figur 1D). Disse resultater viser, at kombineret behandling fremkalder et specifikt og langvarig antitumor immunrespons hos behandlede mus. Lymfocytdelmængde depletion eksperimenter viste, at tumor beskyttelse af anti-PD-1 /OX40 mAb’er var afhængig af CD4

+ og CD8

+ T-celler som fjernelse af CD4

+ eller CD8

+ T-celler men ikke NK-celler fuldstændigt modvirkede antitumorvirkning følger af anti-PD-1 /OX40 mAb-behandling (figur 1E).

Kombineret anti-PD-1 /OX40 mAb behandling signifikant forøger forholdene mellem både CD4 og CD8 T celler til treg og MDSC

for at udforske mekanismerne bag synergien mellem PD-1 blokade og OX40 aktivering, vi analyserede virkningerne af enkelt eller kombineret mAb på tumor-infiltrerende peritoneale immunceller (PIC) høstet fra behandlede mus 3 eller 7 dage efter sidste mAb injektion. Sammenlignet med kontrol eller enkelt mAb kombineret MAB signifikant øget de procentdele af effektor CD4

+ foxp3

– (middelværdi for kontrol, anti-PD-1, anti-OX40 og anti-PD-1 /OX40 gruppe: 8,24%, 8,20%, 8,70%, 18,78% på dag 3 og 7,66%, 8,02%, 12,22%, 22.80% på dag 7; p 0,05) og CD8 + (middelværdi 6,62%, 6,74%, 7,20%, 23,24% på dag 3 og 5,88, 7,22, 12,90, 29,26 på dag 7; p 0,01) T-celler og faldt hyppigheden af ​​CD11b

+ GR-1

+ myeloide afledte suppressorceller (MDSC; middelværdi 12,58% , 10,86%, 13,62%, 6,53% på dag 3 og 14,58%, 10,28%, 14,20%, 3,28% på dag 7; p 0,05 og 0,01 for dag 3 og 7) i PIC på dag 3 efter behandling og ændringer blev mere fremtrædende på dag 7 efter behandling (figur 2A-D); blev dog ingen ændring i procentdelen af ​​CD4

+ foxp3

+ regulatoriske T-celler (Treg) observeret i kombinerede mAb behandlede mus på to tidspunkter evalueret. Disse modsatrettede ændringer i effektor og immunosuppressive celler gav anledning til de væsentligt forhøjede forhold mellem både effektor CD4

+ og CD8

+ T-celler til Treg og MDSC i bughulen af ​​mus, der fik kombineret mAb behandling (Figur 2E-H) . Med hensyn til individuel mAb behandling, OX40 engagement signifikant forhøjede procentdelen af ​​CD4

+ foxp3

+ treg (1,01%, 0,93%, 1,33%, 1,03% på dag 3 og 1,07%, 0,84%, 1,84%, 0,97% på dag 7; p 0,05 på dag 7) med beskeden stigning i andelen af ​​effektor CD4

+ foxp3

– og CD8 + T celler på dag 7 efter behandling; dog single PD-1 blokade mildt svækket niveauerne af immunosuppressive Treg og MDSC i peritoneale hulrum. Vi bemærkede en stigning i absolutte samlede antal immunceller fra 2 mAb behandlede mus på to tidspunkter analyserede (middelværdi (× 10

6 /mus): 3.5, 3.7, 3.8, 5.6 på dag 3 og 3,7, 3,8, 4.0, 6.2 på dag 7; p. 0,05) og ændringerne i absolutte antal af hver delmængde havde en lignende tendens til deres procenter (data ikke vist)

mus (5 mus pr gruppe) injiceret ip med 1 × 10

6 ID8 celler 10 dag tidligere blev injiceret tre gange på 4 dages interval med 200 pg af kontrol, single eller kombineret anti-PD-1 /OX40 mAb. Tre eller syv dage senere blev peritoneale udskylninger fra behandlede mus analyseret ved flowcytometri for sammensætningen af ​​forskellige immun delmængder. De procentdele af CD4

+ Foxp3

– T-celler, CD8

+ T-celler, CD4

+ foxp3

+ Treg og CD11b

+ GR-1

+ MDSC i CD45

+ peritoneale immunceller er vist i A, B, C og D med hver prik repræsenterer data fra hver mus. Forholdene mellem både CD4

+ og CD8

+ T-celler til Treg og MDSC er vist i E, F, G og H henholdsvis med hver prik repræsenterer data fra hver mus. Data er repræsentative for 2 uafhængige eksperimenter, * P 0,05, ** P 0,01

Yderligere fænotype analyse viste, at signifikant øget procentdel af CD44

+ CD62L

– effektor /hukommelse. (middelværdi for kontrol, anti-PD-1, anti-OX40 og anti-PD-1 /OX40-gruppe: 9,4%, 10,3%, 14,0%, 33,4% og 18,6%, 21,6%, 26,2%, 53,0% for CD4 og CD8 celler; p 0,01 for begge celler) og CD44

+ CD62L

+ central hukommelse (35.%, 40,9%, 42,8%, 54,2%, og 37,7%, 36,7%, 34,6%, 36,9 % for CD4 og CD8 celler; p 0,05 for CD4-celler) celler blev set i peritoneale CD4 + og CD8 + T-celler fra anti-PD-1 /OX40 mAb-behandlede mus sammenlignet med det fra kontrol- eller enkelt mAb-behandlede mus (figur 3A, B ), hvis PIC indeholdt højere niveauer af naive CD4

+ og CD8

+ T-celler (48,2%, 44,1%, 37,2%, 9,73% og 32,7%, 33,6%, 27,1%, 6,3% for CD4 og CD8 celler; p 0,01 for begge celler) med CD44

-CD62L

+ fænotype (figur 3C). De repræsentative dotplots blev vist i figur 3D.

Mus (5 mus pr gruppe) injiceret i.p. med 1 × 10

6 ID8 celler 10 dag tidligere blev injiceret tre gange på 4 dages interval med 200 pg af kontrol, single eller kombineret anti-PD-1 /OX40 mAb. Syv dage senere, ekspressionen af ​​CD44 og CD62L på peritoneale CD4

+ og CD8

+ T-celler fra behandlede mus blev analyseret ved flowcytometri. Hyppigheden af ​​CD44

+ CD62L

– effektor /memory, CD44

+ CD62L

+ central hukommelse og CD44

-CD62L

+ naive celler i peritoneal CD4

+ og CD8

+ T-celler er vist i A, B og C henholdsvis. De repræsentative dotplots vises i D med øvre, midterste og nederste paneler viser isotype, CD44 og CD62L farvning i gated CD4

+ og CD8

+ T-celler hhv. Data er repræsentative for 2 uafhængige eksperimenter, * P 0,05, ** P. 0,01

Sammenfattende indikerer disse resultater, at samtidig PD-1 blokade og OX40 udløsning skaber højere andele af effektor T-celler til immunosuppressive celler i peritonealhulen af ​​behandlede mus, som repræsenterer forskydningen af ​​den normalt suppressive tumor miljø til en mere stimulerende tilstand, som er mere tolerant for immunmedieret tumordestruktion.

Kombineret anti-PD-1 /OX40 mAb behandling fremmet en lokal immunstimulerende mikromiljø

for yderligere at underbygge flytning af tumor mikromiljø, vi næste undersøgt ekspressionen af ​​immun-associerede gener i frisk isoleret PIC om dage 3 til 7 efter mAb behandling. Brug af kvantitativ RT-PCR, faktorer i forbindelse med immunaktivering (T-bet og IFN-γ) og sådanne associeret med immunsuppressiv /regulatorisk aktivitet (foxp3 og IL-10) blev vurderet for deres relative ekspressionsniveauer. På dag 3 efter behandling, på et tidspunkt hvor øgede frekvenser af T effektorceller blev observeret, transkriptniveauer for T-bet og IFN-γ gener blev dramatisk forøget i den kombinerede gruppe behandling (figur 4A, B). I modsætning hertil genekspression af immunosuppressiv cytokin IL-10 var markant reduceret, mens foxp3 genet forblev uændret (figur 4C, D), hvilket var i overensstemmelse med ændringen af ​​Treg og MDSC i PIC. Ændringen i ekspressionen af ​​T-bet, IFN-γ og IL-10-gener var mere udtalt på dag 7 efter behandling. Baseret på forholdene mellem de stimulerende-til-regulerende gentranskripter (forhold mellem både T-bet /foxp3 og IFN-γ /IL-10), konkluderede vi, at kombineret behandling fremmes en lokal immuno-aktiverende tumormikromiljøet (figur 4E, F ). Single OX40 aktiveringen moderat forøgede ekspression af alle fire gener imidlertid ingen forhøjelse af både T-bet /foxp3 og IFN-y /IL-10-forhold blev observeret.

Mus (5 mus pr gruppe) injiceret i.p. med 1 × 10

6 ID8 celler 10 dag tidligere blev injiceret tre gange på 4 dages interval med 200 pg af kontrol, single eller kombineret anti-PD-1 /OX40 mAb. Tre eller syv dage senere blev ekspressionen af ​​Th1-associeret T-bet og IFN-γ gener og immunregulatoriske foxp3 og IL-10-gener i PIC fra behandlede mus analyseret ved kvantitativ RT-PCR. Ekspressionen af ​​T-bet, IFN-γ, foxp3 og IL-10-gener er vist i A, B, C og D henholdsvis. Forholdene mellem både T-bet /foxp3 og IFN-γ /IL-10 er vist i E og F henholdsvis. Frisk isolerede PIC fra behandlede mus blev stimuleret med 50 ng /ml PMA og 1 ug /ml ionomycin i 6 timer (som beskrevet i materialer og metoder) og supernatanter blev undersøgt for niveauer af IL-10 (G) og IFN-γ (H ). Data blev udtrykt som M ± SEM af 5 mus og repræsentant for 2 uafhængige eksperimenter, * P 0,05, ** P 0,01, *** P. 0,001

For at sikre, at ændringer i IFN -γ og IL-10 RNA-ekspression korrelerede med ændringer på proteinniveauet, blev PIC isoleret på dag 3 til 7 efter behandling og stimuleret in vitro før analyse af IFN-γ og IL-10 udskillelsesniveauer ved ELISA. Især PIC isoleret 3 og 7 dage efter indledning af kombineret mAb terapi produceret signifikant højere niveauer af IFN-γ-protein og lavere niveauer af IL-10 cytokin sammenlignet høstet fra kontrol eller enkelt mAb-behandlede mus ved disse samme tidspunkter (figur 4G , H).

Kombineret anti-PD-1 /OX40 mAb behandling fremkaldte et antigen-specifikt CTL-respons

Som ID8 celler udtrykker mesothelin, en velkarakteriseret tumorantigen [38], vi høstede splenocytter fra behandlede mus, og det samme antal splenocytter blev dyrket i nærvær af 10 ug /ml H-2Db-begrænset mesothelin-specifikt peptid (aminosyre 406-414) eller kontrol HPV-E7-peptid (aminosyrerne 49 -57) i 3 dage og analyseret IFN-γ-produktion i kultursupernatanter ved ELISA. Sammenlignet med det fra kontrol eller enkelt mAb-behandlede mus, splenocytter fra kombinerede mAb-behandlede mus producerede signifikant højere niveauer af IFN-γ, når de stimuleres med mesothelin peptid (P 0,01, figur 5A). Ingen øget IFN-γ-sekretion blev observeret i splenocytter fra alle grupper af mus, når de blev stimuleret med kontrol HPV-peptid, hvilket viser induktionen af ​​mesothelin-specifikt immunrespons i mus, der modtog kombineret mAb behandling. Vi yderligere evalueret cytolytiske aktivitet af splenocytter fra kontrol eller kombinerede mAb behandlede mus. Splenocytter blev restimuleret med UV-bestrålede ID8 celler i 4 dage før CTL-analyser blev udført ved anvendelse EL4-celler pulseret med mesothelin eller HPV-E7 afledt peptid som målceller. Som vist i figur 5B og 5C, splenocytter fra anti-PD-1 /OX40 behandlede mus udviste signifikant højere niveauer af cytotoksisk aktivitet mod EL4 celle pulseret med mesothelin men ikke med HPV-E7-peptid.