PLoS ONE: Pan-Bd-2 Inhibitor Obatoclax Forsinkelser cellecyklusprogression og Blocks Migration af kolorektal cancer Cells

Abstrakt

På trods af at nye behandlingsregimer har forbedret samlet overlevelse af patienter udfordres af kolorektal cancer (CRC ), er prognosen i metastatiske situationen stadig begrænset. Bcl-2-familien af ​​proteiner er blevet identificeret som lovende anti target cancer drug. Selvom små molekyler rettet mod Bcl-2 proteiner er i kliniske forsøg, lidt er kendt om deres virkninger på CRC. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge præklinisk værdien af ​​ABT-737 og Obatoclax som anticancerlægemidler til CRC behandling. Virkningerne af BH3-mimetika ABT-737 og Obatoclax på CRC-celler blev vurderet ved anvendelse levedygtighed og apoptoseassays. Sårheling migration og Boyden kammer invasion analyser blev anvendt. 3-dimensionelle cellekulturer blev anvendt til sigt vurdering af invasion og proliferation lang. Klinisk relevante koncentrationer af pan-Bd-2-hæmmer Obatoclax ikke inducerede celledød. I modsætning hertil BH3-mimetiske ABT-737 inducerede apoptose i en dosisafhængig måde. Obatoclax forårsagede en cellelinie specifik opbremsning af CRC cellevækst. Endvidere Obatoclax, men ikke ABT-737, vundne E-cadherin ekspression og førte til forringet migration og invasion af CRC-celler. Den proliferative kapacitet og invasivitet af CRC-celler blev slående inhiberet af lavdosis Obatoclax i langsigtede 3-dimensionelle cellekulturer. Obatoclax, men ikke ABT-737, forårsagede en G1-fasen ledsaget af en nedregulering af cyclin D1 og opregulering af p27 og p21. Overekspression af Mcl-1, Bcl-x

L eller Bcl-2 tilbageføres den inhibitoriske virkning af Obatoclax om migration men undlod at genoprette proliferative kapacitet Obatoclax-behandlede CRC-celler. De præsenterede data indikerer brede og mangesidede antitumor virkninger af den pan-Bd-2-hæmmer Obatoclax på CRC celler. I modsætning til ABT-737, Obatoclax inhiberede migration, invasion og proliferation i subletale doser. Sammenfattende denne undersøgelse anbefaler pan-Bcl-2-hæmning som en lovende tilgang til kliniske forsøg i CRC

Henvisning:. Koehler BC, Scherr AL, Lorenz S, Elssner C, Kautz N, Welte S, et al . (2014) Pan-Bd-2 Inhibitor Obatoclax Forsinkelser cellecyklusprogression og Blocks Migration af kolorektal kræftceller. PLoS ONE 9 (9): e106571. doi: 10,1371 /journal.pone.0106571

Redaktør: Andrei L. Gartel, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: 23. marts 2014 Accepteret: 30 Juli 2014; Udgivet: September 5, 2014

Copyright: © 2014 Koehler et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle data er inkluderet i papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev understøttet af en postdoc-Fellowship givet til BCK fra det medicinske fakultet ved universitetet i Heidelberg, Tyskland (http: //www.medizinische-fakultaet- hd.uni-heidelberg.de), og tilskud til HSB fra den tyske Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft, https://www.dfg.de/, DFG Schu 1443 /4-1). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

colorectalt carcinom (CRC) repræsenterer den fjerde almindelige dødsårsag af kræft [1]. Forekomsten er stigende på verdensplan og 40% af alle patienter har fjernt orgel metastase på tidspunktet for første diagnose. Systemisk terapi tilgange og kirurgi har forbedret samlet overlevelse, men prognosen i UICC stadie IV er stadig fattige. Bcl-2-protein-familien omfatter vigtige regulatorer af apoptose virker i den mitokondriske overflade. Antiapoptotiske medlemmer af familien virker ved at binde deres proapoptotiske pårørende og dermed beskytte cellen fra døden. De antiapoptotiske proteiner MCL-1, bcl-2 og Bcl-x

L har vist sig at være opreguleret i flere faste og hæmatologiske cancer enheder herunder CRC [2] – [4]. Disse observationer førte til undersøgelse af flere forbindelser direkte målrettet mod antiapoptotiske Bcl-2 proteiner. Såkaldte BH3-mimetika virker ved binding til BH3 kløft antiapoptotiske proteiner [5]. Denne interaktion fører til frigivelse af proapoptotiske Bcl-2-proteiner endelig fremme celledød. Kliniske forsøg har vist sikkerhed og effekt af BH3 mimetika i forskellige hæmatologiske og få solide maligniteter [6]. Trods kliniske undersøgelser, gyldige prækliniske data om styrken af ​​BH3 mimetika som mulighed for CRC behandling er begrænsede. I denne undersøgelse undersøgte vi antitumoraktivitet af Obatoclax og ABT-737 på CRC-celler. Begge er småmolekyleinhibitorer af anti-apoptotiske Bcl-2-proteiner. De er forskellige i deres profil af inhibering, idet ABT-737 ikke inhiberer Mcl-1 henviser Obatoclax er en pan-Bcl-2-inhibitor. Vores undersøgelse viser, at ABT-737 inducerer celledød i forskellige CRC cellelinier. I modsætning hertil celledød inducerende kapacitet Obatoclax er begrænset og varierer blandt CRC cellelinjer.

Evnen til at migrere og invadere fremmede væv er et fælles træk af kræftceller dramatisk bidrager til malignitet af sygdommen. Vores gruppe har for nylig vist, at nedregulering af Mcl-1, Bcl-x

L eller Bcl-2 fører til en slående forringelse af migration og invasion af CRC-celler [7]. Her undersøger vi relevansen af ​​BH3-mimetika Obatoclax og ABT-737 til de ondartede funktioner. I modsætning til ABT-737, subletale doser af Obatoclax blok migration og invasion af CRC-celler i et Bcl-2-protein afhængig måde.

Desuden er denne undersøgelse er at vurdere proliferative kapacitet CRC-celler behandlet med Obatoclax og ABT-737. Lav dosis Obatoclax, men ikke ABT-737, har imponerende hæmmende effekt på cellecyklus progression og spredning. Her beskriver vi antiproliferative virkninger af Obatoclax uafhængige af Bcl-2-proteiner.

Som konklusion viste vores data, at pan-Bcl-2-inhibitor Obatoclax udøver forskellige antitumoraktiviteter uafhængige af celledød induktion, anbefale pan-Bcl- 2 hæmning for yderligere klinisk udvikling i tyktarmskræft.

Resultater

ABT-737, men ikke Obatoclax mesylat inducerer apoptose i CRC celler

for at vurdere celledød efter behandling af CRC celler med Obatoclax og ABT-737 i 48 timer, vi analyserede DNA-fragmentering ved flowcytometri. ABT-737 forårsagede celledød i alle undersøgte på en dosis-afhængig måde cellelinier. Den mest slående virkning blev observeret i Colo205 celler (mere end 90% apoptotiske celler efter 48 timer behandling med 10 pM ABT-737, fig. 1A). I modsætning hertil stigende koncentrationer af Obatoclax kun lidt induceret celledød i SW480, Colo205 og CaCo2 celler

(A og B) Flowcytometrisk analyse for DNA-fragmentering som indikator for apoptotisk død i fire CRC cellelinier.; 48 h behandling med ABT-737 eller Obatoclax. (C) MTT-analyse af HT29-celler efter 72 timers Obatoclax og ABT-737 behandling. (P-værdier: Oba 0,25 uM: 0,003; Oba 0,05 uM: 0,004; ABT-737 5 uM: 0,589) (d) repræsentative Western blot for spaltet PARP Efter 24 timers Obatoclax behandling. Tubulin tjente som lastning kontrol. 2 uM behandling med Staurosporin i 24 timer tjente som en positiv kontrol for celledød induktion. Assays blev udført i triplikater. Søjler repræsenterer middelværdi ± SD. Assays er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. Oba = Obatoclax, STS = Staurosporin.

HT29-celler viste ingen apoptotisk DNA fragmentering (Fig. 1B).

Vi verificerede vores resultater yderligere ved Western blotting for kløvet PARP. I overensstemmelse med flowcytometri data, var der ingen spaltet PARP påviselig i alle CRC-cellelinier som eksemplarisk vist for HT29 og SW480 i fig. 1D.

For at undersøge virkningerne af Obatoclax på proliferation, fulgte vi cellevækst af HT29-celler over tid (72 timer). Cellevækst blev inhiberet selv under lavdosis Obatoclax, hvorimod ubehandlede og ABT-737 behandlede celler fortsatte med at proliferere. Dette resultat er indikativt for en stærk effekt af Obatoclax på den proliferative kapacitet (Fig 1C).

Dernæst vi havde til formål at vurdere styrken af ​​Obatoclax sammen kemoterapeutiske midler godkendt til CRC behandling. Vi observerede, Oxaliplatin s cytotoksicitet blev forøget ved kombination med Obatoclax. Effekter er vist for en behandlingsperiode på 48 timer i konventionel cellekultur og yderligere valideret for en behandlingsperiode på 7 dage i 3D cellekultur (fig. S3). Hverken Obatoclax eller Oxaliplatin alene var i stand til at inducere celledød i SW480-celler (procentdel af spaltet PARP-positive celler: 1,3% [ubehandlede], 1,7 [0,25 uM Obatoclax] og 1,6% [20 pM Oxaliplatin]). I slående kontrast, 22,7% af cellerne undergik apoptose som angivet ved spaltet PARP farvning når Obatoclax og Oxaliplatin blev kombineret (fig. S3C). Vigtigere var der ingen sensibiliserende virkning for kombinationen af ​​Obatoclax med 5-FU (data ikke vist). Tilsammen vores observationer indikerer en dosisafhængig celledød induktion med ABT-737 og en dosis og celletype afhængig virkning på proliferation af Obatoclax. Kombinationen af ​​Bcl-2-inhibitorer med kemoterapi, f.eks oxaliplatin, bør analyseres som en potentiel behandling tilgang i fremtidige studier.

Obatoclax genopretter E-Cadherin i CRC celler, men efterlader antiapoptotiske Bcl-2 protein niveauer uændret

Vi har for nylig vist, at siRNA medieret nedregulering af anti-apoptotiske Bcl-2-proteiner hæmmer migration og invasion af CRC celler [7]. E-Cadherin er et primært membranbundet protein med en nøglefunktion for compliance kryds og Wnt-signalering. Det er blevet vist at være tabt under malign transformation [8]. Imponerende, fandt vi en fremtrædende genopretning af E-cadherin i alle cellelinjer, bortset fra SW480 celler, efter Obatoclax behandling (fig. 2A). Notatet N-Cadherin, som er blevet rapporteret som en promotor for migration, ikke påvises i de fire cellelinjer undersøgt (data ikke vist) [9].

(A) vestlig blotting til E-Cadherin i fire CRC cellelinjer efter 24 timer behandling med Obatoclax i stigende doser (til venstre). Tilsvarende densitometrisk analyse i forhold til ubehandlede kontroller, og justeret til tubulin som ladningskontrol. (B) Western blotting for Mcl-1, Bcl-2 og Bd-x

L i HT29-celler (til venstre) og SW480-celler (højre) efter 24 timer behandling med Obatoclax. Tubulin tjente som en belastning kontrol. Western blots er repræsentative for mindst tre klatter fra uafhængige forsøg.

Andre rapporterede, at antiapoptotiske bcl-2 proteiner, f.eks MCL-1, blev hurtigt og fuldstændigt nedbrudt i cancerceller behandlet med Obatoclax [10]. I skarp kontrast vore data viser ingen reduktion af Mcl-1, Bcl-2 eller Bcl-x

L niveauer. Ganske tværtimod hel celleprotein immunoblotting afslørede et forøget niveau af Bcl-x

L og en svag stigning af Bcl-2-niveauer i HT29-celler for alle Obatoclax koncentrationer anvendt (fig. 2B, venstre). I SW480 celler, Bcl-2 og Bcl-x

L-niveauer steg under lav dosis Obatoclax, men viste lignende niveauer ubehandlede celler under højere Obatoclax doser (fig. 2B, højre). MCL-1-niveauer viste en mere fremtrædende forhøjelse under Obatoclax behandling sammenlignet med Bcl-2 og Bcl-x

L i HT29-celler (fig. 2B, venstre). Der blev ikke påvist bemærkelsesværdige ændringer i MCL-1-niveauer for SW480-celler (fig. 2B, højre).

Lav dosis Obatoclax påfaldende svækker migration og invasion af CRC celler

For yderligere at undersøge virkningen af ​​Obatoclax på CRC celler, vi udførte sårheling migration assays. Selv subletale doser var i stand til massivt forringe vandrende kapacitet HT29-celler over tid. Efter 48 h, den målte udbedring var 650 um i kontrol- celler i forhold til 263 um i Obatoclax behandlede celler (Fig 3A og B, s. 0,001). Desuden CaCo2 celler migrerede signifikant mindre under behandling med 0,25 uM Obatoclax. Gap lukning var 901 vs. 744 um (fig 3C, s. 0,05). At bemærke, ABT-737 inhiberede ikke migration selv i en dosis på 5 uM som vist i fig. S1.

(A) Repræsentative billeder af sårheling scratch analyser af køretøjer (øvre) og Obatoclax (lavere) behandlede HT29-celler. Scale bar gælder for alle billeder. (B) Gap lukning af HT29-celler efter 48 timers behandling med Obatoclax. (C) Gap lukning af CaCo2 celler behandlet 48 h med Obatoclax. Assays blev udført i triplikater. Søjler repræsenterer middelværdi ± SD. Assays er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. * P 0,05, *** p 0,001. Oba = Obatoclax.

Tre-dimensionel cellekultursystemer bedre afspejler fysiologiske cellevækst samt morfologi og fremme celle-celle-interaktioner [11]. Desuden rejser et tredimensionalt systemet mulighed for at udføre for længe celledyrkningsforsøg herunder behandling eksponering få flere oplysninger end konventionel cellekultur. Således har vi brugt polystyrol stilladser til 7 dage Obatoclax behandling efterfulgt af vurdering af invasion, proliferation og apoptose. HT29-celler viste ikke induktion af apoptose efter behandling med Obatoclax (fig. 1B og D). Påfaldende, der var en massiv blokade af invasion i 3D langsigtet cellekultur (fig. 4A og B). Desuden viste Colo205 en dybt svækket migration i langsigtet cellekultur som angivet med et fald på invasion dybde (fig. S2). Ingen apoptoseinduktion men en forringelse af proliferation, som vist ved en reduktion af Ki67 positivitet, blev observeret (fig. S2). Denne observation understreger yderligere den brede antitumoreffektivitet af Obatoclax med hensyn til en migration inhibitorisk fænotype kombineret med en antiproliferativ virkning, uafhængig af celledød induktion.

(A) Repræsentative billeder af HT29-celler i stilladser efter 7 dages behandling med Obatoclax (Hematoxylin og eosin farvning. Scale bar gælder både billeder) (B) Tilsvarende analyse af invasion dybde i stilladser. Assays blev udført i triplikater. Søjler repræsenterer middelværdi ± SD. Assays er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. *** P 0,001. Oba = Obatoclax.

Dernæst undersøgte vi invasiv af SW480 celler behandlet med lav dosis Obatoclax i en matrigel indeholdende Boyden kammer assay. For at bevise passende fastgørelse af celler i Obatoclax indeholdende medium blev celler tidligere podet på polystyren-plader, efterfulgt af MTT-assay efter 24 timer. Der var ingen forringet fastgørelse observeret i nærvær af Obatoclax (data ikke vist). Invasion var påfaldende hæmmet i celler behandlet med 0,25 uM Obatoclax (293 invaderede kontrol celler vs. 89 invaderet Obatoclax behandlede celler, p. 0,001, figur 5) og blev yderligere ophævet i celler behandlet med 0,5 pM Obatoclax (293 invaderede kontrol celler vs. 59 invaderet Obatoclax behandlede celler, s. . blev 0,001, figur 5)

SW480 celler podet i det øvre kammer i et Transwell. 48 timer efter podning blev kerner på den nedre overflade visualiseret ved Hoechst-farvning. (A) Repræsentative billeder af lavere insert overflade efter Hoechst farvning (skala bar angiver forstørrelsen for alle paneler). (B) Fem synsfelter pr insert blev talt. N = 5 pr gruppe. Værdier er udtrykt som middelværdi ± SD. Assays er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. *** P 0,001. Oba = Obatoclax, ctrl = kontrol.

Overekspression af antiapoptotiske Bcl-2 proteiner genopretter migration af Obatoclax behandlet CRC celler

Næste, vi havde til formål at udforske engagement antiapoptotisk Bcl-2 proteiner til migration inhibitorisk fænotype forårsages af Obatoclax. Vi fandt en imponerende genopretning af migration i HT29-celler behandlet med 0,25 uM Obatoclax men overekspression antiapoptotiske Bcl-2 proteiner. Denne fænotype reverterende virkning blev observeret for Mcl-1 (p 0,05), Bcl-x

L (p 0,001) og Bcl-2 (p 0,001), med den mest udtalte virkning for Bcl-2 (fig. 6A-D). Overekspression af antiapoptotiske proteiner konstant blokeret hæmning af migration under Obatoclax behandling i løbet af 72 timer. Det er af stor betydning i denne forbindelse for, at en genoprettelse af migration er ingen sekundær træk ved en øget proliferation grundet en overekspression af anti-apoptotiske Bcl-2-proteiner. Derfor undersøgte vi proliferation i celler, der overudtrykker Mcl-1, Bcl-2 eller Bcl-x

L. Vi observerede ingen virkning på proliferation for nogen af ​​de undersøgte proteiner som vist detaljeret i fig. S4. (A-D).

(A-D) Gap lukning af sårheling migration analyser af HT29-celler behandlet med Obatoclax. (A) Vector og Mcl-1 transficerede celler (B) vektor og Bd-XL-transficerede celler og (D) vektor og Bcl-2 transficerede celler. (C) Repræsentative billeder af sårheling af vektor og Mcl-1 transficerede celler behandlet med Obatoclax. Værdier er udtrykt som middelværdi ± SD. Assays er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. *** P 0,001. Vec = vektor.

Lav dosis Obatoclax hæmmer proliferation via G1-fasen ledsaget af en opregulering af p27 og p21 samt nedregulering af cyclin D1

Da CRC celler i 3D stilladser viste en svækkelse af spredning under langtidsbehandling med Obatoclax, besluttede vi at yderligere dissekere cellecyklusregulering. Farvning for DNA-indhold under Obatoclax behandling viste en massiv skift fra den G2- i G1-fasen af ​​cellens cyklus, der er indikativ for G1-fasen eller et afbrudt G1-faseovergang. Andelen af ​​celler i G2-fase faldt fra 37% i kontrolcellerne til 13% i HT29 celler behandlet med 0,25 uM Obatoclax (fig 7A og B, s. 0,001).

(A) repræsentant flow cytomeric analyse for DNA-indhold i HT29 celler behandlet med 0,25 uM Obatoclax. 2N = diploide celler i G1-fasen, 4N = tetraploide celler i G2-fasen. (B) Grafisk analyse af cellecyklus fasefordeling svarende til (A). Værdier er udtrykt som middelværdi ± SD. *** P 0,001. (C) relativ. mRNA-niveauer af cyklin D1, p21 og p27 i HT29 og Caco 2-celler efter 24 timers behandling med Obatoclax. mRNA-niveauer blev kvantificeret ved QRT-PCR og normaliseret til GAPDH som housekeeping-gen. Assays er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. (D) Repræsentative Western blots for cyclin D1, p21, og p27 i HT29 og CaCo2 celler behandlet med Obatoclax i 24 timer. Tubulin tjente som en belastning kontrol. Oba = Obatoclax, ctrl = kontrol.

Derudover har vi til formål at kvantificere centrale cellecyklus regulerende proteiner under Obatoclax behandling. Cyclin D1 (CD1) repræsenterer nøglen cyclin for G1-faseovergangen [12]. CD1 blev markant nedreguleret under Obatoclax behandling på både mRNA og proteinniveauet i HT29 (0,5 gange ændring) og CaCo2 celler (mere end 0,5 gange ændring, fig. 7C og D). p27 er en cyklin-afhængig kinase inhibitor (CDKI) og dens opregulering indikerer cellecyklusstandsning [13]. Vi observerede en opregulering af p27 på mRNA og protein niveauer i HT29 og CaCo2 celler behandlet med Obatoclax (fig. 7C og D). Derudover observerede vi en bemærkelsesværdig og dosisafhængig forøgelse af cyclin-afhængig kinase inhibitor p21 på mRNA og protein niveauer i HT29 og CaCo2 celler (fig. 7C og D). Tilsammen disse data er vejledende for en celle cyklus regulering af Obatoclax via centrale regulatoriske proteiner af cellecyklus overgang, såsom cyclin D1, p27 og p21.

Diskussion

Anitapoptotic medlemmer af Bcl -2 proteinfamilie ofte overudtrykt i humane cancere herunder CRC [3]. Høje niveauer af anti-apoptotiske proteiner er blevet vist at bidrage til dårlig terapireaktionen og fremme tumorudvikling. For eksempel Bcl-x

L-ekspression korrelerer med lymfeknudemetastaser, dårlig differentiering og højere Dukes stadie i CRC [14]. Ekspressionsmønstre for Mcl-1 er prædiktive for terapi respons hos patienter diagnosticeret med metastaseret CRC [15]. Derfor har gjort en stor indsats for at målrette antiapoptotiske Bcl-2 proteiner, der sigter mod kræft celledød induktion [16]. Vigtigere, dybere mekanistiske og strukturelle indsigt førte til udviklingen af ​​inhibitorer med små molekyler af anti-apoptotiske Bcl-2-proteiner. Denne klasse af små molekyler virker ved at binde til den hydrofobe BH3-kløft antiapoptotiske Bcl-2-proteiner og derved efterligner proapoptotiske Bcl-2-proteiner og fremme celledød [17]. Sikkerheds- og dosisbestemmende forsøg med Obatoclax er blevet udført i solide maligniteter og lymfom [18], [19]. Selvom om BH3-mimetika allerede har indtastet tidlige kliniske forsøg, er kun få kendt om effekten af ​​Bcl-2-protein-inhibering bortset fra celledød regulering [18], [19]. Vi har for nylig vist, at en knockdown af Mcl-1, Bcl-2 eller Bcl-x

L slående inhiberer invasivitet af CRC-celler. I denne tidligere undersøgelse, en knockdown af en enkelt Bcl-2-protein (MCL-1, Bcl-2 eller Bcl-x

L) var tilstrækkelig til at blokere migration og invasion [7].

Baseret på disse tidligere rapporter, vores undersøgelse med henblik på at undersøge potentialet i Bcl-2 hæmmende små molekyler som lægemiddelkandidater til CRC behandling

in vitro

. Først, vi sammenlignede effekten af ​​Bcl-2 og Bcl-x

L inhibitor ABT-737 med den pan-Bcl-2-inhibitor Obatoclax. En direkte sammenligning af de to inhibitorer giver karakteristiske virkninger af en bred pan-Bcl-2-inhibering med Obatoclax fra en mere specifik måde ved hjælp ABT-737. Trods det faktum, at begge hæmmere viste signifikant toksicitet i kliniske forsøg, kan disse forbindelser anvendes som redskaber til præklinisk

in vitro

-testing af Bd-2 hæmning [19] – [22]. ABT-737 har vist sig at virke synergistisk med Oxaliplatin og celecoxib i drab af CRC celler [23], [24]. Vi observerede dosisafhængig apoptoseinduktion forårsaget af ABT-737 i alle undersøgte cellelinjer. Det er veldokumenteret, at en modstand, dybt ABT-737 kan drives af høje niveauer af Mcl-1 via hæmning af proapoptotiske NOXA [25]. For ganske nylig er det blevet påvist, at cancerceller i hypoxiske betingelser er resensitized til ABT-737 ved tab af Mcl-1 [26]. Da virkningerne af ABT-737 er klart proapoptotiske og determinanter for følsomhed i CRC er veldokumenterede, besluttede vi at yderligere fokus på antitumor virkninger af Obatoclax.

I skarp kontrast til ABT-737, Obatoclax førte ikke til signifikant celledødsinduktion i CRC-celler. I vores undersøgelse, Obatoclax anvendte doser var klinisk relevant, som angivet i fase I studier, og nåede ikke Compound IC

50 rapporteret for Obatoclax [19], [27] Det er interessant, Obatoclax behandling resulterede i stabile eller stigende ekspressionsniveauerne af alle antiapoptotiske Bcl-2-proteiner undersøgt. En anden undersøgelse viste nedregulering af anti-apoptotiske Bcl-2-proteiner under Obatoclax behandling i lymfomceller [10]. Da denne undersøgelse viser apoptose af lymfomceller forårsaget af Obatoclax, reducerede niveauer af antiapoptotiske proteiner kan være sekundær i løbet af celledød frem udløst af en direkte binding virkning Obatoclax.

Knockdown eller overekspression af Mcl-1 , Bcl-2 eller Bcl-x

L forsinkede ikke cellecyklusprogression og proliferation i CRC-celler [7]. Derimod lavdosis Obatoclax behandling forårsagede forsinket proliferation i vores undersøgelse. Vi opdagede en G1-fasen anholdelse ledsaget af tab af cyclin D1 udtryk og opregulering af p21 og p27. Cyclin D1 (CD1) er den mest fremtrædende G1-fasen Cyclin og er blevet rapporteret som et onkogen driver i kræftceller. CD1-ekspression er associeret med neoplastisk transformation og forøget malignitet i cancer [12]. G1 /S-faseovergangen er stramt reguleret af CDKIs såsom p21 og p27 via inaktivering af G1 Cyclin-cyclinafhængige kinaser (CDK) komplekser [13], [28]. Tilsammen vores data viser en ny cellecyklus regulering egenskab af Obatoclax via G1-fasen anholdelse. Denne virkning blev ikke antagoniseret af overekspression af anti-apoptotiske Bcl-2-proteiner. Desuden kan hverken overekspression af anti-apoptotiske Bcl-2-proteiner eller ABT-737 påvirkede cellecyklusprogression. Forsinke cellecyklus og forringer ukontrolleret vækst af CRC-celler er tilsyneladende en Bcl-2-protein uafhængig virkning Obatoclax. Selv om de eksakte underliggende mekanismer og de relevante mål forbliver undvigende, kan det være muligt, at mTOR signalering spiller en rolle i denne sammenhæng. En bindende aktivitet af Obatoclax til mTOR samt et sent stadium autophagy hæmning er for nylig blevet rapporteret, og kunne spille en forårsagende rolle for de beskrevne antiproliferative virkninger [29], [30]. Yderligere anstændige molekylære analyser berettiget til at dissekere Obatoclax relevant indflydelse på celle cyklus regulering. For eksempel kan CDK’er undersøges som potentielle mål for Obatoclax i fremtidige undersøgelser.

Konventionelle kemoterapeutika er mest effektive på replikerende cancerceller. Selv hvis vi viser tydeligt, at Obatoclax reducerer de proliferative egenskaber af CRC-celler, vores data viser Obatoclax evne til at overvinde celledød bestandighed mod Oxaliplatin i SW480-celler. Den terapeutiske potentiale for at kombinere Platin-baserede kemoterapi med Obatoclax for at overvinde apoptose modstand er allerede blevet rapporteret og er yderligere fremhævet af vores data [31], [32]. I esophageal carcinomaceller, Obatoclax havde synergistiske aktiviteter langs med 5-FU [32]. I vores undersøgelse blev synergistiske virkninger af Obatoclax begrænset til Oxaliplatin peger på en cancer celletype afhængig virkning. Stærke effekter af Obatoclax på autophagy er blevet påvist i flere nyere undersøgelser [32] – [34]. Men relevansen af ​​Obatoclax-induceret autophagy signalering stadig undvigende for CRC

Migration og invasion er forudsætninger for kræft celle spredning, hvilket fører til lokal invasion og fjernt orgel metastaser [35] – [37].. Vores gruppe for nylig demonstreret regulatoriske funktioner af antiapoptotiske Bcl-2 proteiner på migration og invasion af CRC celler uafhængigt af celledød og proliferation [7]. I lyset af det faktum, at Obatoclax ikke i tilstrækkelig grad kunne fremkalde død i CRC celler, vi undersøgte migration og invasion af CRC celler under Obatoclax behandling. Påfaldende, lavdosis Obatoclax blokeret migration og invasion i alle undersøgte cellelinjer. Langsigtet 3D cellekultur af CRC celler under Obatoclax behandling bekræftede denne blokade af migration trods manglende celledød induktion. Vigtigt er det, migration blev blokeret af Obatoclax i resistente cellelinier såsom Colo205 og Caco2. Cadheriner er vigtige regulatorer af celle vedhæftning og er involveret i større signalering netværk såsom Wnt. Det er blevet vist, at en betinget intestinal specifik knockout af E-cadherin forårsagede øget migration og proliferation i tarmen [38]. På den anden side, ekspression af E-cadherin bremset migration og proliferation i de intestinale krypter [39]. I kolorektal carcinogenese, funktionel eliminering af E-Cadheriner repræsenterer et vigtigt skridt i købet er invasiv [40]. Vi har derfor til formål at undersøge ændringer i E-cadherin ekspression. Vi demonstrerer en dyb restaurering af E-cadherin i CRC celler under behandling med Obatoclax. Imidlertid kan E-cadherin opregulering repræsenterer den molekylære skifte tilbage til en mindre invasiv fænotype af CRC celler forårsaget af Obatoclax.

Vigtigt og i modsætning til det vækstinhiberende funktion af Obatoclax, migration blev fuldstændig genoprettet i CRC-celler overudtrykker Mcl-1, Bcl-2 eller Bcl-x

L. I forbindelse med invasivitet, synes antiapoptotiske Bcl-2-proteiner som de vigtigste berørte mål. Dette er i tråd med vores tidligere rapport, der viser en regulerende funktion antiapoptotiske Bcl-2 proteiner på CRC celle invasiv uden at påvirke proliferation eller overtale celledød [7]. Andre undersøgelser understøtter den hypotese, at Bcl-2-proteiner er relevante for metastase [41] – [43]. Omvendt, ABT-737 behandling ikke tilstrækkelig til at blokere migration og invasion af CRC-celler. I vores undersøgelse viser vi, at Obatoclax kan hæmme både, migration og invasion, selv i meget lave doser. Denne virkning af Obatoclax er hidtil ukendt og betydeligt, selv i primært resistente celler. Da ABT-737 ikke hæmmer migration, foreslår vi en agent-specifikke og unikke træk ved Obatoclax inden for gruppen af ​​forbindelser rettet mod Bcl-2 proteiner.

Konklusion

Baseret på data fra vores undersøgelse, konkluderer vi, at Pan-Bd-2-hæmmer Obatoclax modvirker forskellige biologiske processer er relevante for tumor progression. Effekten af ​​Obatoclax på CRC celler er bred og omfatter en celledød uafhængige, men Bcl-2-protein afhængige hæmning af migration. Det andet store effekt påvirker cellecyklusprogression og er uafhængig af Bcl-2-protein targeting. Således pan-Bd-2-hæmning, herunder udvikling af specifikke og mindre giftige hæmmere, er en lovende metode til CRC behandling og bør analyseres nærmere, f.eks i kombination med kemoterapi.

Materiale og metoder

Reagenser og cellelinjer

CRC cellelinjer HT29, SW480, Caco2 og Colo205 blev købt fra ATCC. Celler blev dyrket i en fugtig atmosfære (37 ° C, 5% CO

2) i RPMI + Glutamax (Gibco, Karlsruhe, Tyskland) suppleret med 10% FCS (PAA Laboratories, Cölbe, Tyskland), 1% Pen /Strep (PAA Laboratories), 1% HEPES (Gibco) og 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA, Gibco). Obatoclax og ABT-737 blev købt fra Selleckchem (München, Tyskland), Oxaliplatin fra Sigma-Aldrich (München, Tyskland).

Levedygtighed og cellevækst test

Celler blev podet i 12 brønds plader og 24 timer efter podning transficeres eller behandles som anført. Cellevækst blev bestemt under anvendelse af et kolorimetrisk 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay som beskrevet [7].

Kvantitativ real-time polymerasekædereaktion (q-RT-PCR)

Isolering af totalt RNA og cDNA-syntese blev udført som tidligere beskrevet [44]. Q-RT PCR blev udført under anvendelse af primer assaykits (Qiagen, Hilden, Tyskland). erhvervelse og bestemmelse af genekspression data blev udført under anvendelse af LightCycler softwarepakke (Roche, Mannheim, Tyskland). Hver PCR-reaktion blev kørt in duplo. mRNA-ekspression blev normaliseret til ekspressionen af ​​housekeeping-genet GAPDH.

Påvisning af apoptose og cellecyklus fasefordeling

På dag ét efter transfektion blev celler behandlet som angivet i 48 timer. Supernatanten blev overført til FACS rør og cellerne blev derefter forsigtigt fritliggende hjælp Accutase. Efter centrifugering blev celler resuspenderet i en hypotonisk puffer indeholdende 0,1% (vægt /volumen) natriumcitrat, 0,1% (volumen /volumen) Triton X-100 og 50 ug /ml propidiumiodid (Sigma-Aldrich). Efter 1 time ved 4 ° C, blev totalt DNA indholdet af celler målt i henhold til protokollen af ​​Nicoletti

et al.

Anvendelse af flowcytometri [45]. Cellecyklusanalyse blev udført under anvendelse af FACS Diva 6 (Becton Dickinson) og FlowJo 7.6.5. (Tree stjerne Inc.). Celler repræsenterer sub-G1 fraktion blev afbildet som apoptotiske.

Cellelyse, SDS-Page, Western blotting og densitometri

Celler blev podet i plader med 6 brønde, dyrket i 24 timer og behandles som angivet. Cellelyse, SDS-PAGE og western blotting blev udført som tidligere [46] beskrevne.