PLoS ONE: En Epigenetisk Signatur i perifert blod forudser Active æggestokkene Cancer

Abstrakt

Baggrund

Nylige undersøgelser har vist, at DNA-methylering (dNAM) markører i perifert blod kan holde lovende som diagnostisk eller tidlig påvisning /risikomarkører for epitelial kræft. Men til dato ingen undersøgelse har evalueret den diagnostiske og intelligent potentiale af sådanne markører i en stor sag kontrol kohorte og på en genom-plan.

vigtigste resultater

Ved at udføre genom-dækkende dNAM profilering af en stor kræft i æggestokkene tilfælde kontrol kohorte, vi her vise, at aktiv kræft i æggestokkene har en betydelig indvirkning på dNAM mønster i perifert blod. Konkret ved at måle methylering niveauer end 27.000 CpG’er i blodceller fra 148 raske personer og 113 aldersmatchede forbehandling ovariecancer tilfælde, vi udlede en dNAM signatur, der kan forudsige tilstedeværelsen af ​​aktive ovariecancer i blinde test sæt med en AUC på 0,8 (95% CI (0,74-0,87)). Vi validerer yderligere vores resultater i en anden uafhængig sæt af 122 sager efter behandlingen (AUC = 0,76 (0.72-0.81)). Derudover leverer vi bevis for et betydeligt antal kandidat risiko eller tidlig påvisning markører for kræft i æggestokkene. Endvidere ved at sammenligne mønstret for methylering med genekspression data fra store blod celletyper, vi her viser, at alder og kræft fremkalder fælles ændringer i sammensætningen af ​​perifert blod, med et myeloid skævhed, der øges med alderen og som forværres yderligere i tilstedeværelse af ovariecancer. Endelig viser vi, at de fleste kræft og alder i forbindelse methylering variabilitet findes ved CpG’er placeret uden for CpG øer.

Betydningen

Vores resultater understreger potentialet i dNAM profilering i perifert blod som et redskab til afsløring eller risiko-forudsigelse af epitelial kræft, og garanterer yderligere dybtgående og videregående studier CpG dækning for yderligere at belyse denne rolle

Henvisning:. Teschendorff AE, Menon U, Gentry-Maharaj A, Ramus SJ, Gayther SA , Apostolidou S, et al. (2009) En Epigenetisk Signatur i perifert blod forudser Aktiv kræft i æggestokkene. PLoS ONE 4 (12): e8274. doi: 10,1371 /journal.pone.0008274

Redaktør: Rodolfo Aramayo, Texas A M University, USA

Modtaget: September 7, 2009; Accepteret: November 13, 2009; Udgivet: 18. december 2009

Copyright: © 2009 Teschendorff et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Eve Appeal og foretaget på University College London Hospital (UCLH) /University College London (UCL), som har modtaget en del af midlerne fra Department of Health, National Institute for Health (NIHR), Biomedical Research centre støtteordning. AET blev understøttet af en Heller Research Fellowship. AET takker Michael og Morven Heller for Heller Research Fellowship. SB blev støttet af Wellcome Trust. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Ian J. Jacobs er konsulent inden for kræft i æggestokkene til Becton Dickinson.

Introduktion

rolle epigenetik i kræft og andre almindelige komplekse sygdomme er ubestridt [1], [2]. En unik facet af epigenetiske mærker, der adskiller dem fra deres genetiske modstykker, er deres følsomhed over for undergå ændringer som reaktion på kosten og andre miljømæssige eksponeringer [1], [3], [4]. I betragtning af den epidemiologiske forbindelse mellem miljøfaktorer og kræft er det naturligt at hypotesen, at epigenetiske mutationer erhvervet under en persons liv, prædisponerer individet til sygdommen [1], [5] – [8]. En sådan model er yderligere understøttet af enæggede tvilling undersøgelser, der peger på alder og miljørelaterede epigenetisk divergens som årsag til uharmonisk sygdomsstatus [9], [10]. Det ser således plausibelt, at epigenetiske ændringer forbundet med miljøet og aldring kan selv være relateret til cancer [11], og specifikt, at en række af disse epigenetiske mutationer kan udgøre kræft disposition markører.

For nylig DNA methylering (dNAM) af specifikke gener (

SEPT9, RASSF1A, APC

) i serum DNA er blevet foreslået som diagnostiske og prognostiske biomarkører for kolorektal cancer [12], [13] og brystkræft [14], hhv. DNA methylering (dNAM) ændringer, der er forbundet med kræft og aldring er også blevet observeret i perifere blodprøver fra postmenopausale kvinder [15], [16]. Specifikt er det blevet foreslået, at kendte epidemiologiske risikofaktorer (fx høje hormonniveauer) kan efterlade dNAM aftryk i perifert blod DNA og at tidlig påvisning af disse mærker kan anvendes til at forudsige den fremtidige risiko for et individ udvikler cancer [15]. Men hvorvidt dNAM markører afledt fra perifert blod kan tjene som diagnostiske eller risiko-forudsigelsesværktøjer forbliver kontroversiel [17] og ingen undersøgelse endnu har evalueret deres kliniske potentiale på en genom-plan.

Vi udførte genom-dækkende dNAM profilering af perifere blodprøver fra en stor kræft i æggestokkene case-kontrol kohorte til at hjælpe behandle følgende spørgsmål. Først, hvilken effekt har tilstedeværelsen af ​​cancer har på dNAM mønster i perifert blod, et væv, som ikke skyldes cellen stammer fra en epitelcancer, og mere specifikt kan tilstedeværelsen af ​​cancer forudsiges ud fra dNAM profil i blod ? For det andet, kan vi identificere methylering markører i blodet, som kan tjene som tidlig påvisning eller disposition markører for kræft i æggestokkene? Identifikation af pålidelige diagnostiske eller tidlig påvisning biomarkører på basis af blod er af stor klinisk og biologisk betydning, specielt for ovariecancer hvor tidlig påvisning er vanskeligt [18]. Endelig efter de seneste rapporter om, at de fleste methylering variable positioner er placeret uden for CpG-øer [19], vi udforsket den genomiske mønster af methylering variable positioner i forhold til CpG tæthed.

Resultater

Alder og kræftrelaterede DNA-methylering Mønstre

Alle 540 perifere blodprøver blev hybridiseret til 27 k Menneskelig methylering Infinium beadchip arrays [20] (Materialer og Metoder, tabel S1). En streng kvalitetskontrol og inter-opstilling normalisering fremgangsmåde blev anvendt til at fjerne confounding variation som følge eksperimentelle faktorer, hvilket resulterer i en normaliseret data matrix af methylering score (p-værdier, 0 P 1) på tværs 383 prøver (148 sunde, 113 pre -Behandling (Pret) æggestokkene kræfttilfælde, 122 efterbehandling (post) æggestokkene kræfttilfælde) og 25,642 CpG sites (Materialer og metoder, figur S1). Singular værdi dekomposition (SVD) af de normaliserede data demonstreret mindst 10 betydende dele af variation med de største komponenter er forbundet med fænotypiske faktorer, navnlig tilstedeværelsen af ​​kræft og alder (figur S2, materialer og metoder).

En DNA methylering underskrift associeret med kræft i æggestokkene

Vi vedtog et overvåget tilgang til at udlede en bestemt DNA-methylering signatur kræft og for at spørge, om en sådan signatur kunne bruges til at forudsige sygdomsstatus blinde prøver. Konkret har vi argumenteret for, at tumor tilstedeværelse kan have en tilstrækkelig stor indvirkning på DNA-methylering mønstre, det burde kunne detekteres fra perifere blodprøver hos patienter før i behandling.

For at sikre, at resultaterne ikke var partiske til en specifik valg af uddannelse /test sæt partition, vi udførte i alt 100 kørsler, hver kørsel ved hjælp af en anden uddannelse /test sæt partition (materialer og metoder). For hver valg af træningssættet (90 kontroller og 70 Prêt prøver), anvendte vi en multivariat logistisk regressionsmodel (MVLR), med CpG specifikke methylering profil som prædiktor og med BSC (bi-sulfit konvertering) effektivitet, DNA input og batch virkning som potentielt forstyrrende faktorer, at udlede en p-værdi på association med sagen kontrol status for hver af de 25,642 CpG sites (materialer og metoder). Dernæst blev CpG sites rangeret efter deres p-værdier og en indskrumpet tyngdepunkt klassifikatør uddannet på de øverste 1000 CpG sites (FDR 0,05, materialer og metoder). Vi observerede, at for det store flertal af 100 kørsler, optimale (eller tæt på optimale) klassificeringen ydeevne i interne cross-valideringer blev opnået ved at vælge de 100 CpG sites. Endelig i hver kørsel, blev den resulterende top 100 CpG klassificeringen evalueret i en blind test sæt bestående af 58 raske kontrolpersoner og 43 pret sager. Classifier præstation på uddannelses- og test sæt blev evalueret ved hjælp af ROC kurver og tilhørende AUC (figur 1a-b). I løbet af de 100 kører, den gennemsnitlige AUC og 95% CI i uddannelse og test sæt var 0,82 (0,78-0,85) og 0,80 (0,74-0,87), hvilket angiver, at de afledte klassificører bibeholdt stærk forudsigelseskraft i blinde test sæt ( Figur 1a-b).

a-b) Klassificering udførelsen af ​​DNA methylering klassifikatorer i a) uddannelse sæt og b) blind test sæt. Træning og test sæt bestod af blodprøver fra før behandlingen sager og raske individer (materialer og metoder). Gennemsnitlig ROC-kurve over 100 forskellige træning /test sæt partitioner med 95% CI konvolut i blindtest sæt. Mean AUC og 95% CI over 100 forskellige partitioner er givet. c) Klassificering præstationer i test sæt bestående af raske kontrolpersoner og efter behandling prøver med tegn på aktiv sygdom. d) Sammenhæng mellem placeringen af ​​top CpG’er diskriminerer forbehandling sager fra raske kontrolpersoner i regressionsmodeller, der omfattede alder (x-aksen) og uden alder (y-aksen) som en co-faktor. Afbildet er log10 (p-værdier) for de 25,642 CpG sites, som vurderes fra flere logistiske regressionsanalyse af case /kontrol status mod CpG methylering profil med alder som en co-faktor (x-aksen) og uden alder som en co- faktor (y-aksen). Spearman korrelation mellem de to placeringer er givet

Dernæst undersøgte vi, om de afledte klassificører kunne forudsige kræft status af prøver efter behandlingen med tegn på aktiv sygdom. (Bestemt af CA125 serumniveauer 30) på tidspunktet for prøven draw (47 prøver). Gennemsnit over de 100 kørsler, opnåede vi en AUC på 0,76 (0,72-0,81, 95% CI) i blinde test sæt bestående af 58 raske kontrolpersoner og (faste) 47 postreatment prøver (figur 1c). Stærk til at skelne efter behandling prøver med aktiv sygdom fra dem uden blev også opnået (AUC = 0,74,

P

0,001). Disse resultater bekræftede således evnen hos de afledte klassifikatorer at forudsige tilstedeværelsen af ​​tumorer i prøver efter behandlingen. I modsætning hertil har de klassificører ikke forudsige kræft status af prøver efter behandlingen uden tegn på aktiv sygdom (70 prøver) i forhold til raske kontrolpersoner (AUC = 0,52 (0,48 til 0,55, 95% CI)).

Dernæst spurgte vi, om klassificeringen ydeevne kunne blive påvirket af alder. For at løse dette, vi sammenlignet rækkefølgen af ​​de CpG steder i den overvågede MVLR analyse med den tilsvarende placering i en MVLR model, der omfattede alder som en co-faktor. Dette viste, at p-værdier for foreningen var stort set uændret, og at begge placeringer var stærkt korreleret (Spearman rank korrelation = 0,998, figur 1d), som viser, at CpG websteder, hvor vores klassificering var baseret var prædiktive for kræft status uafhængigt af alder.

kræft Diagnostic CpG’er (CA-CpG’er)

Efter at have fastslået, at en DNA-methylering signatur fra perifert blod kan bruges til at forudsige tilstedeværelsen af ​​kræft i æggestokkene, vi næste brugt alle de raske kontrolpersoner og præ- behandling prøver at udlede en endelig liste over sådanne “kræftdiagnostiske” CpG’er (CA-CpG’er).

Vi identificerede i alt 2714 CA-CpG’er passerer en FDR tærskel på 0,05 (figur 2a, tabel S2, figur S3 ). Vi observerede en skæv retning af hypometylering med 1513 (56%) CA-CpG’er viser lavere niveauer af methylering i tilfælde (figur 2a, binomialtest

P

= 9 × 10

-10). Endnu mere påfaldende, for de øverste 50 CpG’er (47 unikke gen loci), 41 (87%) blev hypomethylated (binomialtest

P

= 10

-8, tabel S2). Af de 2714 CA-CpG’er, var 1482 (55%) og 1232 (45%) placeret inden (iCpGs) og uden for (niCpGs) CpG-øer [21], henholdsvis. I betragtning af den overrepræsentation af iCpGs på array (76% iCpGs vs 24% niCpGs), at antallet af niCpGs forbundet med kræft var meget højere end forventet ved en tilfældighed (figur 2a, Fisher test

P

2

e

-16). Den overrepræsentation af niCpGs blandt CA-CpG’er var også tydeligt fra inspektion af top 47 CA-CpG gen loci med 32 (68%) lokaliseret til niCpGs (Fisher test

P

= 6 × 10

-12 )

a) Fordeling af 2714 CA-CpG’er (FDR. 0,05) i form af hyper-og-hypometylering (binomialtest P-værdi givet), samt i forhold til CpG lokalisering (Fishers eksakte test) . b) Overlapning af aldersrelaterede CpG’er med CA-CpG’er (Fisher-test P-værdi på overlap givet) og fordelingen af ​​198 fælles alder og CA-CpG’er i form af hypermethyleret og hypomethylated mønstre og iCpGs /niCpGs (binomial og Fisher-test P-værdier er givet henholdsvis). Ud af de 198 CpG’er, 47 exbited hypermethylering med alderen og kræft, 150 hypometylering med alderen og kræft, en hyperM med alderen og hypoM med kræft og 0 viste hypoM med alderen og hypeM i kræft. c) Gene Set Berigelse Analyse for den fælles alder CA-CpG’er, aldersspecifikke CpG’er (dvs. alder CpG’er minus CA-CpG’er) og CA-specifikke CpG’er (dvs. CA-CpG’er minus alder-CpG’er) stratificeret efter hyper /hypometylation. Benjamini-Hochberg justerede P-værdier er givet. . Vigtigst beriget biologiske termer er angivet

For yderligere at validere diagnostiske karakter af de 2714 CpG’er, vi evalueret deres overlapning med de 520 CpG’er diskriminerer efter behandling prøver med og uden aktiv kræft i æggestokkene (FDR 0,05, data ikke vist). Dette gav et overlap på 355 CpG’er (Fisher test

P

2 × 10

-16), bekræfter, at i virkeligheden det samme kræft diagnostiske DNA methylering signatur kunne have været udledt i indstillingen efterbehandlingen ved hjælp CA125 niveauer som markører for tumor tilstedeværelse.

Biologisk betydningen af ​​dNAM signaturer

for at undersøge potentialet funktionelle betydning af CA-CpG sæt vi spurgte om der var specifik berigelse af biologiske vilkår og veje, herunder en stor database af funktionelle genekspression signaturer [22]. For nylig viste vi, at aldring også har en betydelig indvirkning på den dNAM mønster af perifert blod og identificeret 589 CpG’er signifikant forbundet med alderen (FDR 0,05) [16]. For således at dissekere roller alder og kræft udførte vi gensæt Enrichment Analysis (GSEA) [22] på CpG’er entydigt forbundet med alder og cancer, samt på de 198 CpG’er (190 unikke gen loci) fælles for alder og CA-CpG lister (figur 2b, tabel S2). Vi bemærker, at denne overlapning var stærkt signifikant (figur 2b, Fisher test

P

2 × 10

-16), tyder på, at alder og tumor tilstedeværelse fremkalde fælles ændringer i dNAM mønster af perifert blod. GSEA afslørede funktionelle foreninger (justeret

P

0,05) af fire hovedkategorier af gener (figur 2c, tabel S3): (i)

REST

-targets og udviklingsmæssige gener [23], [24] med hypermethyleret alder-CpG’er, (ii) gener involveret i hæmatopoiese og lymfoid-myeloid differentiering med hypomethylated alder og alder-CA CpG’er, (iii) gener involveret i T-celle-aktivering og naturlig-killer (NK) medieret cytotoksicitet med hypermethyleret cancer-specifikke CpG’er, og (iv) gener involveret i celle-vedhæftning og

HoxA9

regulatoriske programmer med hypomethylated kræft-specifikke CpG’er.

for at forstå disse funktionelle associationer vi hypotese, at nogle af disse kan afspejle variationer i blodet celletype sammensætning, da dette er kendt for at variere med både alder og tumor tilstedeværelse [25] – [29]. For at undersøge dette nærmere, spurgte vi, hvis gener er kendt for at være udtrykt forskelligt mellem vigtigste blod celletyper [30] blev overrepræsenteret i alder og CA-CpG lister. Adskillige signifikante sammenhænge blev fundet, som var mere udtalt for kræft end alder-associerede signaturer (tabel 1). Konkret blandt CpG’er hypomethylated i kræfttilfælde, var der berigelse af gener vides at være opreguleret i granulocytter (

P

= 2 × 10

-5, tabel 1), mens CpG’er hypermethyleret i kræft blev beriget for gener vides at være opreguleret i T-celle-lymfocytter (CD4 +

P

= 0,002, CD8 +

P

= 0,01, tabel 1, tabel S4), i overensstemmelse med rapporter om en højere granulocyt /lymfocyt-forhold i blodet af kræfttilfælde sammenlignet med raske kontroller [26], [29]. For at teste dette yderligere vi sammenlignet methylering niveauer af dem CpG’er kortlægning til gener opreguleret i granulocytter og lmphocytes mellem raske kontrolpersoner og efter behandling sager med og uden aktiv sygdom (som bestemt af CA125-niveauer) (Figur S4). Som forventet blev gener opreguleret i granulocytter betydeligt hypomethylated i efter behandling sager med positive CA125 niveauer i forhold til kontrol, mens dette ikke var så for efter behandling tilfælde uden aktiv sygdom (Figur S4). Tilsvarende gener opreguleret i lmphocytes var signifikant hypermethyleret i efter behandling sager med positive CA125 niveauer i forhold til kontrol, mens der ikke var nogen forskel, når man sammenligner post-treatmant sager uden aktiv sygdom til kontrol (Figur S4).

Alder -afhængig dNAM Signature Forudsiger Tumor Presence

den stærke overlapning mellem alder og kræft forbundet CpG’er og den funktionelle berigelse af gener involveret i myeloid-lymfoide differentiering angivet for os, at alder og kræft forårsage de samme ændringer i dNAM mønstre af uafhængigt fremkalde samme underliggende ændringer i blodets celletype sammensætning. Vi hypotese derfor, kan forværres aldersspecifikke dNAM ændringer hos patienter med kræft i æggestokkene. For at teste dette, vi først beregnet gennemsnitlige methylering niveauer i CpG’er gennemgå den særlige hyper eller hypometylering med alderen. Disse mønstre viste de forventede korrelationer med alderen hos raske kontroller og kræft forbehandling sager (figur 3a, C, E, g Figur S5). Men vi også observeret, at de gennemsnitlige methylering værdier var signifikant forskellig mellem forbehandling sager og kontroller, med lavere gennemsnitlig methylering i tilfælde versus kontrol for alder hypomethylated niCpGs (figur 3b, Wilcox test

P

= 1 × 10

-13) og iCpGs (figur 3f,

P

= 1 × 10

-11), og tilsvarende højere gennemsnitlige methylering niveau i tilfælde sammenlignet med kontroller for niCpGs hypermethyleret med alderen (figur 3d,

P

= 3 × 10

-16). Vigtigt er det, disse foreninger med sygdomsstatus var uafhængige af aldersgruppe for de hypomethylated niCpGs og iCpGs (figur 3a, e). For hypermethyleret alder CpG’er, observerede vi et tilsvarende mønster af hypermethylering i kræft i alle aldersgrupper for niCpGs (figur 3c), men ikke så for iCpGs (figur 3g, h).

Gennemsnitlige methylering mønstre af alders- associerede CpG’er udvalgt gennem overvåget analyse. (A-b) alder hypomethylated niCpGs. (C-d) alder hypermethyleret niCpGs. (E-f) alder hypomethylated iCpGs. (G-h) alder hypermethyleret iCpGs. (A, c, e, g) Gennemsnitlig methylering (y-aksen) af kontroller (grøn) og sager (blå) for hver af de seks aldersgrupper (x-akse) (50-55,55-60,60-65 , 65-70,70-75, 75). (B, d, f, h) Gennemsnitlig methylering versus sygdomsstatus (alle aldersgrupper tilsammen). Alle P-værdier er fra et to-halet Wilcoxon rank sum test. I alle paneler, giver vi de antal prøver i hver gruppe over den tilsvarende boxplot. Sager er forbehandlingsanlæg prøver.

For yderligere at demonstrere, at aldersrelaterede dNAM mønstre blev uafhængigt associeret med tumor tilstedeværelse, spurgte vi, om alder forbundet CpG’er afledt af 148 raske kontrolpersoner (293 CpG’er med FDR 0,3) [16] var i stand til at skelne prøver efter sygdomsstatus (figur 4a). Unsupervised hierarkisk klyngedannelse over 293 CpG’er udskilt sager fra kontroller (figur 4b, Fisher test

P

= 4 × 10

-13). Samme alder-CpG’er var også i stand til at skelne tilfælde med tilbagevendende aktiv sygdom fra dem uden (som målt ved serum CA125 niveauer på prøve uafgjort) i et uafhængigt sæt af blodprøver fra 122 sager efter behandling (figur 4c, Fisher test

P

= 3 × 10

-5). For yderligere at etablere betydning af disse fund, i ingen af ​​1000 tilfældige valg af 293 CpG’er gjorde vi observerer P-værdier så ekstreme som disse (figur 4d).

a) Multivariate lineær regression af alder i 148 raske blod prøver mod CpG methylering profiler justering for BSC effektivitet, batch og DNA input effekter, identificeret 293 CpG’er ved q (FDR) 0,3. b) Hierarkisk klyngedannelse af de 148 raske kontrolpersoner og 113 forbehandling (Pret) tilfælde over 293 CpG’er. De to vigtigste klynger (CLUST) forudsagt af algoritmen er mærket som blå og orange. Case-kontrol status er angivet som aktiv sygdom (AD): case = sort, kontrol = grå. c) Hierarkisk klyngedannelse af 117 sager efter behandlingen end samme 293 CpG’er. Af de 117 sager efter behandling, 47 og 70 havde tilbagevendende (sort) og ingen tilbagevendende (grå) aktiv sygdom (AD) på prøve uafgjort hhv. De to vigtigste klynger (CLUST) forudsagt af algoritmen er mærket som blå og orange. I heatmaps blev CpG specifik methylering p-værdier standardiseret til nul middelværdi og enhed varians for klarhedens skyld (blå: høj relativ methylering, gul = lav relativ methylering). I paneler b) og c), giver vi antallet af prøver med aktiv sygdom ved prøve draw i hver klynge, og opnåelse af det tilsvarende Fishers eksakte test p-værdi. d) Sammenligning af observerede P-værdier med dem, der opnås med 1000 tilfældige valg af 293 CpG’er. P-værdier blev beregnet ud fra Fishers eksakte test for de to klynger udledes fra at anvende en Gaussisk blanding model [43].

Kræft-Disposition CpG’er

Det er sandsynligt, at et lille antal af de 2714 CA-CpG’er er bona-fide kræft-disposition markører. Vi antager, at nogle af disse risikomarkører måske spores fra 70 efter behandling perifere blodprøver fra patienter, der ikke har tilbagevendende sygdom på tidspunktet for prøven draw, men som i sidste ende kunne udvikle tilbagevendende sygdom, da sådanne prøver kunne efterligne præ- klinisk prædisposition fase. For at bestemme strengt, om en sådan risiko CpG signatur eksisterer, vi anvendte en state-of-the-art surrogat Variabel Analysis (SVA) [31], [32] rammer, hvilke modeller skjult og potentielt forstyrrende faktorer for at få et mere præcist estimat for FDR (materialer og metoder). Brug SVA vi opnåede 84 CpG’er passerer en FDR tærskel på 0,4, hvilket tyder på, at i gennemsnit omkring 50 CpG’er kan være diskriminerende mellem efter behandling prøver uden aktiv sygdom (CA125 serumniveauer 30) og raske kontroller (figur S6A, tabel S5). Da det er muligt, at nogle af disse afspejler methylering ændringer som følge af behandling, og da en risiko CpG bør også være diagnostisk, vi deconvoluted virkningen af ​​behandling ved at finde overlapningen mellem 84 CpG’er og 2714 CA-CpG’er (upåvirket af behandling), der gav et overlap på 18 “kræft-disposition” risiko CpG’er (Fisher test P = 0,003, figur S6B, tabel S5). Af interesse, denne liste omfattede

TSG101

, et gen med formodede tumor suppressor roller og en kandidat brystkræft disposition gen [33].

Diskussion

Her har vi udført første store (over 300 prøver) genom-dækkende undersøgelse af dNAM profiler ved hjælp af en state-of-the art platform, der måler methylering tilstand af mere end 27.000 CpG’er. Vi har vist, at kræft i æggestokkene har en betydelig indvirkning på dNAM mønster af perifere blodceller. Mens den epigenetiske signatur vi har præsenteret endnu mangler den høje specificitet er nødvendig for en øjeblikkelig diagnostisk anvendelse, det faktum, at aktive ovariecancer kunne forudsiges med en relativ høj nøjagtighed (AUC = 0,8) fra en dNAM profil i blodet viser klart det fremtidige potentiale for epigenetisk profilering som et diagnostisk værktøj.

Derudover har vi fremlagt beviser for eksistensen af ​​dNAM markører, der kan tjene som tidlig påvisning eller disposition markører for kræft i æggestokkene. Af de 18 kandidatlande risikomarkører, 11 og 7 viste hyper og hypometylering i kræft, henholdsvis med

TSG101

præ-mRNA splejsning faktor

SFRS6

både gennemgår hypermethylering i kræft. Yderligere bekræftelse af, at markørerne identificeret her, kan tjene som tidlig påvisning eller disposition markører for kræft i æggestokkene vil kræve en stor prospektiv undersøgelse, som i øjeblikket er i gang [34].

De observerede dNAM mønstre kan sammenfattes i form af to biologisk adskilte signaturer. Først, den iagttagelse, at en dNAM signatur for ældning, kendetegnet ved differentiel methylering af gener med hæmatopoietisk celle afstamning og immunsystemet funktioner forværres i nærvær af ovariecancer, tyder på, at en epiteltumor og aldring fremkalde almindelige ændringer i den cellulære sammensætning af perifer blod. Denne fortolkning understøttes yderligere af det forhold, at de samme biologiske betingelser var stærkt beriget blandt gener udtrykkes differentielt mellem blod celletyper [30] (Tabel S6), og at generne almindeligvis opreguleret i granulocytter og lymfocytter viste en differentiel methylering mønster (tabel 1, Figur S4) i overensstemmelse med en øget granulocyt til lymfocyt-forholdet som reaktion på ældning eller kræft. Det er væsentligt, at der er uafhængig dokumentation for, at både aldring og kræft tilstedeværelse føre til en myeloid-skævvridning i myeloide /lymfoide differentiering program, med en tilsvarende højere granulocyt /lymfocyt-forhold [25] – [29], et mønster i overensstemmelse med vores observation at granulocyt- og T-lymfocyt specifikke gener blev beriget blandt CpG’er hypo-og hypermethyleret i kræft, hhv. Da denne effekt blev udledes dNAM profiler, ser det ud til, at ekspressionen af ​​et betydeligt antal gener der kendetegner bood celletyper er under direkte epigenetisk regulering.

Et andet beslægtet spørgsmål er, om det diagnostiske epigenetiske signatur er specifik for æggestokkene kræft. Hvis forskellige kræftformer fremkalder lignende immunrespons og dermed lignende ændringer i blod celletype præparat, kunne vi forvente en andel af det identificerede diagnostisk signatur at være ikke-cancer specifik. Men endegyldigt at fastslå, at dette er tilfældet, og at alder og kræft er ikke mediere immun-kompromittere effekter via epigenetisk modifikation af bestemte celletyper, kræver yderligere data ikke leveres af vores undersøgelse. Ligeledes om dele af de observerede kræft underskrifter kan kausalt involveret i sygdommen må afvente yderligere undersøgelser.

En anden dNAM signatur var præget af CpG’er gennemgår hypermethylering med alderen og var stærkt beriget for udviklingsmæssige gener og

REST

-targets. I betragtning af at

REST Hotel (

NRSF

) er involveret i undertrykkelse af gener, der er nødvendige for differentiering af embryonale og voksne stamceller [24], alder-inducerede hypermethylering af

REST

-targets, hvis bekræftet i en stamcelle population, kan repræsentere en generisk mekanisme til aldersrelateret deraf følgende tab af stamcelle funktion og øget disposition til kræft [5].

Endelig vores konklusion om, at de fleste af methylering variabilitet er forbundet med niCpGs støtter yderligere den opfattelse, at de fleste af de fænotypisk relevante dNAM variation findes i andre end CpG-øer [19] regioner. Bekræftelse dette yderligere, den observerede sammenhæng mellem genekspression af forskellige blod celletyper og mønstret af DNA hypo og hypermethylering var meget stærkere for niCpGs end iCpGs (data ikke vist).

Sammenfattende dette arbejde viser, at dNAM profilering i blod besidder betydelig lovende som en fremtidig diagnostisk eller risiko-forudsigelse værktøj og garanterer yderligere videregående studier CpG-dækning til fuldt ud at belyse denne rolle.

Materialer og metoder

beskrivelse af UKOPS Sample Collection

i alt 540 fuldblodsprøver blev trukket fra UK kræft i æggestokkene Population Study (UKOPS) til at indgå i denne undersøgelse. Tilfælde (n = 266) bestod af postmenopausale kvinder diagnosticeret med primær epitelial ovariecancer. Halvdelen af ​​tilfældene (forbehandling sager n = 131) gav deres blod på tidspunktet for deres diagnose før behandling og den anden halvdel (efter behandling sager n = 135) gav deres blod på et tidspunkt i løbet af deres opfølgning besøg efter primær behandling (2,4 ± 2,7 år mellem diagnose og blodprøve taget). Controls (n = 274) var tilsyneladende raske postmenopausale kvinder rekrutteret fra UK Collaborative Trial af kræft i æggestokkene Screening (UKCTOCS) [34], for hvilke årlige serumprøver er tilgængelige. Rekruttering fandt sted på 8 deltagende hospitaler i Storbritannien. Kvinder med en tidligere historie af den bilaterale ooforektomi og /eller kræft, blev udelukket fra undersøgelsen. Alle sager og raske kontrolpersoner blev postmenopausale og alderskategori og detaljerede kliniske karakteristika er angivet i tabel S1.

prøve behandling

Blodprøver blev indsamlet af undersøgelsen sygeplejerske på regionale centre i rør ( 9 ml K3 EDTA VACUETTE rør, fremstillet af Greiner Bio One) og blev frosset inden for 3 timer efter opsamling. Prøverne blev opbevaret ved -80 °

C dele på det regionale center og blev sendt til det centrale laboratorium på UCL på kvartalsbasis. Efter modtagelsen i den centrale laboratorium blev prøverne logget og overført til -80 °

C

fryser indtil DNA’et blev ekstraheret. Serum CA125-koncentrationer blev bestemt ved elektro-sandwich immunoassay på Elecsys 2010 (Roche Diagnostics, Burgess Hill, UK) ved hjælp af to monoklonale antistoffer (OC125 og M11, Fujirebio Diagnostics AB, Göteborg, Sverige), og værdier 30 blev taget som en markør af aktiv sygdom [35]. Over 95% af forbehandling sager havde CA125 30, mens der blandt efter behandling sager omkring 40% havde aktiv tilbagevendende sygdom (CA125 30).

DNA Udvinding og Bisulfit Ændring

DNA blev ekstraheret ved Tepnel, anvendelse af en chloroform baseret ekstraktionsmetode og 800 ng (2 × 400 for hver prøve). Gennemsnitlig DNA-koncentration var 33,0 ± 17,4 ng /pl. DNA fra hver prøve var bisulfit ændres ved hjælp af EZ DNA-methylering Kit D5008 (Zymo Research, Orange, CA, USA) ifølge producentens anvisninger.

Illumina Infinium Assay

Methyleringsanalyse blev udført ved anvendelse den Illumina Infinium menneskelige Methylation27 BeadChip. Kort fortalt bisulfit omdannet DNA blev opformeret, fragmenteret og hybridiseret til BeadChip arrays (hver chip plads til 12 prøver, som er udpeget af Sentrix positionerer A-L).