PLoS ONE: Notch Aktivering af Phenethyl isothiocyanat Dæmper Dens hæmmende virkning på prostatakræft Cell Migration

Abstrakt

Phenethyl isothiocyanat (PEITC) er en lovende kræft kemoforebyggende komponent af spiselige korsblomstrede grøntsager med

in vivo

effekt mod prostatakræft i eksperimentelle gnavere. Cancer kemoforebyggende respons på PEITC er kendetegnet ved sin evne til at inhibere multiple oncogene signalveje, herunder nuklear faktor-KB, Akt, og androgenreceptor. Den foreliggende undersøgelse viser for første gang, at PEITC behandling aktiverer Notch signalering i maligne samt normale humane prostataceller. Eksponering af humane prostatacancerceller (LNCaP, PC-3, og DU145) og en normal human prostata epitelial cellelinje (Prec) til PEITC resulterede i spaltning (aktiv form), i Notch1 og Notch2, og øget transkriptionel aktivitet af Notch. I PC-3 og LNCaP-celler, PEITC behandling forårsagede induktion af Notch-ligander Jagged1 og Jagged2 (PC-3), overekspression af y-sekretase komplekse komponenter Presenilin1 og Nicastrin (PC-3), nuklear berigelse af spaltet Notch2, og /eller op -forordning af

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, og /eller

Jagged2

mRNA. PEITC-induceret apoptose i LNCaP og PC-3-celler blev signifikant svækket ved RNA-interferens af Notch2, men ikke ved farmakologisk inhibering af Notch1. Hæmning af PC-3 og LNCaP celle migration som følge af PEITC eksponering var signifikant forøget ved knockdown af Notch2 protein samt farmakologisk hæmning af Notch1 aktivering. Nuklear ekspression af spaltet Notch2 protein var signifikant højere i PC-3 xenotransplantater fra PEITC-behandlede mus og dorsolaterale prostata fra PEITC-fodrede TRAMP-mus sammenlignet med respektive kontrol. Fordi Notch signalering er impliceret i epitel-mesenkymale overgang og metastase, nærværende undersøgelse tyder på, at anti-metastatisk effekt af PEITC kan udvides med en kombinationsbehandling involverer en Notch inhibitor

Henvisning:. Kim SH, Sehrawat A, Sakao K, Hahm ER, Singh SV (2011) Notch Aktivering af phenethyl isothiocyanat Dæmper Dens hæmmende virkning på prostatakræft Cell Migration. PLoS ONE 6 (10): e26615. doi: 10,1371 /journal.pone.0026615

Redaktør: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: 15 juli, 2011; Accepteret: September 29, 2011; Udgivet: 24 oktober 2011

Copyright: © 2011 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Cancer Institute tilskud RO1 CA101753-08. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Praktiske og sikre vilkårene for chemoprevention af prostatakræft er klinisk attraktivt på grund af høj dødelighed i forbindelse med denne malignitet i amerikanske mænd [1]. Vegetabilske produkter, herunder bestanddele af frugt og grøntsager, fortsætte med at tiltrække opmærksomhed til opdagelsen af ​​nye kræft kemoforebyggende midler [2]. Phenethyl isothiocyanat (PEITC) er en sådan lovende cancer kemoforebyggende middel rigelige i spiselige korsblomstrede grøntsager såsom brøndkarse [3]. Evidens for beskyttende effekt af korsblomstrede grøntsager og deres komponenter, herunder PEITC, mod prostatakræft stammer fra populationsbaserede observationsstudier samt laboratorieundersøgelser [3] – [9]. For eksempel, et populationsbaseret case-kontrol undersøgelse foreslået en omvendt sammenhæng mellem indtag af korsblomstrede grøntsager og risikoen for prostatakræft [4].

In vivo

kemoforebyggende effekt af PEITC mod prostatakræft er nu blevet etableret i en transgen musemodel (Transgene Adenocarcinom af Mouse prostata model herefter forkortet som TRAMP) [5], [6]. Fodring af 3 pmol PEITC /g diæt faldt betydeligt forekomst samt byrde (ramte område) af dårligt differentieret kræft i dorsolaterale prostata af TRAMP mus [6]. Cancer kemoforebyggende respons på PEITC er ikke begrænset til prostata cancer som inhibering af kemisk carcinogenese eller undertrykkelse af spontan cancer udvikling af andre sites (

f.eks

, lunge, colon og spiserør) ved denne kostkomponent er dokumenteret [7] – [9]. Endvidere væksten af ​​subkutan prostatacancer-xenotransplantater i athymiske mus var signifikant forsinket ved indgivelse af PEITC eller dets

N

-acetylcysteine ​​konjugat [10] – [12]. Især oral PEITC administration augmented proapoptotiske reaktion på docetaxel

in vivo

i prostatacancer-xenotransplantater [13].

Sikkerhed, biotilgængelighed, selektivitet mod kræftceller, og evne til at målrette flere onkogene veje er ønskelige attributter af en klinisk anvendelig cancer kemoforebyggende middel. Forskning hidtil angiver, at PEITC opfylder alle disse kriterier. For det første PEITC er veltolereret af eksperimentelle gnavere [6] – [9]. For det andet, farmakokinetiske bestemmelser angiver fremragende biotilgængelighed af PEITC [14], [15]. For det tredje PEITC viser også selektivitet over cancerceller i at forårsage apoptose og autofagi [11], [16], [17]. Endelig PEITC er stand til at undertrykke multiple oncogene signalveje, der er hyperaktiv i human prostatacancer [18], herunder nuklear faktor-KB (NF-KB) [19], Akt [20], signaltransducer og aktivator for transkription 3 (STAT3 .) [21], og androgen receptor [22]

den foreliggende undersøgelse udvider disse observationer [19] – [22] og undersøger effekten af ​​PEITC behandling på aktivering af Notch1 og Notch2, der tilhører en familie af transmembrane receptorer impliceret i prostatacancer udvikling og metastase [23], under anvendelse af dyrkede humane prostatacancerceller (LNCaP, PC-3, LNCaP-c4-2, og DU145), en normal human prostata epitelial cellelinje (Prec), PC- 3 xenotransplantater fra kontrol og PEITC-behandlede mus [13], [16], og dorsolaterale prostata fra kontrol og PEITC-fodret TRAMP mus [6].

Resultater

PEITC behandling øger niveauet af kløvet Notch1 og Notch2 i prostatacancerceller

ligand-afhængig aktivering af Notch er kompleks kræver spaltning af γ-sekretasekomplekset [23], [24]. Notch receptorer aktiveres ved binding af deres tilstødende ligander (

f.eks

, Jagged1 og Jagged2), som menes at inducere en konformationel ændring i Notch-receptoren resulterer i eksponeringen af ​​en S2 spaltningssted for tumornekrosefaktor-α konverterende enzym [23], [24]. Efterfølgende Notch receptorer undergår en anden spaltning medieret af γ-sekretasekomplekset til et site lokaliseret inden for Notch transmembrane domæne [24]. Nettoresultatet af denne spaltning er frigivelsen af ​​Notch intracellulære domæne i cytoplasmaet, som derefter translokerer til kernen til at regulere målgenekspression [23], [24]. Niveau af spaltet Notch1 protein blev forøget ved behandling med PEITC i både LNCaP (fig. 1A) og PC-3-celler (fig. 1B) end med forskellige kinetik og intensitet. Tværtimod PEITC behandling forårsagede en robust og vedvarende stigning i niveauet af spaltet Notch2 protein i både LNCaP (fig. 1A) og PC-3-cellelinjer (fig. 1 B), især ved 5 uM dosis. Baseret på Notch2 data RNA-interferens vist senere, det nedre bånd i Notch2 western blot vist i fig. 1 B er ikke-specifik. Effekt af PEITC behandling på Jagged1 og Jagged2 proteinekspression var forskellig mellem LNCaP og PC-3 celler. PEITC-behandlede LNCaP-cellelinie generelt udviste et fald i niveauerne af Jagged1 og Jagged2 proteiner (Fig. 1A). I skarp kontrast til LNCaP, forbigående (Jagged1) eller vedvarende (Jagged2) induktion af Jagged proteinekspression var klart synlig i PEITC-behandlede PC-3-celler (fig. 1B). Differential svar var også mærkbar vedrørende effekt af PEITC behandling på Presenilin1 og Nicastrin proteiner mellem LNCaP og PC-3 celler, især ved 8-timers tidspunkt.

Immunoblotting for kløvet Notch1, kløvet Notch2, Jagged1, Jagged2, Presenilin1 og Nicastrin hjælp lysater fra (A) LNCaP, (B) PC-3, og (C) LNCaP-c4-2 celler efter 8-, 16-, eller 24 timers behandling med dimethylsulfoxid (DMSO) eller PEITC (2,5 eller 5 uM). Pil i panel B identificerer spaltet Notch2, det nedre bånd er uspecifik baseret på siRNA resultaterne vist i fig. 4A. Blots blev strippet og re-probet med anti-actin-antistof. Immunoblotting for hvert protein blev udført mindst to gange ved hjælp af uafhængigt forberedt lysater. Tal over båndet repræsenterer ændringer i protein-niveauer i forhold til tilsvarende DMSO-behandlet kontrol.

PC-3-cellelinjen, som er androgen-uafhængig, er relativt mere aggressiv i forhold til androgen-responsive LNCaP-celler med hensyn til spredning,

in vivo

vækst i xenograft model, og celle migration. Vi satte spørgsmålstegn hvis forskellen reaktion LNCaP

versus

PC-3 celler til PEITC-medierede ændringer i Notch signalering komponenter var relateret til androgen-uafhængig fænotype. Vi behandlet dette spørgsmål ved anvendelse af en androgen-uafhængig variant af LNCaP-celler (LNCaP-c4-2). Reaktion af LNCaP-c4-2 celler til PEITC-medierede ændringer i Notch signalproteiner var generelt svarer til den observeret i de parentale LNCaP celler (Fig. 1C). Tilsammen viser disse observationer er angivet, at mens PC-3 og LNCaP-celler differentielt reagerede på PEITC-medierede ændringer i Notch-ligander og γ-sekretasekomplekset, spaltning af Notch1 og Notch2 proteiner upon PEITC eksponering var konsistent i hver testet cellelinje. Også, overgang LNCaP celler til androgen-uafhængighed (LNCaP-c4-2) ikke har nogen meningsfuld indflydelse på PEITC-medierede ændringer i niveauet af Notch signalering komponenter.

PEITC behandling stiger transkriptionel aktivitet af Notch

Vi spørgsmålstegn ved, om PEITC-medieret spaltning af Notch1 og Notch2 oversat til øget transkriptionel aktivitet af Notch. Som vist i fig. 2A, behandling af LNCaP og PC-3-celler med 5 pM PEITC resulterede i en statistisk signifikant stigning i luciferaseaktivitet reporter aktivitet af RBP-Jk (en nedstrøms modulator af Notch signalering) sammenlignet med dimethylsulfoxid (DMSO) -behandlede kontroller. Vi anvendte en anden velkarakteriseret kastrationsresistent human prostatacancer-cellelinie (DU145) for at bestemme virkningen af ​​PEITC behandling på transkriptionel aktivitet af Notch. Som det kan ses i fig. 2A, PEITC behandling steget RBP-Jk luciferase reporter aktivitet i DU145 celler så godt. Desuden PEITC-behandlede DU145 celler udviste lignende kinetik for Notch1 og Notch2 spaltning (fig. 2B) som observeret i PC-3-cellelinjen (fig. 1B).

(A) Effekt af PEITC behandling på RBP-Jk luciferase reporter aktivitet (et mål for transkriptionsaktivitet Notch) i LNCaP, PC-3, DU145, og Prec celler efter 8- eller 16 timers behandling med dimethylsulfoxid (DMSO) eller 5 uM PEITC. De viste resultater er gennemsnit ± SD (n = 3). * Signifikant forskellig (

P

0,05) sammenlignet med DMSO-behandlet kontrol med envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts test (LNCaP og PC-3) eller t-test (DU145 og Prec). (B) Immunoblotting for kløvet Notch1 og kløvet Notch2 hjælp lysater fra DU145 og Prec celler behandlet med DMSO (kontrol) eller PEITC (2,5 eller 5 uM) for de angivne perioder. Blots blev strippet og re-probet med anti-actin-antistof. Pil i panel B (DU145 celler) identificerer spaltet Notch2, det nedre bånd er uspecifik baseret på siRNA resultaterne vist i fig. 4A. Immunoblotting for hvert protein blev udført mindst to gange ved hjælp af uafhængigt forberedt lysater. Tal over bands repræsenterer ændringer i protein-niveauer i forhold til tilsvarende DMSO-behandlet kontrol. Hvert eksperiment blev gentaget mindst to gange.

Næste anvendte vi en normal human prostata epitelial cellelinje (Prec) for at bestemme, om PEITC-medieret aktivering af Notch1 og Notch2 var unik for ondartede prostataceller. Det var en værdig forskning målsætning overvejer slående forskelle er blevet konstateret med hensyn til effekten af ​​PEITC mellem kræft og normale prostata celler. For eksempel har vi tidligere vist, at PREC cellelinien er betydeligt resistent overfor PEITC-medieret inhibering af oxidativ phosphorylering, reaktive oxygenspecies generation, og apoptose induktion sammenlignet med PC-3 og LNCaP-celler [11], [17]. Endvidere PC-3 og Prec celler reagerer differentielt til PEITC-medierede ændringer i ekspression af antioxodantforsvarssystem gener [25]. Svarende til prostatacancerceller (fig. 1), PEITC behandling resulterede i øgede niveauer af spaltet Notch1 og Notch2 i Prec celler, især ved 16-timers tidspunktet på både 2,5 og 5 uM koncentrationer (fig. 2B). I overensstemmelse med resultaterne, blev PEITC-medieret stigning i RBP-Jk luciferase reporter aktivitet også observeret i Prec celler efter 16 timers behandling med 5 uM PEITC (fig. 2A). Baseret på disse resultater, konkluderer vi, at Prec og ondartede prostataceller (PC-3, LNCaP, LNCaP-c4-2, og DU145) opfører sig på lignende med hensyn til PEITC-medieret aktivering af Notch.

Virkning af PEITC behandling på nukleare niveauer af spaltet Notch2

fordi virkningen af ​​PEITC behandling var relativt mere udtalt og vedvarende på Notch2 spaltning sammenlignet med spaltet Notch1, vi fortsatte med at bestemme spaltede Notch2 niveauer i DMSO-behandlet kontrol og PEITC-behandlede LNCaP og PC-3-celler. PEITC-behandlede LNCaP og PC-3-celler udviste en markant stigning i de nukleare niveauer af spaltet Notch2 sammenlignet med DMSO-behandlede kontrol (fig. 3A). Disse resultater viste, at PEITC behandling resulterede i nuklear berigelse af spaltet Notch2 i prostatacancerceller, hvilket stemmer overens med den observerede stigning i transkriptionsaktivitet Notch ved PEITC behandling (fig. 2A).

(A) Immunofluorescens mikroskopisk billeder, der viser nukleare niveauer af spaltet Notch2 protein i LNCaP og PC-3-celler efter 8 timers behandling med dimethylsulfoxid (DMSO) eller 5 uM PEITC ved 100 × objektiv forstørrelse. Kvantificering af

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, og

Jagged2

mRNA niveauer ved real-time RT-PCR i (B) LNCaP og ( C) PC-3-celler efter 8 timers behandling med DMSO (kontrol) eller PEITC (2,5 eller 5 uM). De viste resultater er gennemsnit ± SD (n = 3). * Signifikant forskellig (

P

0,05) sammenlignet med DMSO-behandlede kontrol envejs ANOVA med Dunnetts justering. Hvert forsøg blev gentaget mindst to gange.

Effekt af PEITC behandling på

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, og

Jagged2

mRNA niveauer

data for effekten af ​​PEITC behandling på mRNA-niveauer af

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, og

Jagged2

er vist i fig. 3B (LNCaP) og fig. 3C (PC-3). Angivelse af

Notch1 Hotel (2,5 og 5 uM PEITC) og

Jagged1 Hotel (5 uM PEITC) mRNA blev øget væsentligt på 8-timers behandling af LNCaP celler med PEITC (fig. 3B). En lignende PEITC behandling resulterede i undertrykkelse af

Notch2 Hotel (5 uM PEITC) og

Jagged2

(5 pM PEITC) mRNA-niveauer i LNCaP-celler (fig. 3B). På den anden side, PC-3-celler behandlet i 8 timer med 5 uM PEITC udstillet betydelig induktion af

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, og

Jagged2

mRNA-ekspression sammenlignet med DMSO-behandlede kontrol (fig. 3C). Betydelig induktion af

Notch1

,

Jagged1

, og

Jagged2

mRNA med 2,5 pM PEITC behandling blev også observeret i PC-3-celler (fig. 3C). Igen, disse resultater pegede i retning af cellelinje-specifikke forskelle i PEITC-medierede ændringer i ekspressionen af ​​

Notch1

,

Notch2

,

Jagged1

, og

Jagged2

mRNA.

RNA-interferens af Notch2 giver beskyttelse mod PEITC-induceret apoptose

O’Neill et al [26] tidligere har vist, at Notch2 regulerer apoptose i MDA-MB-231-celler. Fordi PEITC behandling konsekvent øgede niveauer af spaltet Notch2 protein i hver testet cellelinje, var det kun logisk at bestemme, om Notch2 bidraget til PEITC-induceret apoptose. Som vist i fig. 4A, protein niveau af spaltet Notch2 blev reduceret med ca. 40-60% ved transient transfektion af LNCaP og PC-3-celler med en Notch2 målrettet lille interfererende RNA (siRNA) i sammenligning med celler transficeret med en kontrol (ikke-specifik) siRNA. PEITC-medieret stigning i niveauet af spaltet Notch2 protein var klart synlig i kontrol siRNA-transficerede LNCaP og PC-3-celler, der var næsten fuldt afskaffet ved RNA-interferens af Notch2 (fig. 4A). Knockdown af Notch2 protein alene havde ikke nogen væsentlig indvirkning på histon-associerede DNA-fragment frigivelse i cytosolen, hvilket er et godt accepteret metode til kvantificering af apoptose, enten cellelinie (fig. 4B). På den anden side, PEITC apoptose var relativt mere udtalt i LNCaP og PC-3-celler transficeret med kontrol siRNA sammenlignet med dem transficeret med Notch2 målrettet siRNA (fig. 4B). Disse resultater viste, at Notch2 knockdown tillagt beskyttelse mod PEITC-induceret apoptose.

(A) Immunoblotting for spaltet Notch2 protein under anvendelse lysater fra LNCaP- og PC-3-celler transient transficeret med en kontrol (ikke-specifik) siRNA eller en Notch2 målrettet siRNA og behandlet i 24 timer med dimethylsulfoxid (DMSO) eller 5 uM PEITC. Tal over bands repræsenterer ændringer i protein-niveauer i forhold til kontrol siRNA-transficerede celler behandlet med DMSO. Arrow (PC-3) identificerer spaltet Notch2, det nederste bånd er uspecifik. (B) histon-associerede DNA-fragment frigivelse i cytosolen (et mål for apoptose) i LNCaP og PC-3-celler transient transficeret med en kontrol siRNA eller en Notch2 målrettet siRNA og behandlet i 24 timer med DMSO (kontrol) eller 5 uM PEITC. Resultater udtrykkes som apoptose berigelse i forhold til kontrol siRNA-transficerede celler behandlet med DMSO. (C) Immunoblotting for spaltet Notch1 og spaltes Notch2 proteiner under anvendelse lysater fra LNCaP- og PC-3-celler behandlet i 8 timer eller 24 timer med DMSO (kontrol) eller 5 uM PEITC i fravær eller nærvær af 50 uM DAPT. Tal over bands repræsenterer ændringer i protein-niveauer i forhold til tilsvarende DMSO-behandlet kontrol. (D) histon-associerede apoptotisk DNA-fragment frigivelse i cytosolen i LNCaP og PC-3-celler behandlet i 24 timer med DMSO (kontrol) eller 5 uM PEITC i fravær eller nærvær af 50 uM DAPT. Resultater udtrykkes som apoptose berigelse i forhold til DMSO-behandlet kontrol. Resultater (paneler B og D) er gennemsnit ± SD (n = 3). * Signifikant forskellig (

P

0,05) mellem de angivne grupper ved envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni multiple sammenligning test. Hvert eksperiment blev gentaget to gange, og repræsentative data fra ét sådant eksperiment er vist.

Vi designede eksperimenter under anvendelse af en farmakologisk inhibitor af γ-sekretase {N- [N- (3,5-difluorophenacetyl-L alanyl)] – S-phenylglycin-t-butylester; herefter forkortet som DAPT} for yderligere at teste rolle Notch i PEITC-induceret apoptose. PEITC-medieret stigning i niveauet af spaltet Notch1 protein, men ikke spaltes Notch2, blev markant undertrykt ved co-behandling med 50 pM DAPT (fig. 4C). Som forventet DAPT behandling alene reducerede niveauer af spaltet Notch1 og Notch2 i både LNCaP- og PC-3 celler, om end i varierende grad (fig. 4C). PEITC-induceret apoptose blev enten ikke ændret på alle (PC-3-celler) eller let forhøjet (LNCaP-celler) ved co-behandling med DAPT (Fig. 4D). Baseret på disse resultater konkluderer vi, at aktivering af Notch2, men ikke Notch1, bidrager til PEITC-induceret apoptose i det mindste i PC-3-celler.

RNA-interferens af Notch2 forøger PEITC-medieret inhibering af cellemigration

Da Notch signalering er impliceret i celle invasion og epitelial-mesenkymale overgang (EMT) [27], [28], vi designet funktionelle eksperimenter for at bestemme konsekvenserne af Notch aktivering på PEITC evne til at hæmme LNCaP og PC-3-celle migration. Forbigående transfektion med Notch2 målrettet siRNA alene resulterede i undertrykkelse af LNCaP (fig. 5A) og PC-3 (fig. 5C) cellemigrering i forhold til tilsvarende kontrol siRNA-transficerede celler som bestemt ved Boyden kammer assay. Migration af kontrol siRNA-transficerede LNCaP (fig. 5B) og PC-3-celler (fig. 5D) blev også reduceret signifikant ved behandling med 5 uM PEITC. Endvidere PEITC-medieret inhibering af LNCaP (fig. 5B) og PC-3 (fig. 5D) cellemigration blev signifikant forøget af knockdown af Notch2 proteinet.

Repræsentative billeder (Boyden kammer assay) afbilder migration af (a) LNCaP og (C) PC-3-celler transficeret med en kontrol (ikke-specifik) siRNA eller en Notch2 målrettet siRNA og behandlet i 24 timer med dimethylsulfoxid (DMSO) eller 5 uM PEITC ved 200 ganges forstørrelse. Kvantificering af migrerede (B) LNCaP-celler og (D) PC-3-celler fra forsøg er vist i panelerne A og C. Tre til fire felter på hvert filter blev scoret for migrerede celler under et omvendt mikroskop ved 200 x forstørrelse. De viste resultater er gennemsnit ± SD (n = 3). * Signifikant forskellig (

P

0,05) mellem de angivne grupper ved envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni multiple sammenligning test. Hvert forsøg blev gentaget to gange, og repræsentative data fra et sådant forsøg er vist.

Farmakologisk undertrykkelse af Notch1 aktivering øger PEITC-medieret hæmning af celle migration

DAPT alene forårsagede et beskedent fald i LNCaP (fig. 6A) og PC-3 (fig. 6C) cellemigrering i forhold til respektive DMSO-behandlet kontrol. Svarende til data ved hjælp Notch2 siRNA, co-behandling med DAPT augmented PEITC-medieret inhibering af LNCaP (fig. 6B) og PC-3 (fig. 6D) cellemigration. Disse resultater viste, at Notch1 og Notch2 aktivering ved PEITC negativt påvirker dets evne til at inhibere prostatacancer cellemigration. Salg

Repræsentative billeder (Boyden kammer assay) afbilder migration af (A) LNCaP og (C) PC-3-celler efter 24 timers behandling med dimethylsulfoxid (DMSO) eller 5 uM PEITC i fravær eller nærvær af 50 uM DAPT ved 200 ganges forstørrelse. Kvantificering af migrerede (B) LNCaP-celler og (D) PC-3-celler efter 24 timers behandling med DMSO eller 5 uM PEITC og /eller 50 uM DAPT. Tre til fire felter på hvert filter blev scoret for migrerede celler under et omvendt mikroskop. De viste resultater er gennemsnit ± SD (n = 3). * Signifikant forskellig (

P

0,05) mellem de angivne grupper ved envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni multiple sammenligning test. Hvert forsøg blev gentaget to gange, og repræsentative data fra et sådant forsøg er vist.

immunhistokemisk analyse for effekten af ​​PEITC på spaltede Notch2 protein

in vivo

Vi brugte arkiverede væv fra vores tidligere gennemførte undersøgelser [6], [13], [16] for at bestemme

in vivo

relevansen af ​​de cellulære fund (fig. 1). Fordi virkningen af ​​PEITC behandling var mest konsekvent og vedvarende på spaltet Notch2, blev den immunhistokemiske analyse er begrænset til dette protein. Repræsentative immunohistokemiske billeder for spaltet Notch2 ekspression i PC-3 tumor xenograft sektioner fra kontrol- og PEITC-behandlede mus er vist i fig. 7A. I overensstemmelse med resultaterne vist i dyrkede PC-3-celler (fig. 3A) nuklear udtryk for spaltet Notch2 var signifikant højere i PC-3 xenotransplantater fra PEITC-behandlede mus sammenlignet med kontrol (fig. 7A). Tilsvarende nukleare niveau af spaltet Notch2 protein i dorsolaterale prostata var signifikant højere i PEITC-fed TRAMP-mus sammenlignet med kontrol (figur 7B).

(A) repræsentant H &. E-farvning og immunhistokemisk farvning for ekspression af spaltet Notch2 protein i PC-3 xenotransplantater fra tre mus af de angivne grupper (skala bar, 50 um, forstørrelse, 400 ×). Amplifikation af valgte område er vist i det indsatte. Kvantificering af nuklear ekspression af Notch2 protein i PC-3 xenotransplantater fra kontrol- og phenethyl isothiocyanat (PEITC) -behandlet mus er vist i søjlediagrammet (gennemsnit ± SD, n = 3). (B) Immunhistokemi der viser den spaltede Notch2 proteinekspression i dorsolaterale prostata fra fire TRAMP mus af de angivne grupper (skala bar, 50 um, forstørrelse, 400 ×). Amplifikation af valgte område er vist i det indsatte. Kvantificering af nuklear ekspression af spaltet Notch2 protein i dorsolaterale prostata kontrol- og PEITC-fed TRAMP-mus er vist i søjlediagrammet (gennemsnit ± SD, n = 4). Statistisk signifikans blev bestemt ved t-test.

Diskussion

er stadig uklart Præcis rolle Notch signalering i udviklingen af ​​prostatacancer, men undersøgelser har forsøgt at løse dette problem med brugen af prostata cancer cellelinjer og humane prostatakræft biopsier. Nedregulering af Jagged1 er blevet vist at inhibere proliferation af prostatacancerceller [29]. Den samme gruppe af efterforskere rapporterede senere, at RNA-interferens af Notch1 tillægges beskyttelse mod prostatakræft celle migration og invasion [30]. Samtidig har overekspression af konstitutivt aktive Notch1 også blevet vist at inhibere proliferation af LNCaP-celler [31]. Fordi Notch signalering er ganske kompleks involverer samspil mellem fire receptorer (Notch1-Notch4) og fem ligander [Jagged1, Jagged2, Delta-lignende ligander (Dll1, Dll3, og Dll4)] [23], [24] og hver komponent af Notch signalering er ikke almindeligt undersøgt [29] – [31], er det sandsynligt, at uoverensstemmelsen skyldes kompenserende ændringer i andre dele udløst af knockdown af Notch1 eller Jagged1. Ikke desto mindre er Jagged1 udtryk i prostata cancer biopsier forbundet med øget metastaser og tilbagefald [32]. Den foreliggende undersøgelse afslører, at PEITC aktiverer Notch1 og Notch2 i kræft og normale prostata celler. Desuden PEITC administration forårsager betydelig stigning i nukleare niveauer af spaltet Notch2

in vivo

i prostata tumorer fra to forskellige gnavermodeller. Vi viser også, at aktivering af Notch1 og Notch2 reducerer PEITC evne til at inhibere prostatacancer cellemigration. Baseret på disse observationer, er vi fristet til at spekulere, at anti-metastatisk effekt af PEITC kan udvides med en kombinationsbehandling involverer en Notch-hæmmer.

LNCaP og PC-3 celler udviser slående forskelle med hensyn til PEITC-medieret ændringer i Notch signalering komponenter, især Notch-ligander og y-sekretase komponenter. To oplagte muligheder fortjener opmærksomhed for at forklare disse forskelle i PEITC respons mellem androgen-responsive LNCaP-celler (vildtype p53)

versus Salg kastrationsresistent og p53-nul-PC-3-celler. En sådan mulighed angår forskellen i status af p53 mellem LNCaP og PC-3-celler som Notch1 har vist sig at være et direkte mål for p53 [33]. Genoprettelse af p53-ekspression i humane cancercellelinier har vist sig at opregulere ekspressionen af ​​Notch1 [33]. Fordi PC-3 og DU145 celler, som begge mangler funktionelt p53, opfører sig på lignende måde med hensyn til PEITC-medieret aktivering af Notch1 og Notch2, mulighed for, at forskellen reaktion mellem LNCaP og kastrationsresistent celler (PC-3 og DU 145) er manifesteret, delvist om ikke fuldstændigt, af p53 kan ikke kasseres på nuværende tidspunkt. Samtidig er vi klar over, at reguleringen af ​​udtryk samt aktivering af Notch1 er ganske kompliceret medieret af andre faktorer end p53, herunder Nrf2, ETS transskription faktor familiemedlem PEA3, epidermal vækstfaktor receptor signalering, og Akt at nævne et få [34] – [37]. Mens yderligere undersøgelser er nødvendige for at løse dette spørgsmål omkring p53, er det rimeligt at konkludere, at forskellen reaktion mellem LNCaP og PC-3 celler ikke er relateret til androgen-lydhørhed, fordi LNCaP celler og dens androgen-uafhængig variant LNCaP-c4-2 udstilling generelt sammenlignelige respons på PEITC-medierede ændringer i Notch signalering komponenter. I den forbindelse er det vigtigt at nævne, at

Notch

målrette HEY (Behårede /Enhancer af split-relaterede med YRPW motiv) er en androgen receptor selektiv co-repressor [38].

Aktivering af Notch2 ved overekspression af sit intracellulære domæne fremmer apoptose i MDA-MB-231-celler [26]. Det var af interesse at bestemme konsekvenserne af Notch aktivering på proapoptotiske respons på PEITC i vores model. I modsætning Notch1 [30], en 40-60% knockdown af Notch2 protein har nogen meningsfuld indflydelse på apoptose i LNCaP eller PC-3 celler. Imidlertid er apoptose som følge af PEITC eksponering signifikant svækket ved Notch2 knockdown mindste PC-3-celler. På den anden side, undertrykkelse af Notch1 aktivering med DAPT har ingen effekt på proapoptotiske reaktion på PEITC. Baseret på disse resultater konkluderer vi, at Notch1 er undværlig for celledød som følge af PEITC eksponering i PC-3 og LNCaP-celler. Mekanisme, hvormed Notch2 knockdown giver beskyttelse mod PEITC apoptose er endnu ikke klart. Inhibering af adskillige anti-apoptotiske veje, såsom NF-KB og STAT3, kombineret med ændringer i ekspression af Bcl-2-familien proteiner er blevet impliceret i apoptose induktion ved PEITC [10], [11], [17], [19] , [39]. Det er muligt, at Notch2 knockdown ændrer effekt af PEITC på nogle af disse veje til at give beskyttelse mod apoptose.

Metastase er den primære årsag til dødelighed fra prostatakræft. Især Notch har været impliceret i EMT [27], som fremmer metastase [40]. Desuden behandling af LNCaP og PC-3-celler med γ-sekretase hæmmer DAPT er blevet vist at inhibere cellemotilitet [41]. Den foreliggende undersøgelse viser, at motiliteten af ​​både LNCaP og PC-3-celler reduceres signifikant ved knockdown af Notch2 protein under anvendelse siRNA (nedsat, men ikke signifikant i LNCaP) samt DAPT-medieret inhibering af Notch1 aktivering (reduceret, men ikke signifikant i PC 3). Endvidere PEITC-medieret hæmning af LNCaP og PC-3 cellemigrering forøges af knockdown af Notch2 protein samt farmakologisk inhibering af Notch1 spaltning (PC-3 kun). Mekanisme, hvormed Notch2 knockdown hæmmer celle migration stadig undvigende, men dette spørgsmål er blevet undersøgt for Notch1 [28]. Målrettet udtømning af Notch1 inhiberer PC-3 og 22Rυ1 cellemigration ved nedregulering ekspression af matrixmetalloproteinase-9 og urokinaseplasminogenaktivator [28]. Det er muligt, at Notch2 knockdown fremkalder lignende respons på matrixmetalloproteinase-9 og urokinase-plasminogen aktivator.

Som konklusion den foreliggende undersøgelse viser, at PEITC behandling fremmer spaltning af Notch1 og Notch2 fører til deres transkriptionel aktivering i både kræft ( LNCaP, PC-3 og DU 145) og normale (Prec) prostataceller. PEITC-induceret apoptose i prostatacancerceller er beskedent svækket ved knockdown af Notch2, men ikke ved farmakologisk inhibering af Notch1 aktivering.