PLoS ONE: Toll-lignende receptor 2 Signaling Beskytter Mus fra tumor udvikling i en musemodel for Colitis-induceret kræft

abstrakt

Inflammatorisk tarmsygdom (IBD) er en forstyrrelse af kronisk inflammation med øget modtagelighed for kolorektal cancer. Ætiologien for IBD er uklar, men menes at skyldes en dysreguleret adaptive og medfødte immunrespons på mikrobielle produkter i en genetisk modtagelig vært. Toll-lignende receptor (TLR) signalering induceret af tarm kommensale bakterier spiller en afgørende rolle i at opretholde tarm homeostase, medfødte immunitet og styrkelse af intestinal epitelcelle (IEC) integritet. Imidlertid rolle TLR2 i udviklingen af ​​colorectal cancer ikke er undersøgt,. Vi udnyttede den AOM-DSS modellen for colitis-associeret kolorektal cancer (CAC) i vildtype (WT) og TLR2

– /- mus. Koloner høstet fra WT og TLR2

– /- mus blev anvendt til histopatologi, immunhistokemi, immunofluorescens og cytokin-analyse. Mus mangelfuld i TLR2 udviklet sig markant flere og større kolorektale tumorer end deres WT kontroller. Vi leverer dokumentation for, at colon epitel af TLR2

– /- mus har ændret immunrespons og dysreguleret spredning under steady-state betingelser og under colitis, som fører til inflammatoriske vækst signaler og disposition til accelereret neoplastisk vækst. På de tidligste tidspunkter vurderes, TLR2

– /- koloner udviste en betydelig stigning i kryptfoci (ACF), hvilket resulterer i tumorer, som udviklede tidligere og blev større. Derudover intestinal mikromiljø afslørede signifikant højere niveauer af IL-6 og IL-17A samtidig med øget phospho-STAT3 inden ACF. Disse observationer viser, at i colitis, TLR2 spiller en beskyttende rolle mod udvikling af CAC

Henvisning:. Lowe EL, Crother TR, Rabizadeh S, Hu B, Wang H, Chen S, et al. (2010) Toll-lignende receptor 2 Signaling Beskytter Mus fra tumor udvikling i en musemodel for Colitis-induceret kræft. PLoS ONE 5 (9): e13027. doi: 10,1371 /journal.pone.0013027

Redaktør: Kathleen A. Kelly, University of California Los Angeles, USA

Modtaget: Juni 28, 2010; Accepteret: August 30, 2010; Udgivet: 27 September, 2010

Copyright: © 2010 Lowe et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (AI-058.128 supplement til MA) og Donna og Jesse Garber Endowment (til KSM og MA). Desuden K.S.M. understøttes i øjeblikket af Crohns og Colitis Foundation of America. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kronisk inflammation og cancer er indbyrdes forbundne, især i tarmen, som det ses i inflammatorisk tarmsygdom (IBD). IBD menes at skyldes en opdeling på epitelbarrieren, efterfulgt af uhensigtsmæssige responser på mikrobielle produkter, resulterende i kronisk inflammation i et genetisk modtagelig vært [1]. IBD er forbundet med en øget risiko for kolorektal cancer og det er nu almindeligt antaget, at den kroniske inflammation hos disse patienter fører til den neoplastiske transformation af tarmepitelet [2]. Korrekt tarm immunitet bygger på en balance mellem immunosuppression og hensigtsmæssigt timede proinflammatoriske reaktioner med beskyttende inflammatoriske reaktioner. Proinflammatoriske cytokiner og kemokiner, der produceres under kronisk intestinal inflammation som reaktion på kommensale bakterier skaber en mikromiljø, der forbedrer celleproliferation, celleoverlevelse, og angiogenese og dermed fremme tumorigenese [3].

intestinale epitelceller (IEC) handle som den første linje i forsvaret ved at skabe en barriere mod mikrober. De medfødte immunreceptorer tilhører familien af ​​Toll-lignende receptorer (TLR) yderligere hjælpe IEC til at skelne ven fra fjende blandt de komplicerede miljø af mikrober. Der er en voksende mængde af beviser til støtte for en væsentlig rolle for TLR signalering i vedligeholdelse af tarm homeostase [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Mus ablerede TLR2, TLR4, TLR9, eller deres fælles adaptormolekyle MyD88, var mere akut modtagelige for colitis induceret af den kemiske colitogen dextran natriumsulfat (DSS), dels på grund svækkede beskyttende responser og reduceret prostaglandin produktion [7], [ ,,,0],8], [9], [10], [11]. Antibiotisk behandling forværret DSS-induceret colitis i MyD88

– /- mus og forhindret epithelial reparation, hvilket indikerer generelt TLR signalering er påkrævet for korrekt IEC fornyelse. Faktisk behandling med TLR2 [8] og TLR9 [12] ligander under DSS administration lindret crypt skader og drønede healing. TLR2-kommensale signalering bevarer transepithelial modstand, fremmer bæger celle mucin sekretion, og fastholder homøostase inden IEC [8], [13], [14], [15]. Endelig på grund af sine tendenser til at skævt mod Th2-reaktioner [16], [17], [18], [19] og forbedre regulatoriske T-celle overlevelse [20], [21], [22], TLR2 signalering kan spille en vigtig rolle i at opretholde en undertrykkende miljø i tyktarmen.

Forskellige undersøgelser har impliceret TLR signalering i intestinal tumorigenese. I flere tarm neoplasi (Min) mus, tab af MyD88 signalering reduceret tumor tal og størrelser, der antyder, at MyD88 signalering bidrager til tumorvækst og progression [23]. I en anden model, blev tumorincidensen, mangfoldighed og størrelse reduceret efter azoxymethan (AOM) og DSS behandling, når TLR4 blev ablateret i mus via reduktion af TLR4 udtryk og signalering i IEC [24], [25]. Derudover colitis og colitis-associerede kolorektale tumorer (CAC) spontant dannet i IL10

– /- mus kan bedres hvis mus holdes i kim-fri betingelser [26] eller samtidigt ablerede af TLR4 [27]. Tilsammen disse undersøgelser understøtter, at CAC udvikling afhænger af tarm TLR anerkendelse af kommensale bakterier. Trods de indlysende roller TLR2 i IEC homeostase og forbedring af tolerance i lamina propria mikromiljø [28], [29], ingen undersøgelse har belyst den rolle, TLR2 kan spille transformation af intestinale epitelceller fører til intestinale tumorer.

Her viser vi, at TLR2-manglende mus udvikle flere og større colon tumorer end WT kontrol mus efter AOM-DSS behandling. Forbedret colon tumorudvikling fremgår tidligt ved signifikant forøgede antal af aberrerende kryptfoci (ACF) og forøget IL-6, IL-17A, TNFa og phosphoSTAT3 ekspression i intestinale mikromiljø TLR2

– /- mus sammenlignet med WT mus. Vores resultater viser, at TLR2 er en vigtig beskyttende faktor i tarm epitel homeostase og give vigtig indsigt i tidligere indregnet rolle TLR2 signalering i CAC.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne og godkendte protokoller (IACUC # 2838) af Cedars-Sinai Medical center Institutional Animal Care og brug Udvalg og blev huset under SPF betingelser.

Dyr

Helicobacter-negative vildtype C57BL /6J og TLR2

– /-. (på C57BL /6J background) mus blev opnået fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)

Induktion af tumorer (figur 1A)

Colitis-associeret kolorektal cancer (CAC) blev induceret som beskrevet tidligere [30]. Kort beskrevet blev 6-8 uger gamle mus injiceret intraperitonealt (IP) med 12,5 mg /kg azoxymethan (AOM; Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO). Efter 5 dage, mus fik 2,5% dextransulfat-natrium (DSS; MP Biomedicals, Solon, OH, molekylvægt 35.000-50.000 kDa) vand i 5 dage efterfulgt af 16 dage med regelmæssig drikkevand. Mus blev underkastet to DSS cyklusser, efterfulgt af en tredje cyklus med 2% DSS vand administreret i 4 dage fulgt af almindeligt vand i 10 dage. På dag 61 post-AOM injektion mus injiceret IP med 100 mg /kg 5-brom-2-deoxyuridin (BrdU; Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO) og aflivet 2,5 timer senere. At observere de tidligste transformative skridt i CAC blev musene aflivet 4 dage efter afslutningen af ​​den første DSS cyklus (14 dage efter AOM). Den kliniske sygdomsforløb blev overvåget ved måling af kropsvægt, observation af rektal blødning, diarré, og blodig afføring under DSS-behandling.

(A) Skematisk oversigt over CAC model. Efter initial AOM injektion (12,5 mg /kg), blev DSS givet i drikkevandet (boxed områder) efterfulgt af regelmæssige drikkevand. Mus blev aflivet på dag 14 eller 61 efter AOM injektion (dag 61: n = 19 WT, n = 21 TLR2

– /- mus). (B) Procent vægtændring under AOM-DSS behandling. (C) Mouse dødelighed under AOM-DSS behandlinger. (D) Antal kolorektale tumorer per mus induceret af AOM-DSS behandling på dag 61. (E) Antal tumorer per mus placeret i proksimale eller distale koloner i WT eller TLR2

– /- mus. (F) Størrelse distribution af kolorektale tumorer dannet i WT eller TLR2

– /- mus. (G) Tumor byrde i AOM-DSS behandlede WT eller TLR2

– /- mus. Alle tests blev udført ved anvendelse af 95% konfidensintervaller. Data er udtrykt som middelværdi ± SEM. * = P 0,05, ** = p 0,01, *** = p. 0,001

Histologisk Analyse for Colitis og dysplasi

Hele koloner blev skyllet med PBS og flash -Frozen i swiss roll orientering. 7 um snit blev opsamlet i hele dybden af ​​colon under anvendelse af en kryostat og farvet for hematoxylin og eosin (H (1) Øget lymfoide aggregater; (2) kryptitis (neutrofiler inden krypt epitel); (3) Crypt byld (neutrofiler akkumulere inden krypt lumen, undertiden med krypt brud); (4) Ulceration (tab af mucosale komponenter, og tilstedeværelse af granulationsvæv).

Omfanget af leukocyt infiltration blev scoret som

: (0) Ingen; (1) infiltration begrænset til slimhinden; (2) infiltration strækker sig til submucosa; (3) Transmural udvidelse af inflitration.

Sværhedsgraden af ​​leukocyt infiltration blev scoret baseret på antallet af infiltrerende celler som

: (1) Mild; (2) Moderat; (3) kraftig.

Procent Inddragelse af tyktarmen blev scoret som

: (0,25), hvis 1-25% af tyktarmen var involveret; (0,50), hvis 26-50% af tyktarmen var involveret; (0,75), hvis 51-75% af tyktarmen var involveret; (1,00), hvis 76-100% af tyktarmen var involveret. Separat, har vi også scorede “

omfang nekrose

” i tyktarmen som følger: (1) = 25%, (2) = 50%, (3) = 75%, (4) = 100% . Neoplasmer blev identificeret og scorede også for alvor (adenom eller carcinom

in situ

). Tumor byrde i mus blev bestemt ved summen af ​​arealerne af alle tumorer per mus

BrdU og TUNEL Farvning

Alle neoplasmer observeret af H . E blev bekræftet efter BrdU farvning hjælp BrdU

in situ

Detection Kit (BD Pharmingen, San Diego, CA) ifølge producentens foreslåede protokol. Apoptose blev påvist under anvendelse af

In Situ

Celledød Detection Fluorescein Kit (Roche, Indianapolis, IN), modfarvet med DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) og kvantificeret ved fluorescens-intensiteten per fokus felt ved hjælp ImagePro Plus (Media Cybernetics , Silver Spring, MD). Proximale og distale områder af tyktarmen blev undersøgt ved hjælp af mere end tre fokus områder per region i mindst fire slides per dyr.

Immunofluorescens

Frosne sektioner blev fikseret i 10% formalin. Slides farvet for nukleare antigener blev yderligere fikseret i 100% methanol. Anti-phospho-Stat3 og anti-ß-catenin (begge fra Cell Signaling Technology, Danvers, MA) antistoffer blev inkuberet i 48 timer ved 4 ° C efterfulgt af inkubering med gede-anti-kanin-568 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Biotinyleret anti-nitrotyrosin (Cayman, Ann Arbor, MI) blev inkuberet natten over ved 4 ° C efterfulgt af inkubering med streptavidin-594 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Alle objektglas blev modfarvet med DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA). Positive celler blev talt i mere end fem indsatsområder felter i mindst fire objektglas pr dyr og nuklear phospho-Stat3 intensitet blev målt under anvendelse ImagePro Plus.

Isolering og Behandling af lamina propria mononukleære celler (LPMC) og Mesenterisk lymfeknuder celler (MLN)

For at opnå LP celler hele koloner blev grundigt skyllet med iskoldt PBS. One-mm stykker af colon blev inkuberet i HBSS suppleret med 1 mM DTT, 3 mM EDTA, 20 mM HEPES med omrystning ved 37 ° C i 20 min. Colon stykker blev vasket med HBSS efterfulgt af inkubation i dissociation buffer (0,075 U /ml Blendzyme 3, 1,5 U /ml Dispase II, 0,5 mg /ml DNase I [alle Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland], 20 mM HEPES, 1,3 mM calcium chlorid) under omrystning ved 37 ° C i 50 min. De fordøjede koloner blev kortvarigt hvirvelbehandlet og yderligere dissocieret med stigende gauge nåle, gennem en 40 um cellefilter og vasket med PBS. Efter centrifugering Cellepelleten blev resuspenderet i en 45% Percoll-opløsning og lagt over en 72% Percoll-opløsning. Celler placeret i interfasen blev opsamlet i et rent rør og vasket flere gange. MLN blev knust mellem objektglas og vasket med PBS. Cellesuspensionen blev passeret gennem en 40 um cellefilter og vasket med RPMI. Isolerede lymfocytter blev resuspenderet i 10% FBS-high glucose RPMI suppleret med L-glutamin (Cellgro; Mediatech Inc., Herndon, VA) og 1% antibiotisk /antimykotisk (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO), og stimuleret med 1 ug /ml anti-CD3 (eBioscience, San Diego, CA) og 1 pg /ml anti-CD28 (eBioscience) i 72 timer eller med 1 ug /ml LPS (InvivoGen, San Diego, CA) i 6 timer. Supernatanter opsamlet og opbevaret ved -80 ° C.

Udarbejdelse af Colon homogenater

Kolon blev skyllet grundigt med iskold PBS. Koloner blev derefter flash-frosset i flydende nitrogen. Vaskede og steriliserede zirconiumoxidperler (0,5 mm diameter, næste fremskridt, Cambridge, MA) blev tilsat i et volumen lig med vævet. Colon væv blev derefter kortvarigt mekanisk homogeniseret under anvendelse af Bullet Blender (Næste Advance, Cambridge, MA) ved 4 ° C. En isotonisk lyseringsbuffer (1 mM EDTA, 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,9, 250 mM NaCl, 20 mM ß-glycerophosphat, 1 mM aktiveret orthovanadat, 1% NP-40, 1 mM DTT) blev derefter tilsat til vævet og perler i en mængde svarende til den i vævet. Dette blev yderligere homogeniseret, efterfulgt af rotation ved 4 ° C i 20 min. Homogeniserede væv blev centrifugeret i 20 minutter ved 4 ° C og 16.100

g

og supernatanter blev opbevaret ved -80 ° C. Salg

ELISA Salg

Supernatanter, colon homogenater eller serum var analyseret for tilstedeværelsen af ​​TNFa, IL-4, IFNg, IL-17A, IL-23p19 (alle eBioscience, San Diego, CA), IL-10, IL-6, TGFß, MIP-2 (alle R 0,05, ** = p 0,01, *** = p. 0,001

Resultater

TLR2-mangel fører til øget udvikling af colitis-associeret tyktarmskræft

Tidligere undersøgelser har vist, at TLR signaleringen og fælles adaptormolekylet MyD88 kritisk er involveret i intestinal epitelcelle homeostase og udviklingen af ​​intestinale tumorer [9], [10], [23], [24], men den rolle, TLR2 er ikke blevet grundigt undersøgt. For at undersøge, hvilken rolle TLR2 under colitis-associerede tumorigenese vi brugte en veletableret model af CAC [4], [24], [30], [31], [32]. WT og TLR2

– /- mus modtog en enkelt injektion af AOM efterfulgt af administration af tre cyklusser af DSS (figur 1A). TLR2

– /- mus var steget sygelighed som påvist ved forøget vægttab under behandlingen (figur 1 B) og mere rektal blødning under DSS behandling sammenlignet med WT-mus (data ikke vist). Vi fandt også øget dødelighed i TLR2 – /- mus sammenlignet med vildtype mus (4,6% for WT og 25% for TLR2

– /- mus, henholdsvis p 0,05), med de fleste dødsfald sker kort tid efter den første løbet af DSS (fig 1C). Dernæst undersøgte vi virkningen af ​​TLR2-mangel på colitis-associeret tumor udvikling. TLR2

– /- mus havde en højere tumorbyrde end WT mus. Histolopathological undersøgelse afslørede en signifikant stigning i antallet af tumorer i TLR2

– /- i forhold til WT mus (Figur 1D). Den gennemsnitlige tumorantal pr mus blev næsten fordoblet i TLR2-deficiente mus sammenlignet med WT-mus (6,1 vs. 3,5, p 0,05). Fordi intestinal TLR2 er stærkere udtrykt i den proximale colon [33], vi den hypotese, at mus, som mangler TLR2 ville udvikle mere CAC proximalt. Faktisk er forskellen i tumorudvikling i TLR2

– /- i sammenligning med WT-mus var mest fremtrædende i den proximale colon (figur 1E). Ud over stigningen i tumor mangfoldigheden, også TLR2-mangel førte til betydeligt højere antal større tumorer ( 1 mm

2) (p 0,05) (Figur 1F) og højere tumor byrde (næsten dobbelt) i TLR2

– /- mus sammenlignet med WT-mus (p 0,05) (figur 1G). Disse resultater indikerer, at TLR2-mangel ikke kun forbedrer tumorpromotion men øger også tumorprogression.

TLR2-deficiente koloner har mere avancerede dysplasi og ß-catenin ekspression sammenlignet med WT koloner Salg

ß-catenin signalering spiller en væsentlig rolle i den menneskelige tarm carcinogenese [34] og mutationer er blevet rapporteret i AOM-inducerede murine colon tumorer [30], [31], [35]. Faktisk stærkt positiv cytoplasmatisk eller nukleær ß-catenin farvning blev observeret i transformeret væv i WT og TLR2

– /- mus (figur 2B). WT kolorektale adenomer (figur 2A, B, venstre 2 paneler), der vises klassiske rørformede strukturer med forvrængede kirtler og moderat organisation. Men TLR2

– /- kolorektale neoplasmer (figur 2A, B, højre 2 paneler) vises mere forvrængede kirtler med regioner øget forvaltningsmæssigt og cribriform strukturer indikerer en højere lønklasse dysplasi (dvs. karcinom

in situ)

. Faktisk histologisk analyse afslørede næsten dobbelt så mange tilfælde af fremskreden carcinom

in situ

(0,3 vs 0,6 betyde carcinoma in situ per mus) i TLR2

– /- mus sammenlignet med WT, som trended dybt betydning (p 0,055) (Figur S1)

Histopatologi af koloner på dag 61 i AOM-DSS behandling.. (A) hematoxylin og eosin (H 0,001) (figur 3A). Kolon fra TLR2

– /- mus indeholdt moderat til svær betændelse, som strakte sig transmurally mens betændelse i WT koloner udvides til lignende dybder, men vises kun mild til moderat infiltration af leukocytter (figur 3D). Den øgede betændelse findes på dette tidspunkt (dag 14) i TLR2 – /- mus også korreleret med mere alvorlige vægttab og øget dødelighed i det første kursus i DSS i vores langsigtede undersøgelse (Fig 1B-C). WT mus yderligere led mere omfattende ulceration og nekrose end TLR2

– /- mus (omfanget af nekrose i colon 2.5 vs 1.3, s 0,01) (figur 3B, D). I stedet TLR2

– /- mus udviste tegn på regenerering med mucin udtømning, forstørret og hyperkromatiske kerner, og øget kerne og cytoplasma-forhold, alle tegn på kryptfoci (ACF), som vides at være præ-neoplastisk [36 ] (figur 3D, højre paneler). Endvidere observerede vi lignende proliferation men reduceret apoptose i TLR2

– /- ACF sammenlignet med WT ACF (figur 3E, F), hvilket kan bidrage til overlevelse af transformerede celler. Faktisk kvantitativ analyse af ACF afslørede en signifikant stigning i ACF i TLR2

– /- mus sammenlignet med WT mus i proximal (p 0,001). Samt distale koloner (p 0,01) (figur 3C)

Scoring af inflammation, nekrose og ACF på dag 14 i AOM-DSS-behandling (n = 5 WT og n = 5 TLR2

– /-). (A) Inflammatoriske snesevis af kolon. (B) Omfang af colon nekrose. (C) Antal ACF pr mus placeret i proksimale eller distale koloner. (D) H 0,05, ** = p 0,01, *** = p. 0,001

TLR2-mangel har øget celledeling og reduceret apoptose under tidlig CAC udvikling

tidligere undersøgelser har vist, at anerkendelsen af ​​kommensale bakterier via TLR’er er påkrævet for intestinal epithelial homeostase, som er styret af balancen mellem proliferation og apoptose i krypterne [10]. For at kunne sammenligne intestinal homeostase mellem TLR2

– /- mus og WT-mus, undersøgte vi epitelcelleproliferation af BrdU-inkorporering og apoptose ved TUNEL-farvning for DNA fragmentation i colon krypter. Interessant før AOM-DSS Vi observerede signifikant reduceret antal af BrdU

+ -celler (figur 4A) markant forøgede antal af TUNEL

+ -celler (figur 4B) pr krypt i den proksimale og distale colons fra TLR2

– /- mus sammenlignet med WT-mus. I modsætning hertil efter en runde af DSS behandling (dag 14), TLR2

– /- colon krypter de viste forøget BrdU

+ -celler (p 0,001) (figur 4A, C) og lavere TUNEL

+ -celler (p 0,001) (figur 4B, D) sammenlignet med WT-mus, hvilket indikerer dysreguleret epithelial homeostase i TLR2

– /- koloner under inflammatoriske tilstande. Selv om den BrdU

+ -celler blev primært lokaliseret til stamcelle zone WT krypter, prolifererende celler blev fundet udvidet til de midterste områder af TLR2

– /- krypter, hvori epitelceller normalt differentieret og ikke-prolifererende (figur 4C). Derfor, som slimhinde integritet blev kompromitteret i koloner mangelfulde af TLR2 blev evne til IEC til at overholde relevante overlevelse og død signaler kompromitteret, hvilket resulterer i stedet i dysreguleret celle overlevelse. For at bekræfte, at tidlig intestinal tumorigenese i TLR2

– /- mus er afhængig af DSS-induceret inflammation undersøgte vi WT og TLR2

– /- mus 14 dage efter en enkelt injektion af AOM (ingen DSS behandling) som kontroller. Vi observerede ikke nogen mærkbar ACF eller øget inflammation i WT eller TLR2-deficiente koloner i disse kontrolforsøg (Figur S2) tyder betydningen af ​​inflammation for udviklingen af ​​tumorer i forbindelse med TLR2-mangel.

Bedømmelse af proliferation af BrdU-farvning og apoptose ved TUNEL-farvning i proksimale og distale koloner fra mus enten behandlet i 14 dage med AOM-DSS regime (dag 14) eller ubehandlede mus (dag 0) (n = 5), BrdU

+ (A) og TUNEL

+ (B) celler blev talt i intakte og godt orienteret krypter. BrdU

+ celler blev kvantificeret fra mindst 20 krypter pr region fra 4 forskellige slides per dyr. (C) Dag 14 repræsentative immunhistokemiske pletter for BrdU i colon sektioner. Original forstørrelse 100x. (D) Dag 14 repræsentative immunfluorescerende pletter for TUNEL pletter i colon sektioner. Original forstørrelse 100x. Alle tests blev udført ved anvendelse af 95% konfidensintervaller. Data er udtrykt som middelværdi ± SEM. . * = P 0,05, ** = p 0,01, *** = p 0,001

TLR2

– /- mus har forøget IL-6 og STAT3-aktivering under tidlig intestinal tumorigenese

Ud over øget celleproliferation og inflammation, vi har registreret signifikant øget serumniveauer af IL-6 i TLR2

– /- mus på tidlige stadier af tumorigenese efter indledende AOM-DSS behandling (dag 14) sammenlignet til WT-mus (p 0,05) (figur 5A). Vigtigt er, IL-6 fremmer tumorprogression i inflammationsassocierede tumormodeller gennem aktivering af STAT3 [37], [38]. Vi har ikke observere nogen signifikante forskelle i serumkoncentrationen af ​​andre pro-inflammatoriske cytokiner eller kemokiner (IL-12p40, IL-1 beta, MCP-1, KC, og MIP-2) mellem WT og TLR2

– /- mus på dag 14 af AOM-DSS-behandling (data ikke vist). Vi har også påvises et forhøjet IL-6-produktion i hele colon homogenater fra TLR2

– /- mus på dag 14 i AOM-DSS behandling i forhold til WT mus (p 0,01) (Figur 5B). Lamina propria mononukleære celler (LPMC) isoleret fra TLR2

– /- mus behandlet med LPS også produceret mere IL-6 end WT LPMC (p 0,05) (figur 5C). I overensstemmelse med stigningen i IL-6-produktion i TLR2

– /- mus på tidlige stadier af tumorigenese, observerede vi signifikant øget nuklear ophobning af fosforyleret (aktiveret) STAT3 (pSTAT3) i TLR2

– /- epitel i forhold til WT koloner (figur 5E). Kvantificering af intensiteten af ​​nukleare pSTAT3 i ACF afslørede en 8 gange stigning i pSTAT3 ekspression i TLR2

– ACF sammenlignet med WT ACF på dag 14 – /(p 0,05) (figur 5F). Og mens nuklear pSTAT3 udtryk inden TLR2

– /- ACF var begrænset til intakte crypt epitelceller (figur 5E, højre panel), nuklear pSTAT3 i WT ACF dukkede meste i lamina propria eller abscessed krypter (figur 5E, venstre panel) . Kvantitativ analyse af pSTAT3 ved baseline viste ingen forskelle i TLR2

– /- vs. WT mus (figur 5F)

Paneler A-C:. IL-6 produktion i WT og TLR2

– /- mus på dag 14 i AOM-DSS-behandling blev målt ved ELISA. (A) Serum niveauer af IL-6 (n = 8 WT, n = 9 TLR2

– /-). (B) IL-6-koncentration i colon homogenater blev normaliseret til koncentrationen af ​​protein i væv (n = 3 WT, n = 5 TLR2

– /-). (C) IL-6-sekretion fra isolerede colon lamina propria celler behandlet med LPS (1 ug /ml) i 6 timer (n = 3-5). (D) Immunofluorescerende pletter af phospho-Stat3 i colon væv af WT og TLR2

– /- mus ved baseline. Original forstørrelse 100x. (E) immunfluorescensfarvning phospho-Stat3 i colon væv af WT og TLR2

– /- mus behandlet i 14 dage med AOM-DSS regime. Topplade oprindelig forstørrelse 40x, bundpanelet oprindelig forstørrelse 400X. (F) Kvantificering af phospho-Stat3 intensitet målt i ACF fra større end fem indsatsområder felter i mindst fire slides per dyr (n = 5 WT og n = 5 TLR2

– /-). Alle tests blev udført ved anvendelse af 95% konfidensintervaller. Data er udtrykt som middelværdi ± SEM. . * = P 0,05, ** = p 0,01, *** = p 0,001

TLR2

– /- mus har en forøget T

H17 immunrespons under CAC udvikling

Nylige undersøgelser har fremhævet t

H17-celler i patogenesen af ​​IBD [39] og colon tumorigenesis [40]. Vi undersøgte udtryk for T

H1, T

H2 og T

H17 cytokiner i koloner af WT og TLR2

– /- mus under tidlig udvikling af CAC. Mens vi observerede nedsat produktion af IFNg fra colon homogenater afledt fra TLR2

– /- mus sammenlignet med WT mus på dag 14 (figur 6A), observerede vi signifikant højere TNFa produktion i TLR2-deficiente koloner sammenlignet med WT koloner (p 0,05) (fig 6H), til en Th1 cytokin kendt spiller en afgørende rolle i CAC udvikling [32]. Vi har ikke observere nogen statistisk signifikante forskelle i IL-10 (figur 6B) eller IL-4 (figur 6C) niveauer i colon homogenater i disse dyr. I modsætning hertil observerede vi en mere end 2 gange stigning i IL-17A i TLR2

– /- kolon homogenater sammenlignet med WT (p 0,05) (figur 6D). Isolerede LPMCs fra TLR2

– /- mus producerede også større end 7 gange mere IL-17A sammenlignet med WT-celler, når restimuleret med anti-CD3e og anti-CD28 (p 0,001) (figur 6E). Vi har også observeret signifikant forøget produktion af TGF-b i TLR2-deficiente koloner sammenlignet med WT koloner (p 0,05) (Figur 6F). Øget produktion af TGF-b ‥ IL-6, og pStat3 i TLR2

– /- mus i forhold til WT støtter yderligere inddragelse af T

H17 celler. IL-23p19 er et cytokin, som har været impliceret i opretholdelsen af ​​T

H17-celler [41]. Vi observerede, at TLR2

– /- kolon homogenater har signifikant lavere IL-23p19 niveau ved baseline i forhold til WT koloner (p 0,001) (Figur 6G). Men efter dag 14 i AOM-DSS behandling, IL-23p19 produktionen steget betydeligt i TLR2

– /- kolon mens faldende i WT koloner (p 0,001) (figur 6G), yderligere støtte samspillet mellem TLR2 og T

H17 celler i denne model. Derudover sammenlignet med WT koloner på dag 14 i AOM-DSS behandling, TLR2

– /- kolon vises signifikant mere colon TNFa produktion (figur 6H), vides at spille en afgørende rolle i CAC udvikling [32].