PLoS ONE: bioenergetic og antiapoptotisk Egenskaber mitokondrier fra dyrkede humane prostatakræft-cellelinier PC-3, DU145 og LNCaP

Abstrakt

Formålet med dette arbejde var at afsløre de metaboliske funktioner i mitokondrier, der kan være afgørende for inhibering af apoptotisk potentiale i prostatacancerceller. Vi studerede mitokondrier isoleret fra normale prostata-epitelceller (Prec), metastatisk prostatacancer-cellelinier LNCaP, PC-3, DU145; og ikke-prostatacancerceller – humane fibrosarkom HT1080 celler; og normale humane lymfoblastoide celler. Prec celler indeholdt 2 til 4 gange mindre mitokondrier per gram celler end de tre PC cellelinier. Respiratoriske aktiviteter Prec celle mitokondrier var 5-20 gange lavere end PC mitokondrier, afhængigt af substrater og den metaboliske tilstand som følge af lavere indhold og lavere aktivitet af de respiratoriske enzymkomplekser. Mitokondrier fra de tre metastatisk prostatacancer-cellelinier afslørede adskillige funktioner, der er karakteristiske kun til disse celler: lav affinitet Complex I for NADH, 20-30 mV højere elektrisk membranpotentiale (ΔΨ). Ubeskyttet med cyclosporin A (CSA) PC-3 mitokondrier kræves 4 gange mere Ca

2+ at åbne permeabilitetsovergang pore (MPTP) sammenlignet med PREC mitokondrier, og de ikke undergår hævelse selv ved tilstedeværelse af alamethicin , et stort poredannende antibiotikum. I nærvær af CsA, har PC-3 mitokondrier ikke åbne spontant MPTP. Vi konkluderer, at den lave apoptotiske potentiale metastatiske PC celler kan stamme fra inhibering af Ca

2 + -afhængig permeabilitetsovergang grund af en meget høj ΔΨ og højere kapacitet til at udskille Ca

2+. Vi foreslår, at på grund af den høje ΔΨ, er mitokondrie stofskiftet i metastatisk prostatacancer celler overvejende baseret på udnyttelse af glutamat og glutamin, som kan fremme udviklingen af ​​kakeksi

Henvisning:. Panov A, Orynbayeva Z (2013) bioenergetic og antiapoptotisk Egenskaber mitokondrier fra dyrkede humane prostatakræft-cellelinier PC-3, DU145 og LNCaP. PLoS ONE 8 (8): e72078. doi: 10,1371 /journal.pone.0072078

Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA

Modtaget: Februar 14, 2013; Accepteret: 5 jul 2013; Udgivet: 8. august, 2013 |

Copyright: © 2013 Panov et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Grant National Institutes of Health CA69764 (til JA Petros), Emory University Trust for Urologic Research. Cornelius F. J. Beukenkamp Endowment for Prostata Cancer Research. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den vigtigste årsag til mandlig kræft dødsfald i aldersgruppen 55-74, og over 75 år er det den næststørste dødsårsag i Nordamerikanske mænd efter lunge- og bronkier kræft [1,2 ]. Væsentlige alle mænd med fremskreden sygdom, der gik gennem androgendeprivation terapier, til sidst dø på grund af udviklingen af ​​androgen-uafhængig metastatisk prostatacancer [1,3,4]. Det høje dødelighed af prostatakræft er forbundet med aktiv spredning af prostata adenocarcinom, som formidler til fjerne organer med præferencer til knoglevævet [5]. Der er en stor mængde data, som indikerer, at progression af både primære og metastatiske prostatatumorer bestemmes ved tabet af cellens apoptotiske potentiale [6-8].

deltagelse mitokondrier i apoptose er blevet underbygget af et stort antal rapporter, der beskriver proapoptotiske mitokondrielle forandringer, såsom produktion af reaktive oxygenarter (ROS), udtømning af ATP, og induktion af mitokondriel permeabilitetsovergang pore (MPTP) [9-11]. Det er blevet vist, at Bcl-2 og andre apoptose-regulerende proteiner af denne familie er placeret ved de mitochondrielle junction steder af den indre og ydre membraner eller intermembrane rum og regulerer apoptose via deres virkninger på mitokondriel permeabilitetsovergang [12-15]. Undersøgelser af forholdet mellem induktion af apoptose i prostatacancerceller og ekspression af Bcl-2 og Bax-relaterede proteiner gav modstridende resultater [16-21], og dataene tyder på, at bcl-2, Bcl-xL og nogle andre apoptose-relaterede proteiner er ikke vigtige for induktion af apoptose i prostatacancerceller [18,19,22-24]. På den anden side, åbning af permeabilitet overgang pore afhænger direkte af mitokondrielle egenskaber såsom elektrisk membranpotentiale (ΔΨ), produktion af ROS [25], og respiratorisk aktivitet [26-28]. Derfor er det vigtigt at forstå biokemiske og fysiologiske aspekter af mitokondriel funktionalitet som en central gate-keeper i manglende evne prostatacancerceller at forpligte sig til programmeret celledød.

Mens der er mange rapporter om apoptose induktion i prostata celler via modulerende mitokondrie stofskifte [29-31], generelt ikke meget om de bioenergetik og mitokondrie funktioner normale eller kræft prostata celler, bortset fra forskellene i deres stofskifte af citronsyre [32] og mitokondrie L-lactat [33]. Det er blevet vist, at i modsætning fleste maligne væv, er prostatatumorceller karakteriseret ved en lav grad af glykolyse og glucoseoptagelse [34,35], og ved præferentiel optagelse af fedtsyrer løbet glucose [36]. Den høje biokemiske plasticitet prostatacancerceller hjælper dem med at tilpasse deres stofskifte til typiske tumor hypoxisk tilstand [37]. I mange af disse undersøgelser af mitokondrisk metabolisme i prostatacancerceller, forfatterne anvendte antibiotika [29,31,36-38]. Det er kendt, at aminoglycosidantibiotika (streptomycin, gentamicin) er mitotoxic [39-41]. Vi har konstateret, at mitokondrier isoleret fra prostatacancerceller, humane lymfoblastoide celler og hepatocytter dyrket i nærvær af streptomycin ikke respirerer om eventuelle substrater. Således celler i kulturerne indeholdende antibiotika ikke opretholde aerobe stofskifte, og glykolyse er den eneste kilde til ATP. Derfor mange konklusioner opnået på cellekulturer med antibiotika har skal betragtes med forsigtighed.

Tidlige undersøgelser af ultramicroscopic struktur normale og ondartede prostata celler har vist, at prostatacancerceller viser en slående stigning i antallet og pleomorphism af mitokondrier [42]. Dette adskiller prostatacancer fra andre cancertyper hvor malign transformation er normalt ledsaget af et signifikant fald i cellens mitochondrier [43].

I den normale prostata, epitelceller secernerer et højt niveau af citrat sandsynligvis på grund af deres relative manglende evne til at oxidere citrat via Krebs cyklus [32,44]. Prostata citrate niveauerne stiger yderligere i godartet hyperplasi af prostata, men falde brat under udviklingen af ​​prostatacancer, formentlig fordi kræft mitokondrier erhverve evnen til at oxidere citrat [32]. Denne metaboliske egenskab af prostatakræft mitokondrier er det modsatte af, der blev observeret for mange hurtigt voksende kræft, hvor Krebs cyklus skifter fra citratudnyttelse til citrat produktion, hvilket resulterer i øget kolesterol produktion [45].

bidrag energiomsætning i kræft udvikling og progression er blevet rapporteret i en række værker [44,46,47]. Det menes, at for at gøre anticancerterapi kræftspecifikke, de bioenergetic metaboliske funktioner i hver tumortype skal først blive belyst. Ændringerne i bioenergetic funktioner af human prostatacancer LNCaP, DU145 og PC-3-celler er blevet vist at være relateret til mitokondrielle dysfunktioner [38], mens de detaljerede mekanismer i mitokondrie patologi fortsat usikre. Formålet med denne undersøgelse var at belyse de metaboliske funktioner i mitokondrier, der kan bidrage til inhibering af apoptose i prostatacancerceller. På grund af kendte ekstraordinær heterogenitet af prostatakræft vi undersøgte mitokondrie bioenergetic egenskaber af tre prostata cancer cellelinjer, nemlig PC-3, LNCaP- og DU145, forskellige i deres oprindelse, tumorgenicitet, reaktion på androgener, og spredning satser [38,43,48 , 49]. Til sammenligning undersøgte vi mitokondrier fra de dyrkede normale humane prostata-epitelceller (Prec). Alle disse cellelinier er næsten unstudied i form af mitokondrie funktioner. Af hensyn til sammenligning, vi studerede også en ikke-prostata human fibrosarkom cellelinie HT 1080. EBV-transformerede normale humane lymfoblastoide celler (HLB) fungerede som en henvisning til, hvordan mitokondrier fra dyrkede normale celler reagerer på Ca

2 + belastninger og cyclosporin A.

Dette er den første undersøgelse af de bioenergetic egenskaber og Ca

2 + -afhængig permeabilitetsovergang af isolerede mitokondrier fra de etablerede prostatacancer-cellelinier og normale humane Prec celler. Vi rapporterer her, at mitokondrier fra de tre metastatisk prostatacancer-cellelinier har en række forskellige metaboliske funktioner: en 20 til 30 mV højere elektrisk membranpotentiale (ΔΨ), lav affinitet af komplekset I til NADH, højere resistens over for Ca

2 + belastninger og en usædvanlig reaktion på cyclosporin A og det poredannende antibiotikum Alamethicin, sammenlignet med PREC og normale HLB mitokondrier. De observerede træk af prostatakræft mitokondrier kan beskytte prostata cancer celler fra apoptose ved direkte og indirekte hæmning af mitokondrie permeabilitet overgang.

Resultater

Mitochondriale udbytter

Figur 1 viser udbytter af mitokondrier isoleret fra cellerne under undersøgelsen. I sammenligning med PC-3, DU145 og LNCaP-prostatacancerceller, normal prostata Prec celler gav sig tilsvarende 2.1, 2.3 og 4.6 gange mindre mitokondrier per gram celler. De højeste udbytter blandt prostatacancerceller blev opnået med LNCaP-celler, og også med fibrosarcomceller (HT1080C) og normale humane lymfoblastoide celler (HLB). Udbytterne var helt entydig for en given cellelinie, men varierede mellem cellelinierne [50].

Mitokondrier blev fremstillet som beskrevet i Methods. Resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± SE, n = 5-7 (separate isoleringer fra celler). Værdierne er udtrykt som mg mitokondrieprotein pr 1 gram våde celler. Statistik: **

s

0,05; ***

s

0,001. Værdier for prostatacancerceller PC-3 blev DU145 og LNCaP sammenlignet med normale prostata celler Prec.

respiratoriske aktiviteter mitokondrier isoleret fra dyrkede celler

Figur 2 viser respiratoriske aktiviteter mitokondrierne i forskellige metaboliske tilstande. På grund af de begrænsede udbytter af mitokondrier fra de dyrkede celler, især fra de normale Prec celler, vi begrænset udvalg af substrater, succinat, glutamat + malat, og citrat + malat. Citrat blev valgt på grund af de slående forskelle i citrat metabolisme i normale og maligne prostata væv (32,44). Succinat oxidation er et alternativ til NAD-afhængige substrater kilde til elektroner. Oxidation af glutamat + malat giver elektroner til Complex I, men også kan afspejle funktion Krebs cyklus i split-mode. Hertil kommer, i de indledende eksperimenter, vi har fundet, at prostatakræft mitokondrier oxideret glutamat + malat til betydeligt højere priser end pyruvat + malat.

Inkubationsbetingelser er beskrevet i Methods. Substrater: succinat 10 mM; glutamat 10 mM + malat 2 mM; citrat 10 mM + malat 2 mm. Oxidativ phosphorylering (State 3) respiration blev stimuleret ved tilsætning af 150 uM ADP; koblet respiration (State 3U) blev stimuleret ved tilsætning af 0,5 uM cyanide-

m

-chlorophenylhydrazone (CCCP). Respiratoriske kontroller blev beregnet som forholdet mellem statens 3 respirationsraten til respirationsraten i State 4

0 (før tilsætning af ADP).

Med succinat og glutamat + malat, de respiratoriske aktiviteter af mitokondrier fra tre PC celletyper under studiet var manifold højere i alle metaboliske tilstande, sammenlignet med mitokondrier fra normale Prec celler (Figur 2).

til en vis grad, effektiviteten af ​​mitokondrie oxidative fosforylering kan blive vurderet af de respiratoriske kontrol nøgletal (RCR), der beregnes som forholdet mellem den respirationsfrekvens i State 3 (oxidativ fosforylering) til respirationsfrekvens i State 4 (hvilende respiration). Men absolutte satser respiration på staten 4 og stat 3, er også meget vigtigt for at forstå de mitokondrie energetik. Generelt i mitochondrier fra normale væv isoleret i nærværelse af bovint serumalbumin, RCR-værdierne er højere med NAD-afhængige substrater end med succinat [51].

Generelt data præsenteret i figur 2 viser klart at normale Prec mitokondrier afviger væsentligt fra de prostatacancerceller mitokondrier, samt fra de normale og maligne non-prostataceller. Figur 1 og 2 viser, at kræft transformation af normale prostata vævsceller var ledsaget af flere gange stigning i indholdet af mitokondrier pr celle og mange-fold stigning i den mitokondrielle respiratorisk aktivitet. Salg

Når normal eller prostatacancer celle mitokondrier oxideret succinat, tilføjelse af ADP eller afkobler (CCCP) produceret respiratoriske satser højere end de tilsvarende priser for NAD-afhængige substrater (figur 2). Således blev de lave satser i staten 3 oxidation af glutamat og citrat i kræft mitokondrier ikke er forårsaget af lav aktivitet af ATP /ADP luftfartsselskab, ATP syntase, eller aktiviteter Komplekser III og IV, men snarere ved lav aktivitet af Complex I (NADH dehydrogenase).

Elektrisk membran potentialer mitokondrier fra prostata og ikke-prostata celler

Høje mitochondriemembran potentialer i carcinomaceller, herunder prostata kræftceller, sammenlignet med normale epitelceller, er blevet rapporteret i flere undersøgelser [52]. Men de fleste af disse data blev opnået med fluorescerende kationiske farvestoffer (Rhodamin 123, JC-1, etc.), som kun giver en kvalitativ vurdering af ΔΨ, og undertiden fejlagtige resultater. Faldgruberne i de fluorescerende metoder til evaluering af mitokondrie energiforsyning i celler er blevet diskuteret i litteraturen [53,54]. Med isolerede mitokondrier, brugte vi en TPP

+ – elektrode, der tillader kvantitativt vurdere ΔΨ værdier for membran potentialer højere end -100 mV [55]

Figur 3 rapporter de ΔΨ værdier for mitokondrierne isolerede. fra cellelinierne, der undersøges. Disse værdier blev beregnet under anvendelse korrektioner for bindingen af ​​TPP

+ til den indre membran og matrix (IBC, indre bindingskonstant) beregnet over for [56] og under antagelse matricen volumen på 1 pi pr 1 mg mitokondrieprotein. Figur 3 viser, at ΔΨ værdier for prostatacancer mitokondrier var 20 til 30 mV højere end estimeret for Prec celler og for de ikke-prostata cancer HT1080C celler, for hvilke det fluorescerende farvestof metode viste højere end normalt membranpotentiale [52] . Vigtigere, blev høj ΔΨ i prostatacancer (PC) celle mitokondrier ikke observeret i de celler, der blev høstet fra dyrkningskolberne der nåede ca. 80-90% konfluens. Mitokondrier fra næsten sammenflydende kulturer af PC celler havde ΔΨ under -150 mV. Kvalitativt blev lignende resultater opnået med den dyrkede PC-3-celler ved 60% og 90% konfluens, når cellerne blev farvet med mitokondrierne-specifikke fluorescerende farvestoffer med forskellig affinitet for strømførende mitochondrier (data er ikke vist).

Inkubationsbetingelser og beregning af ΔΨ som -mV er beskrevet i Methods. Værdierne er udtrykt som gennemsnit (-mV) ± SE. Statistik: **

s

0,05; ***

s

0,001. Værdier for prostatacancerceller PC-3 blev DU145 og LNCaP sammenlignet med normale prostata celler Prec.

kinetiske egenskaber af Complex I i submitochondrial partikler (SMP)

For at finde ud hvorfor den isolerede PC celle mitokondrier viste relativt lave aktiviteter med NAD substrat (glutamat + malat, citrat + malat) sammenlignet med succinat, studerede vi de kinetiske egenskaber af Complex I. assayet af kompleks i involverer NADH som elektrondonoren og en passende kunstig elektronacceptor. Hidtil 6-Decyl ubiquinon (DB) er den bedste og mest almindeligt anvendte elektronacceptor [57]. NADH dehydrogenase komplekset består af 46 underenheder, der er organiseret i L-formet struktur med det hydrofobe domæne indlejret i den indre membran, og den hydrofile “arm” rager ind i matrix rum, og som har bindingssteder for NADH [58]. Den hydrofobe domæne omfatter alle 7 mitokondrie-DNA (mtDNA) indkodet underenheder, der omfatter coenzym Q bindingsdomæne af komplekset I i kræft og ikke-kræft SMP. Først, vi estimeret den optimale koncentration af DB for hver type mitokondrier. Til dette titreres vi DB i nærværelse af overskud af NADH (figur 4 A, B), og derefter titreret NADH i nærvær af den optimale koncentration af DB til bestemmelse af Michaelis konstanter (Km) for NADH (figur 5).

Inkubationsbetingelser er beskrevet i Methods. SMP (0,15 mg) blev inkuberet med forskellige koncentrationer af DB i 5 minutter ved 30

oC; blev reaktionen startet ved tilsætning af 1 mM NADH

Panel A:.. hastigheden af ​​DB reduktion af SMP fra LNCaP (■), PC-3 (●), og DU145 (▲) celler

Panel B:. hastigheden af ​​DB reduktion af SMP fra Prec (■), HLB (▲), og HFS (●) celler

Inkubationsbetingelser som i figur 2.

for LNCaP og PC-3 og til en vis grad for DU145 prostatakræft-cellelinier, aktiviteter Complex i, målt som antallet af reduktion af DB, var høje og viste en påfaldende smal DB koncentrationsområde maksimal hastighed af NADH-oxidation (figur 4A). Derimod Kompleks I-aktivitet af SMP fra Prec, HFS, og HLB-celler, var lavere og viste en temmelig bred vifte af DB-koncentrationer giver maksimal aktiviteter, selvom selve aktiviteterne afveg signifikant (figur 4A, B). SMP fra PREC og HFS celler viste meget lave Complex I specifikke aktiviteter i sammenligning med stærk markedsposition fra HLB og PC celler mitokondrier. De store forskelle i svarene på ændringer i DB koncentrationen observeret mellem PC celle mitokondrier (Figur 4A) og normale Prec celler og ikke-prostata celler (figur 4B), kan give en indikation af forskellene i lipid-protein interaktioner i de mitochondriske membraner, som kunne være ansvarlig for den usædvanlige manglende respons på PC celle mitokondrier ved tilsætning Alamethicin, et poredannende peptid (se figur 6).

Inkubationsbetingelser (Medium B) saccharose 210 mM, KCI 20 mM, glycyl-glycin 3mM, pH 7,2, KH

2PO

4 1 mM, succinat 10 mM, mitokondrier 0,5 mg, slutvolumen 1,0 ml. Mitokondrie hævelse blev registreret som optisk densitet (OD) ved 520 nm ved hjælp af Shimadzu Multispec-1501 model spektrofotometer. Tilføjelser: Ca

2 + 50 nmol /ml, Alamethicin 4 ug /ml

Figur 5 viser et repræsentativt eksperiment af målinger af kompleks I kinetiske parametre for oxidation af NADH i nærværelse af. den optimale DB-koncentration vist i figur 4. Der var signifikante forskelle mellem SMP fra PC celler og andre cellelinjer. SMP fra de tre prostatacancercellelinjer havde lignende, relativt lav affinitet for NADH (K

M

NADH = 20 + 2,5 uM). Til sammenligning tilhørsforhold til NADH var tilsvarende 5, 4, og 11 gange højere end med SMP fra Prec (K

M

NADH = 4 + 0,5 uM), HT1080C (K

M

NADH = 5 + 2 uM), og HLB (K

M

NADH = 1,8 + 0,1 uM) celler. Den lave affinitet for NADH kunne forklare til en vis grad de relativt lave staten 3 oxidation af NAD-afhængige substrater af PC celler mitokondrier (se figur 2).

Værdierne af V

MAX for NADH oxidation af Complex jeg var også markant anderledes mellem SMP fra prostatacancerceller og Prec celler. V

MAX afspejler i vidt omfang af mængden af ​​et enzym til stede i systemet under undersøgelse [59]. V

MAX værdier for Complex jeg var 0,3-0,45 mM DB reduceret /min /mg protein for prostata kræftceller, og 0,028 mM DB reduceret /min /mg protein for PREC SMP, en 10 til 16 gange forskel. Således Prec celler ikke kun havde færre mitokondrier, men mitokondrierne havde også meget lavere indhold af Complex I pr mitokondrier end mitokondrier fra metastatisk prostatacancer celler.

Ca

2 + induceret permeabilitet overgang af PC 3 og HLB mitokondrier

i lang tid, det meste af vores viden om Ca

2 + -afhængig permeabilitet overgang mitochondrier var baseret næsten udelukkende på eksperimenter med rotter lever mitokondrier (RLM) [60] . Stor amplitude osmotisk kvældning af RLM blev betragtet som en klassisk manifestation af permeabilitetsovergang pore åbning induceret af calcium i nærvær af uorganisk phosphat (CaPi) (se figur 6). Vi fandt imidlertid, at i modsætning til RLM, kan mitokondrier fra andre væv ikke undergår hævelse [28], og endda depolarisering af mitokondrier under calcium binding er ikke udtryk for permeabilitet overgang [50]. Vi viser, at mitochondrier fra HLB og PC-3-celler ikke undergå stor amplitude kvældning under Ca

2+ belastninger (figur 6). HLB mitokondrier har undergået hævelse efter tilsætning af alamethicin, en bakteriel uspecifik poredannende antibiotikum, mens alamethicin ikke var effektiv med PC-3-mitochondrier (figur 6). Således stor amplitude kvældning af mitokondrier kan ikke bruges med HLB og PC-3-mitochondrier som en indikation af åbning af permeabilitetsovergang pore. Derfor brugte vi andre metoder til at registrere permeabilitet overgang i disse mitokondrier.

Som nævnt i Methods, har vi begrænset analyse af permeabilitet overgang til mitokondrier fra HLB celler, der kan dyrkes i de roterende flasker, og Prec og PC-3-celler, der kan høstes uden behandling af celler med en protease. Grunden til dette ligger i vores observation, at behandling af et væv (skeletmuskel, hjertemuskel, lever) før homogenisering eller isoleret mitokondrier med Nagarase eller Tripsin signifikant forøgede mitokondrie calcium retention kapacitet (Panov A, upublicerede data).

Figur 7 og 8 viser ændringer i membranpotentiale og mediets pH under gradvis Ca

2+ belastning af ubeskyttede HLB og PC-3-mitochondrier oxiderende succinat (figur 7), og mitokondrier beskyttet af 0,5 pM cyclosporin A (figur 8). Som mitokondrier forbruge tilføjet Ca

2+ via elektrogen calcium uniporter, den ΔΨ faldt, og blev derefter tilbage til den oprindelige niveau. Efterhånden som flere og flere Ca

2+ blev tilføjet, at elektrogen cykling af calcium også steget, og dette var ansvarlig for gradvist fald i ΔΨ. Når mitokondrie permeabilitet overgang pore (MPTP) åbnet, ΔΨ kollapsede næsten øjeblikkeligt med HLB mitokondrier og meget langsomt med PC-3 celle mitokondrier. PH-metoden for registrering af Ca

2+ forbrug mitokondrier tillader præcis registrering tidspunktet for MPTP åbning. PH metode er den mest pålidelige for kvantitativ vurdering af mængden af ​​Ca

2+ forbruges af mitokondrier før permeabilitet overgang sker – kapacitet calcium fastholdelse (CRC) [28,50]. Når MPTP åbnet, blev alkaliseringen af ​​inkubationsmediet forbundet med dissociation af calcium triphosphat (Ca

3 (PO

4)

2) i matricen, og binding af H

+ til den frigjorte PO

4

3 anion at danne HPO

4

2 og H

2PO

4

– anioner i overensstemmelse med bufferens pH [28,61]. Således alkalisering af mediet utvetydigt markerer tidspunktet for PTP åbning. Vi iværksatte samtidige målinger af ΔΨ og pH. Imidlertid bør det holdes for øje, at depolarisering af mitokondrier ikke er altid forbundet med åbningen af ​​MPTP, mens åbning af MPTP altid resulterer i sammenbrud ΔΨ [50,60]. Dette er illustreret i figurerne 7 og 8. I eksperimentet med HLB mitochondrier (figur 7), instant depolarisering af mitokondrier og alkalisering af mediet indtraf næsten samtidigt på grund af åbningen af ​​den store porer.

(A) human lymfoblast mitokondrier. (B) Mitokondrier fra PC-3 prostatacancerceller. Tilsætninger: TPP

+ blev tilsat i 0,5 um alikvoter, slutkoncentration 1,5 uM; Ca

2 + 20 nmol /ml, HCI 125 nmol /ml forårsagede ΔpH på 0,07.

(A) Human lymfoblast mitokondrier. (B) Mitokondrier fra PC-3 prostatacancerceller. Inkubationsbetingelser som i figur 8, bortset fra at 0,5 uM CsA var til stede. Tilsætninger: TPP

+ blev tilsat i 0,5 um alikvoter, slutkoncentration 1,5 uM; Ca

2 + 20 nmol /ml, CCCP 0,5 uM, HCl 125 nmol /ml forårsagede ΔpH på 0,07.

Figur 8 viser reaktioner på Ca

2+ af HLB (figur 8A) og PC-3 (figur 8B) mitokondrier behandlet med cyclosporin A (CSA). CsA er den mest magtfulde kendte hæmmer af permeabilitet overgang. Normalt CsA forsinker kraftigt indtræden af ​​MPT men forhindrer ikke det, som illustreret i tilfældet med mitokondrier fra HLB (sammenlign figur 7A og 8A), når CsA øgede CRC1.5 fold. Men det var ikke muligt at fremkalde MPTP åbning af calcium belastning af PC-3 mitokondrier beskyttet med CsA (figur 8B). Gradvist fald af signalet af TPP

+ – elektrode mere sandsynligt afspejlede forskydningen af ​​TPP

+ fra matrixen ved at akkumulere calcium phosphatsalte, snarere end sand depolarisering [28]. PH spor, der er vist i figur 8B, demonstrerer, at i modsætning til mitochondrier fra HLB, PC-3 mitokondrier i nærværelse af CsA ekstruderede protoner ujævnt, med varierende H

+ /Ca

2+ nøgletal. I sammenligning med den ubeskyttede mitokondrier i nærværelse af CsA PC-3 mitokondrier var i stand forbrugende meget stor mængde calcium uden at åbne MPTP. Vi kunne aktivere Ca

2+ frigivelse og åbning af MPTP alene ved tilsætning af CCCP, en protonophore der stimulerer mitokondriel depolarisering. Før tilsætningen af ​​CCCP, PC-3 mitokondrier var i stand til at forbruge næsten 5 gange mere Ca

2+ i nærvær af CsA (figur 8B), end i kontrolgruppen eksperimentet (figur 7B). Således eksperimenter præsenteret i figur 7 og 8 viser, at pc-3 mitokondrier har abnorme egenskaber af Ca

2 + induceret permeabilitet overgang. Med PREC mitokondrier, CRC i nærvær af CsA steg fra 20 til kun 40 nmol Ca

2 + /mg protein (figur 9).

Inkubationsbetingelser som i fig 7-8. Grå stænger – ubeskyttede mitokondrier oxiderende succinat, mørke søjler -mitochondria beskyttet af Cyclosporin A 0,5 um + oligomycin 2 ug /ml + ADP 50 pM. Data er M ± standardfejl beregnet ud fra 3 separate isoleringer af mitokondrier. Data er udtrykt som nanomol Ca

2 + /mg mitokondrieprotein. Statistik: *

s

0,1; ***

s

0,001. Dataene for beskyttet af CsA mitokondrier blev sammenlignet med de tilsvarende ubeskyttede mitokondrier. De data for PC-3 celle mitokondrier blev sammenlignet med dem, for PREC celle mitokondrier.

Figur 9 sammenligner calcium fastholdelse kapacitet mitokondrier fra normal prostata Prec celler, normale HLB celler og prostatakræft PC-3-celler oxiderende succinat i fravær og i nærvær af cyclosporin A. Vi har vist tidligere, at CRCs af mitokondrier isoleret fra lignende cellelinier, men som stammer fra forskellige individer, varierede betydeligt [50]. Derfor kan reaktioner på Ca

2+ og CsA af mitokondrier fra forskellige cellelinjer evalueres kun kvalitativt. Figur 9 viser, at ubeskyttet Prec mitokondrier havde ubetydelig evne til at fastholde Ca

2+ (ca. 20 nmol Ca

2 + /mg protein), hvorimod PC-3 mitokondrier havde en 4 gange højere modstandsdygtighed over for calcium belastninger. I mitokondrier beskyttet med CsA, CRC for PREC mitokondrier steg 2 gange, for HLB mitokondrier CRC steget med 50%, mens CRC til PC-3 mitokondrier steget næsten 5 gange og var 9 gange højere end for PREC mitokondrier. Vigtigere er det, i modsætning til mitokondrier fra PREC og HLB celler, CSA-beskyttet PC-3 mitokondrier ikke åbne spontant gennemtrængelighed overgang pore, men kun efter tilsætning af protonophore CCCP.

Diskussion

cancerøse og ikke-cancerceller anvendt i denne undersøgelse stammer fra forskellige væv og enkeltpersoner [38,43,48,49]. Uoverensstemmelser mellem dyrkningsbetingelser kan også bidrage til de observerede forskelle i de metaboliske parametre cellerne. Tidligere har vi fundet, at mitokondrier fra samme celletype, nemlig humane lymfoblastoide celler (HLBM), opnået fra forskellige individer havde kvantitativt forskellige udbytter pr 1 gram celler, respiratoriske aktiviteter og kapacitet til at binde calciumphosphat [50]. Kvalitativt normal HLBM lignede hinanden og forskellige fra HLBM fra patienter med Huntingtons sygdom [50]. HLBM fra patienter med Huntingtons sygdom havde også kvantitative forskelle i åndedræt satser og calcium fastholdelse kapacitet, men kvalitativt de var entydigt ligner hinanden [50]. Der var ingen mulighed og mening for statistisk sammenligning af HLBM fra normale individer og patienter med Huntingtons sygdom. Derfor bør fortolkning af data, når man sammenligner celler i forskellige genetiske baggrund og dyrkningsbetingelser gøres med forsigtighed og i høj grad baseret på kvalitative egenskaber. Kvantitative sammenligninger kan kun gøres inden for den samme cellelinje.

diskussion af resultaterne præsenteret i denne artikel, med hensyn til de papirer offentliggjort på kræft energiomsætningen emne, vil være relativt begrænset. For det første hidtidige arbejde er den eneste udført på mitokondrier isoleret fra normale og prostatakræft-cellelinier; og for det andet, betragtede vi det vanskeligt at diskutere en lang række publikationer om metaboliske egenskaber og roller mitokondrier i prostata cancer celler dyrket i tilstedeværelsen af ​​antibiotika [21,23,36-38]. Aminoglykosid antibiotika (streptomycin, gentamicin) er giftige for mitokondrier på flere måder [39-41,62]. Vi gentagne gange observeret, at mitokondrier isoleret fra celler dyrket i nærvær af antibiotika (penicillin og streptomycin) ikke respirerer på alle underlag. Higgins et al. [38] dyrket PC-3, LNCaP og DU145 celler i nærvær af 1% penicillin-streptomycin og konkluderede, at mitokondrier i disse celler var dysfunktionel.