PLoS ONE: Multi-Målrettet-hæmmer Sunitinib fremkalder apoptose i Colon Cancer Cells via PUMA

Abstrakt

konstitutiv aktivering af pro-overlevelse kinaser er blevet et lovende mål for små molekyler med en stigende interesse for at udvikle multi -targeted agenter. De mekanismer, der ligger til grund for lydhørhed over for de fleste agenter rettet mod kræft specifik overlevelse veje er stadig dårligt forstået, men afgørende for deres kliniske anvendelse. I denne undersøgelse fandt vi, at sunitinib, et lille molekyle inhibitor af flere tyrosinkinaser herunder VEGFRs og PDGFRs inducerer apoptose og inhiberer cellevækst i colon cancerceller i cellekultur og xenograftmodeller via BH3-only protein PUMA. Sunitinib behandling induceret

PUMA

transskription via AKT /FoxO3a akse. PUMA, BH3 mimetika, eller 5-Flurourical sensibiliserede tyktarmskræft celler til sunitinib-induceret apoptose. Endvidere blev PUMA induceret af sunitinib behandling i xenotransplantattumorer, og mangel på

PUMA

undertrykte signifikant anti-tumor-virkninger af sunitinib. Vores undersøgelse tyder på, at PUMA-medieret apoptose er vigtig for den terapeutiske reaktion på sunitinib, og aktivering af det mitokondrielle pathway af BH3 mimetika eller PUMA manipulation kan være nyttige til forbedring af antitumoraktiviteten af ​​sunitinib. Modulation af PUMA og selektive Bcl-2 familiemedlemmer kan være potentielle biomarkører til at forudsige sunitinib svar

Henvisning:. Sun J, Sun Q, Brown MF, Dudgeon C, Chandler J, Xu X, et al. (2012) Multi-Målrettet-hæmmer Sunitinib fremkalder apoptose i Colon Cancer Cells via PUMA. PLoS ONE 7 (8): e43158. doi: 10,1371 /journal.pone.0043158

Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: 2. marts, 2012; Accepteret: 17 juli 2012; Udgivet: 17 august, 2012 |

Copyright: © Sun et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud CA129829, American Cancer Society tilskud RGS-10-124-01-CCE og FAMRI (J. Yu), og ved NIH tilskud CA106348, CA121105 og American Cancer Society tilskud RSG-07- 156-01-CNE (L. Zhang). Dette projekt brugte UPCI fælles faciliteter, der blev støttet delvist af award P30CA047904. J. Sun og Y. Shu understøttes delvist af National Natural Science Foundation of China Tilskud 30772549. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA, og forekomsten er tændt. stigningen i udviklingslandene [1]. Selv med kombinationen af ​​forbedrede kemoterapi og stråling i seneste årtier, 5 års overlevelse for CRC patienter med fremskreden sygdom er fortsat uacceptabelt lave. Aberrant aktivering af forskellige kinase pathways er almindelige i de fleste faste tumorer, hvilket kan føre til øget proliferation, overlevelse, angiogenese eller invasion [2], [3]. I de senere år har store forhåbninger blevet placeret på midler, der er udviklet til at målrette onkogene kinaser, hvis anvendelse i kombination med kemoterapi eller strålebehandling kan forbedre overlevelsen og resultatet af CRC patienter [4]. forventes målrettet tilgang til sidst levere mere sikre og mere effektive kræftmedicin [5]. En stor udfordring i den kliniske anvendelse af disse midler er forekomsten af ​​iboende og erhvervet resistens, hvis underliggende mekanismer stort set ukendt, og en genstand for intens undersøgelse [4], [5].

Sunitinib (også kendt som SU11248) blev udviklet som et multi-målrettet receptor (RTK) inhibitor, og godkendt af FDA i 2006 til behandling af renalcellecarcinom (RCC) og imatinib resistent gastrointestinal stromal tumor (GIST) [6], [7] . Igangværende kliniske forsøg bliver udført for at vurdere dens effektivitet ved andre tumorer, herunder metastatisk tyktarmskræft [7], [8] (https://clinicaltrials.gov/). Sunitinib hæmmer en række receptortyrosinkinaser (RTK), som enten muterede eller aktiverede ved cancer. Disse omfatter receptorer for blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF-R α og p) og vaskulær endotelvækstfaktor receptorer (VEGFR1, 2 og 3), samt KIT (CD117), RET, CSF-1R, og flt3 [6] [7]. Sunitinib er blevet anbefalet som en anden linje terapi i GIST’er der udviklet resistens over for imatinib på grund af sekundære mutationer i

c-KIT

. Inhibering af angiogenese, immunmodulation og induktion af apoptose er blevet foreslået at mediere de antitumorvirkninger af sunitinib [7]. Mekanismerne bag celleautonom virkning sunitinib såsom celledrab er ikke godt forstået.

Mitokondrier-medieret apoptose spiller en vigtig rolle i de antitumor aktiviteter af en lang række konventionelle kemoterapeutiske midler samt målrettede behandlinger [9], [10]. Bcl-2-familien af ​​proteiner er de centrale regulatorer af mitokondrier-medieret apoptose, som er i indgreb med den selektive aktivering eller induktion af den proximale BH3-only medlemmer i afhængighed distinkt samt overlappende signaler [11], [12]. BH3-only protein PUMA spiller en væsentlig rolle i p53-afhængige og -uafhængige apoptose i humane cancerceller og mus [13], og aktiverer mitokondrielle pathway via Bcl-2 familiemedlem Bax /Bak efter neutralisering alle medlemmer af antiapoptotisk Bcl -2 lignende molekyler [14], [15], [16], [17]. DNA beskadigelse induceret af gamma-bestråling eller almindeligt anvendte kemoterapeutiske midler, såsom 5-fluoruracil (5-FU), adriamycin og etoposid, inducerer p53-afhængig induktion af PUMA og apoptose [15], [18]. Genotoksisk stress såsom vækstfaktor afsavn, endoplasmatisk reticulum giftstoffer og en række kinase hæmmere inducerer PUMA gennem en række andre transkriptionsfaktorer, herunder p73, NF-KB og FoxO3a [13], [19], [20], [21], [22], [23].

i den aktuelle undersøgelse, viste vi, at sunitinib inducerer PUMA udtryk uafhængigt af p53 i tyktarmskræft celler. Induktionen af ​​PUMA blev medieret af transkriptionsfaktoren FoxO3a ved inhibering af AKT.

PUMA

mangel førte til resistens over for sunitinib-induceret apoptose i celler samt i xenotransplantater. Vores undersøgelse giver en molekylær mekanisme for apoptose induceret af denne ikke-selektiv kinase inhibitor i tyktarmen kræftceller, og har vigtige konsekvenser for biomarkør opdagelse og potentielle strategier for at overvinde modstanden.

Materialer og metoder

Cell Culture and Drug Treatment

tyktarmskræft cellelinjer blev opnået fra ATCC. Alle cellelinjer blev holdt ved 37 ° C i 5% CO

2 og dyrkes i Mycoy s 5A-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 10% FBS (HyClone, Logan, UT), 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA). De somatiske knockout cellelinjer HCT 116

p53

KO [24], HCT 116

PUMA

KO [15], DLD1

PUMA

KO [18], HCT 116

FoxO3a

stabil knockdown (KD) celler og lille interfererende RNA (siRNA) [19] er tidligere blevet beskrevet. Anticancer midler eller kemikalier, der anvendes i undersøgelsen omfatter sunitinibmaleat (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), 5-fluorouracil (5-FU), gossypol (Sigma, St. Louis, MO), HA14-1 (Axxora LLC, San Diego , CA), ABT-737 (Selleck Chemicals LLC, Houston, TX). Stamopløsninger af alle forbindelser blev fremstillet i DMSO og fortyndes med dyrkningsmedium til at arbejde koncentrationer før brug. Celler blev inficeret med adenovirus, der udtrykker PUMA, Ad-PUMA [15] (20 MOI) alene eller med tilsætning af sunitinib. Transfektion af ekspressionskonstruktioner af Flag-Mcl-1 [16], Bcl-2 og konstitutiv AKT (Millipore) blev udført som beskrevet [20].

Western Blotting og Subcellulær Fraktionering

Antistoffer anvendt for Western blotting inkluderet dem mod caspase-3, Myc (9B11), FoxO3a (i alt), p-FoxO3a, AKT (i alt), p-AKT (S473) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), cytochrom c, α- tubulin, Bd-xL, Mcl-1 (BD Biosciences), caspase-9 (StressGen Bioreagents, Ann Arbor, MI), cytochrom oxidase subunit IV (Cox IV, Invitrogen), Bcl-2 (Dako, Carpinteria, CA, USA) , Flag (Sigma), PUMA [15], p53, p21, Bim, Bid, Noxa, Smac og β-actin (EMD Biosciences, Gibbstown, NJ). Western blotting blev udført som tidligere beskrevet [25].

blev opdaget Frigivelsen af ​​cytochorme c og Smac i cytosolen efter subcelluar fraktionering som beskrevet [20], [26]. Kort fortalt blev celler behandlet i T75 kolber til angivne tider og underkastet differentiel centrifugering til opnåelse af cytoplasmatiske og mitokondriske fraktioner. Koncentrationer af cytosoliske fraktioner opnået blev normaliseret under anvendelse af et protein assay farvereagens (Bio-Rad, Hercules, CA). Fraktionerne blev blandet med lige store volumener af 2x Laemmli-prøvebuffer og underkastet Western blotting-analyse.

chromatin immunoprecipitation

chromatin immunoprecipitation (chip) blev udført under anvendelse kromatin immunpræcipitationsassay kit (Millipore, Billerica , MA) med FoxO3a antistof til kromatin udfældning som beskrevet [18]. Præcipitaterne blev analyseret ved PCR under anvendelse af primere 5-GCGCACAGGTGCCTCGGC-3 og 5-TGGGTGTGGCCGCCCCT-3 som beskrevet [22].

luciferaseassays Salg

Celler blev transficeret med PUMA reportere indeholdende enten WT eller mutant FoxO3a bindingssteder [19] med transfektion kontrol β-galactosidase reporter pCMVp (Promega) og behandlet med 12 pM sunitinib i 24 timer. Cellelysater blev opsamlet og luciferaseaktiviteter blev målt som tidligere beskrevet [23]. Alle reporter forsøg blev udført tre gange og gentaget tre gange.

(A) De angivne coloncancer cellelinier blev behandlet med 15 pM sunitinib i 24 timer. Niveauerne af PUMA blev analyseret ved Western blotting. (B) Den forældrenes HCT 116 (WT) eller

p53

KO celler blev behandlet som i (A) med stigende doser af sunitinib og analyseret for PUMA, p53 og p21 udtryk. (C) og (D) HCT 116-celler blev behandlet med 15 pM sunitinib i de angivne tidsrum.

PUM

En mRNA og protein niveauer blev analyseret med real-time RT-PCR og Western blotting, hhv.

GAPDH

mRNA blev anvendt som en kontrol for normalisering i RT-PCR, og β-actin blev anvendt som kontrol til lastning i Western blotting.

Real-time Reverse Transcription- PCR

Totalt RNA blev isoleret fra celler ved anvendelse af Mini-RNA Isolation II kit (Zymo Research, Irvine, CA) ifølge fabrikantens protokol. Totalt RNA (1 ug) blev anvendt til at generere cDNA ved anvendelse af SuperScript II revers transkriptase (Invitrogen). Real-time PCR blev udført for PUMA og GAPDH som beskrevet [22].

(A) HCT 116 WT og

PUMA Salg KO-celler blev behandlet med stigende doser af sunitinib i 48 timer. Apoptose blev analyseret ved nuklear fragmentering assay. Data blev opnået fra 3 uafhængige eksperimenter. **,

P

0,01, KO

vs

WT.. (B) HCT 116 celler med de indikerede genotyper var behandling med 15 pM sunitinib i 48 timer.

Upper

, spaltningsprodukterne af caspase-3 og -9 blev analyseret ved Western blotting.

Lavere

, frigivelse af cytochrom c og Smac i cytosolen blev analyseret ved Western blotting. β-actin og CoxIV er styringer til lastning og cytosol og mitokondrie fraktioneringer hhv. (C) Koloni dannelse i HCT 116 WT og

PUMA

KO celler behandlet med sunitinib. Cellerne blev behandlet med 12 pM sunitinib behandling i 48 timer, derefter udpladet ved 1:200 eller 1:400 fortynding (~600 eller 300 celler pr brønd) i plader med 12 brønde og fik lov til at danne kolonier i 14 dage.

Upper,

repræsentative billeder af kolonierne.

Lavere

, kolonierne indeholder 50 celler blev optalt og relativ overlevelse blev beregnet med ubehandlede celler sat til 100%. Data blev opnået fra 3 uafhængige eksperimenter. **,

P

0,005, KO

vs

WT.. (D) DLD1 WT og

PUMA Salg KO celler blev behandling med 30 pM sunitinib i 48 timer.

Venstre

, PUMA og spaltningsprodukterne af caspase-3 blev analyseret ved Western blotting.

Right

, apoptose blev analyseret ved nuklear fragmentering assay. **,

P

. 0,01, KO

vs

WT

apoptoseassays

vedhængende og flydende celler blev høstet, farves. med Hoechst 33258 (Invitrogen), og analyseret for apoptose ved nuklear farvning assay. Et minimum af 300 celler blev analyseret for hver behandling [25], [27]. For kolonidannelse assays, blev lige antal celler udsat for forskellige behandlinger og udpladet i 12-brønds plader ved forskellige fortyndinger. Kolonier blev visualiseret ved krystalviolet-farvning 11 til 14 dage efter udpladning som beskrevet tidligere [25], [28]. Hvert eksperiment blev udført tre gange og gentaget mindst to gange.

(A) HCT 116 og HT 29-celler blev behandlet med 15 pM sunitinib for angivne tider. Niveauerne af total FoxO3a, phosphoryleret (p) – FoxO3a, total-AKT og phosphoryleret (p) -Akt (S473) blev analyseret ved Western blotting. (B) HCT 116

p53 Salg KO-celler og HT 29-celler blev transficeret med enten tom vektor eller et konstitutivt aktivt AKT ekspressionskonstruktioner i 16 timer, derpå behandlet med 15 pM sunitinib i 24 timer. Niveauerne af p-AKT og PUMA blev analyseret ved Western blotting. (C) HCT 116

p53 Salg KO-celler blev transficeret med enten en kodet siRNA eller en

FoxO3a

specifikke siRNA i 24 timer og derefter behandlet med 15 pM sunitinib i 24 timer. Niveauerne af angivne proteiner blev analyseret ved Western blotting. (D)

FoxO3a

stabil knockdown (KD) -celler blev behandlet med 15 pM sunitinib i 24 timer. Niveauerne af angivne proteiner blev analyseret ved Western blotting. Den specifikke bånd af total-FoxO3a er angivet med en pil. p-actin blev anvendt som kontrol til lastning.

xenotransplantattumorer

Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved University of Pittsburgh. HCT 116 WT og

PUMA

KO xenografter blev etableret og måles som beskrevet [25]. Kort fortalt blev 5-6 uger gamle hun athymiske nøgne mus (Harlan, Indianapolis, IN) podet med 5 x 10

6 celler pr stedet på begge flanker. Tumorer fik lov til at etablere i 7 dage. Musene var oral sondeernæret i 10 på hinanden følgende dage med 80 mg /kg /dag sunitinib fortyndet i natriumcitrat (pH 4,7, køretøjer) eller køretøj [29]. Tumorvolumenerne blev målt i to dimensioner under anvendelse af en skydelære. Mus blev randomiseret i grupper, således at den gennemsnitlige tumorvolumen på tværs af grupperne var den samme før behandling. For alle

in vivo

eksperimenter, tumorvolumener blev målt hver anden dag i 2 dimensioner og volumener blev bestemt i mm

3 ved hjælp af formlen l × b

2 × 0,52 (hvor l er større diameter, og b er den mindre diameter af tumoren). Mus blev injiceret i.p. 2 timer før aflivning med en enkelt dosis af bromdeoxyuridin (BrdU) ved 150 mg /kg til at mærke celler i S-fase. BrdU blev opløst i PBS til en slutkoncentration på 30 mg /ml. Histologisk og immunofluorescensanalyse for apoptose og proliferation blev udført på 5 um frosne snit som beskrevet [25]. Mus blev aflivet 21 dage efter behandlingen, eller 24 timer efter den tredje behandling (dag 4). Tumorer blev dissekeret og lynfrosset til western blotting eller fikseret i 10% formalin før paraffin indlejring.

(A) kromatin immunofældning (chip) blev udført på HCT 116

p53

KO celler efter 15 uM sunitinib behandling i 8 og 12 timer. IgG blev anvendt som en kontrol for FoxO3a-specifikt antistof. (B) HCT 116-celler blev transficeret med PUMA reporter indeholdende WT eller mutante FoxO3a bindingssteder i 16 timer og derefter behandlet med 15 pM sunitinib i 24 timer. Reporter aktiviteter blev målt ved luciferase assay som beskrevet i fremgangsmåder. (C)

FoxO3a

stabil knockdown (KD) -celler blev behandlet med stigende doser af sunitinib i 48 timer. Apoptose blev analyseret ved nuklear fragmentering assay. Data blev opnået fra 3 uafhængige eksperimenter. **,

P

0,01, KD

vs

WT.. (D) Ekspression af Mcl-1 undertrykte sunitinib-induceret apoptose i HCT 116-celler. Celler blev transficeret med FLAG-mærket Mcl-1 i 16 timer, derefter behandlet med 15 pM sunitinib i 48 timer. Apoptose blev analyseret ved nuklear fragmentering assay. Data blev opnået fra 3 uafhængige eksperimenter. **,

P

0,01, KO

vs

WT..

Right

, Mcl-1-ekspression blev bekræftet ved Western blotting. β-actin blev anvendt som kontrol til lastning.

TUNEL og Immunfarvning

Histologisk analyse blev udført ved hematoxylin og eosin-farvning. Terminal deoxyribonukleotidyl transferase-medieret dUTP nick-endemærkning (TUNEL) farvning på frosne snit blev udført med rekombinant terminal transferase (Roche) og uUTP-Alexa 594 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner, og modfarvet med 4 ‘, 6-diamidino- 2-phenylindol (DAPI) med mindre modifikation lavet til paraffin prøver [25], [30], [31]. Apoptotiske celler blev talt under et fluorescensmikroskop i tilfældigt valgte felter, og apoptose indekset blev beregnet som en procentdel af TUNEL-positive celler i mindst 1.000 scoret celler. BrdU-inkorporering blev visualiseret med anti-BrdU- Alexa 594-antistof (Invitrogen) og kerner blev visualiseret med DAPI. Proliferationsindekset blev beregnet ved at tælle celler under fluorescensmikroskop på flere tilfældigt valgte felter. BrdU-indekset blev beregnet som en procentdel af BrdU-positive celler i mindst 1.000 scoret celler. Phospho-AKT, phospho-FoxO3a og aktiv caspase-3 immunohistokemi blev udført som beskrevet [19].

Apoptose blev bestemt ved nuklear fragmentering assay og aktivering af caspaser. Alle data på apoptose blev opnået fra 3 uafhængige eksperimenter, mens repræsentative western blots er vist. (A) HCT 116-celler blev behandlet med 10 pM sunitinib, 5 uM HA14-1, 5 uM gossypol, 1 uM ABT-737, 20 MOI Ad-PUMA (0,2 pl /ml) alene eller deres kombination i 48 timer. *,

P

0,05, kombination

vs

enkeltstof..

Højre

, forarbejdet caspase-3 blev detekteret ved Western blotting. (B) HCT 116

PUMA Salg KO-celler blev behandlet med 12 pM sunitinib, 5 uM HA14-1, 5 uM gossypol, 1 uM ABT-737, 20 MOI Ad-PUMA (0,2 pl /ml) alene, eller deres kombination i 48 timer. *,

P

0,05, kombination

vs

enkeltstof..

Højre

, forarbejdet caspase-3 blev detekteret ved Western blotting. (C) HCT 116 WT og

PUMA Salg KO-celler blev behandlet med 10 pM sunitinib, 30 ug /ml 5-FU, enten alene eller i kombination i 48 timer. *,

P

0,05, KO

vs

WT..

Right

forarbejdet caspase-3 blev detekteret ved Western Blotting.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prism IV software. Alle P-værdier blev beregnet ved t-test, og P 0,05 blev betragtet som signifikant. Betyder ± én standardafvigelse (SD) blev vist i figurerne i givet fald.

Resultater

PUMA er induceret af Sunitinib i Colon Cancer Cells

udtryk for PUMA er lav i mest tryksvage celler, og fremkaldes af forskellige genotoksiske og ikke- genotoksiske belastninger [23]. For at bestemme en potentiel rolle PUMA i sunitinib-induceret reaktion, vi analyserede niveauerne af PUMA, p21 og p53 før og efter behandling i fem tyktarmskræft cellelinjer. Tre af disse linjer, HCT 116, RKO og SW 48 indeholder WT

p53

mens to linjer HT 29 og SW 480 indeholder mutant

p53

. PUMA blev induceret ved sunitinib i alle fem cellelinier (fig. 1a). PUMA induktion var dosisafhængig og forekom i både HCT 116 WT og

p53

knockout (KO) celler (fig. 1B). Basale niveauer af PUMA var lavere i

p53

knockout celler sammenlignet med WT celler som tidligere rapporteret (fig. 1B) [15]. p53 og p21 blev også induceret af sunitinib behandling.

PUMA

mRNA blev hurtigt fremkaldt af sunitinib, forud protein induktion (fig. 1C og 1D). Disse data antyder, at PUMA transkriptionelt induceres af sunitinib uafhængig af p53 i kolon kræftceller.

(A)

Venstre

, vækstkurve af HCT 116 WT og

PUMA

KO tumorer behandlet med sunitinib (Suni, oral sondeernæring, 80 mg /kg /mus, dagligt i 10 dage) eller vehikel (ve, citratpuffer pH4.7) i 21 dage. Tumorvolumen blev målt hver anden dag. N = 7 per gruppe. **,

P

0,01, WT + Ve

vs

WT + Suni: *,

P

0,05, WT + Suni

vs.. PUMA

KO + Suni.

Righ

t, et repræsentativt billede af WT og

PUMA

KO tumorer behandlet som angivet på dag 21. (B) Sunitinib induceret PUMA i xenotransplantattumorer. Niveauerne af angivne proteiner i fire tilfældigt udvalgte WT KO tumorer blev detekteret ved Western blotting. (C) Niveauerne af p-AKT og p-FoxO3a i WT tumorer 24 timer efter den tredje dosis blev analyseret ved IHC. Repræsentative billeder vises. (D)

PUMA

mangel hæmmede sunitinib-induceret apoptose og vækst undertrykkelse i xenotransplantattumorer. Paraffinsnit af HCT 116 tumorer 24 timer efter den tredje injektion blev underkastet TUNEL og BrdU-farvning til at kvantificere apoptose og proliferation hhv. Indekset for TUNEL-positive eller BrdU-mærkede celler blev beregnet. **,

P

0,01, WT + Ve

vs

WT + Suni: *,

P

0,05, WT + Suni

vs.. PUMA

KO + Suni.

PUMA medierer Sunitinib-induceret apoptose

For at undersøge en mulig rolle PUMA i sunitinib-induceret apoptose, vi sammenlignet svarene fra HCT 116 celler med isogen

PUMA

knockout (KO) celler [15].

PUMA Salg KO-celler var meget modstandsdygtigt over for sunibinib-induceret apoptose (fig. 2A). Som forventet blev aktivering af caspase-3 og -9, eller cytosol frigivelse af cytochrom c eller Smac forringet i

PUMA

KO celler, men ikke i

p53

KO celler (Fig. 2B) . I langsigtede koloni dannelse analyser,

PUMA

KO celler genereret over 4 gange flere kolonier end WT celler (Fig. 2C). PUMA var også signifikant induceret af sunitinib i

p53

mutant DLD 1 celler, mens

PUMA

mangel betydeligt blokeret sunitinib-induceret apoptose og caspase aktivering i disse celler (fig. 2D). Vi undersøgte også niveauerne af adskillige BH3-only proteiner og anti-apoptotiske Bcl-2-familiemedlemmer efter sunitinib behandling. Ingen konsistent ændring blev observeret i de fleste af dem, bortset fra en hurtig Mcl-1 nedregulering og en forsinket induktion af Bim efter 24 timer, i HCT 116-celler (fig. S1A). Der blev dog lidt eller ingen Mcl-1 nedregulering eller Bim induktion observeret i DLD1 celler (Fig. S1B). Interessant niveauerne af adskillige Bcl-2-familiemedlemmer steg i

PUMA Salg KO-celler sammenlignet med WT-celler, måske afspejler deres nedbrydning med proteaser aktiveres under behandlingen og apoptose (fig. S1B). Disse resultater tyder på, at PUMA spiller en central rolle i de apoptotiske reaktioner på sunitinib i tyktarmen kræftceller.

Mekanismen af ​​PUMA Induktion af Sunitinib

PI3K /AKT-vejen er en fælles effektor nedstrøms flere kinaser målrettet efter sunitinib. Vi undersøgte derfor AKT aktivering i et tidsforløb eksperiment efter sunitinib behandling, og fandt AKT de-phosphorylering inden for minutter (fig. 3A). FoxO3a er en transskription faktor og veletableret mål for AKT, og phosphorylering med AKT fører til inaktivering og nuklear udstødelse. Sunitinib behandling førte til en hurtig de-fosforylering af FoxO3a, men havde ingen åbenlys effekt på det samlede FoxO3a niveauer (Fig. 3A). Det bemærkes, at ændringer i FoxO3a og AKT-phosphorylering, eller

PUMA

mRNA er dynamiske og forbigående; mens induktion af PUMA protein er vedholdende og ensartet på tværs af forskellige cellelinier (fig. 1 og 3A). Exogen ekspression af aktiv AKT undertrykt PUMA induktion ved sunitinib (fig. 3B). Induktion af PUMA var signifikant hæmmet af

FoxO3a

knockdown ved enten forbigående ekspression af siRNA eller stabil ekspression af shRNA i både WT og

p53

KO HCT 116 celler (fig. 3C og 3D).

p53

KO celler blev anvendt til at reducere p53-depedent PUMA induktion ved transfektion.

Vi næste afgøres, om FoxO3a direkte aktiverer

PUMA

transskription ved kromatin Immunopræcipitering (chip) assay. To FoxO3a bindingssteder er placeret i den første intron af

PUMA

[19]. Rekrutteringen af ​​FoxO3a til

PUMA

promotor indeholder disse sites steget så tidligt som 8 timer efter sunitinib behandling (fig. 4A). Brug af reporter assays, fandt vi, at mutationer i FoxO3a bindingssteder væsentligt reduceret PUMA reporter aktivitet efter sunitinib behandling (fig. 4B). Endvidere

FoxO3a

stabile knockdown-celler viste sig at være resistente over for sunitinib-induceret apoptose (fig. 4C). MCL-1-niveauer blev restaureret af

FoxO3a

siRNA i sunitinib-behandlede celler (fig. 1D og 3C, S1), tyder på nedbrydning kunne være en yderligere mekanisme for sunitinib-induceret apoptose i HCT 116 celler. Sunitinib-induceret apoptose forekom på andre CRC linjer, herunder HT29, og blev undertrykt ved overekspression af Mcl-1 eller Bcl-2 (fig. 4D og S2). Disse data indikerer, at FoxO3a regulerer PUMA induktion og mitokondrie vej i sunitinib-induceret apoptose.

BH3 mimetiske eller Forhøjede PUMA Niveauer oplysningsvirksomhed over for Colon Cancer Cells til Sunitinib

Ovenstående observationer forudser høje niveauer af PUMA , BH3-only proteiner eller små molekyler BH3 mimetika sensibilisere cancerceller for sunitinib-induceret apoptose. Adskillige BH3 mimetiske herunder HA14-1, gossypol og ABT-737, og PUMA adenovirus (Ad-PUMA [15]), var i stand til at bevidstgøre HCT 116 celler til sunitinib. Disse midler alene inducerede lille eller begrænset apoptose (fig. 5A). Interessant BH3 mimetika inducerede betydelig apoptose og caspaseaktivering i

PUMA

KO-celler, når det kombineres med sunitinib (fig. 5A og 5B). DNA-ødelæggende midler, såsom 5-FU inducerer PUMA og Noxa i p53 WT celler [14], [32], [33], [34]. 5-FU også synergieffekt med sunitinib at inducere apoptose i HCT 116-celler (fig. 5C), som er forbundet med forøget PUMA induktion (fig. S3). Denne synergi blev svækket, men ikke blokeret i

PUMA

KO-celler (fig. 5C) måske på grund af modulationer andre medlemmers Bcl-2 familie via både p53-afhængige og uafhængige mekanismer. Disse data viser, at forhøjede niveauer af PUMA eller BH3 mimetika kan forbedre apoptotiske reaktioner på sunitinib, selv i apoptose-resistente celler.

PUMA medierer Terapeutiske Svar på Sunitinib i xenograftmodeller

For at vurdere, om PUMA modulerer terapeutiske reaktioner

in vivo

, WT og

PUMA

KO HCT 116 celler blev injiceret subkutant i flankerne af BALB /c (nu /nu) nøgne mus til at etablere xenografter. Sammenlignet med køretøjet, sunitinib behandling resulterede i 62% og 38% vækstinhibering i HCT 116 WT og

PUMA Salg KO tumorer (fig. 6A). Forskelle mellem

PUMA

genotyper var statistisk signifikante i sunitinib arm (P 0,01)., Men ikke i bilen arm om effektivitet eller vækst i tumor etablering (. Figur 6A)

PUMA var signifikant induceret i WT tumorer fra sunitinib-behandlede mus (fig. 6B). Modulationer af Mcl-1, phosphoryleret FoxO3a og AKT blev også observeret (fig. 6B og 6C). Analyse tumor sektioner fra mus en dag efter den tredje sunitinib administration (dag 4), fandt vi en signifikant lavere apoptose og højere celle proliferation i

PUMA

KO tumorer i forhold til WT tumorer (fig. 6D og S4A). Aktiv caspase-3-farvning bekræftede signifikant reduceret apoptose i

PUMA

KO tumorer (-80%), sammenlignet med WT tumorer behandlet identisk (fig. S4b). Disse resultater viser, at det terapeutiske respons på sunitinib

in vivo

medieres af PUMA-afhængig apoptose.

Diskussion

Nye beviser tyder på, at induktion af apoptose er en vigtig mekanisme for en bred vifte af anticancermidler [2], [10], [35]. Evasion af celledød er kendetegnende for kræft og en vigtig bidragyder til terapeutisk modstand [2], [3]. Ud over veldokumenterede effekter af sunitinib i at hæmme tumor angiogenese [6], [7], [36], [37], vores arbejde viser, at sunitinib udviser en stærk pro-apoptotisk aktivitet i tyktarmen kræftceller via PUMA induktion gennem transskription faktor FoxO3a, men ikke p53, NF-KB p65 eller p53 homolog P73 og P63. Sunitinib-induceret apoptose er associeret med induktion af Bim eller nedregulering af Mcl-l i nogle tyktarmskræft cellelinjer vi testede. Tidligere arbejde viste inddragelse af Bim og STAT3 under sunitinib-induceret apoptose i andre typer celler [38], [39], [40]. Sammen antyder disse data, at induktion af BH3-only proteiner kan være en fælles mekanisme bag sunitinib-induceret cancercelledrab der måtte være berørt af status af forskellige kinaser, og forskellige eneste BH3-proteiner kan være vigtigt i forskellige typer celler.

en række mere selektive VEGFR inhibitorer blev også fundet at inducere PUMA og apoptose i colon cancerceller (data ikke vist), der understøtter en ikke-angiogen rolle af anti-VEGFR terapier. Det vil være vigtigt at bestemme, om sunitinib-induceret apoptose medieret af PUMA eller andre BH3-only proteiner i andre faste tumorer såsom renal cancer og GIST’er, og deres potentielle rolle i de apoptotiske responser på andre VEGFR og PDGFR-inhibitorer. Reduceret følsomhed over for sunitinib blev foreslået at være forbundet med mutationer i

KIT

eller

VEGFR /FDGFR

eller i andre RTK’er, samt nedsat ekspression af opløselige VEGF-receptorer (sVEGFs) [6], [7], som kan undertrykke celledød eller fremmer overlevelsen [2], [5]. Derudover kan inhibition af tumorangiogenese eller andre komponenter i mikromiljøet indirekte aktivere celledødsveje [2]. Anvendelsen af ​​isogene cellelinjer, som vi gjorde her kan især være nyttig til forståelse af lægemiddelvirkninger og mekanismer [41].

Trods spændingen i udviklingen af ​​midler rettet mod onkogene kinaser, kliniske data viser, at de fleste af disse midler er generelt effektive kun en mindre fraktion af patienter [4], [5]. En væsentlig ændring er at identificere biomarkører til at hjælpe patienten udvælgelse og lagdeling. Vores data viser, at PUMA fortsætter 24-48 timer efter sunitinib behandling. I modsætning hertil hæmning af AKT /FoxO3a er mere forbigående og genopretter i timer, sandsynligvis afspejler sekundære og overlevelse forsøg i tumorceller efter aktivering af apoptotisk signalering. Disse fund potentielt forklare, hvorfor opstrøms signalmolekyler er mindre egnede som biomarkører, og foreslå modulation af mitokondrie død pathway kan være et mere nyttigt udlæsning for den samlede terapeutiske aktivitet af anticancermidler.