PLoS ONE: Gatifloxacin inducerer S og G2-fase cellecyklusstop i bugspytkirtelkræftceller via p21 /p27 /p53

Abstrakt

Kræft i bugspytkirtlen, trods den mest forfærdelige blandt gastrointestinale kræftformer, er dårligt diagnosticeret, og yderligere, er situationen blevet forværret på grund af erhvervet resistens mod den enkelte kendte medicinsk behandling. Mens tidligere undersøgelser har fremhævet de væksthæmmende effekter af ældre generation fluoroquinoloner, den aktuelle undersøgelse har til formål at evaluere de væksthæmmende effekter af nyere generation fluoroquinolon, Gatifloxacin, om bugspytkirtelkræft cellelinjer MIA PaCa-2 og Panc-1 samt at belyse underliggende molekylære mekanismer. Heri rapporterer vi, at Gatifloxacin undertrykker proliferation af MIA PaCa-2 og Panc-1-celler ved at forårsage S og G

2-fase cellecyklusstandsning uden induktion af apoptose. Blokade i S-fasen af ​​cellens cyklus blev associeret med forøget TGF-β1-ekspression og translokation af Smad3-4 kompleks til kernen med efterfølgende aktivering af p21 i MIA Paca-2-celler, hvorimod TGF-β signalering svækkede Panc-1-celler viste S-fasen ved direkte aktivering af p27. Men Gatifloxacin medieret G,

2-fase-cellecyklusstandsnings blev fundet at være p53 afhængige i begge cellelinier. Vores undersøgelse er af interesse, fordi fluoroquinoloner har evnen til at trænge pancreasvæv som kan være meget effektive i bekæmpelsen pancreascancer, der normalt er forbundet med tab eller nedregulering af CDK-inhibitorer p21 /p27 samt mutations-inaktivering af p53. Derudover Gatifloxacin viste sig også at virke synergistisk effekt af gemcitabin, den eneste kendte lægemiddel mod kræft i bugspytkirtlen, såvel som den bredspektrede anticancerlægemiddel cisplatin. Tilsammen vores resultater tyder på, at Gatifloxacin besidder anticancer aktiviteter mod kræft i bugspytkirtlen og er en lovende kandidat til at blive omplaceret fra bredspektrede antibiotika til anticancermiddel

Henvisning:. Yadav V, Sultana S, Yadav J, Saini N (2012 ) Gatifloxacin inducerer S og G

2-Phase cellecyklusstop i bugspytkirtelkræftceller via p21 /p27 /p53. PLoS ONE 7 (10): e47796. doi: 10,1371 /journal.pone.0047796

Redaktør: Guenter Schneider, Technische Universität München, Tyskland

Modtaget: May 3, 2012; Accepteret: September 17, 2012; Udgivet: 25 oktober, 2012 |

Copyright: © 2012 Yadav et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud (NWP-13 og EXP0011) fra Rådet for videnskabelig og industriel forskning (CSIR), Indien. VY blev støttet med Senior Research Fellowship fra CSIR. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen, den maligne neoplasma i bugspytkirtlen er i øjeblikket den femte mest almindelige årsag til kræft død [1]. Trods forbedringer i diagnose, prognose stadig dårlig på grund af forsinket symptom præsentation, aggressiv tumor vækst og dyb desmoplastiske reaktion [2]; [3]. Det 5-års overlevelse er ca. 15-20%, efter bugspytkirtlen resektion i tilfælde af bugspytkirtelkræft [4]. Bortset fra kirurgi, er adjuverende kemoterapi med gemcitabin og erlotinib vist sig at forbedre prognosen i resektable tilfælde pancreas cancer [5]. Så der er en stigning i overlevelsesraten med konventionel cytotoksisk kemoterapi sammenlignet med kirurgi [6], men der stadig er behov for at udvikle eller identificere den potentielle anticancer lægemiddel med øget selektivitet og reduceret toksicitet.

I de senere år ældre generation fluoroquinoloner såsom Moxifloxacin og Ciprofloxacin besidder bredspektret antibiotikum aktivitet, har vist væksthæmmende effekter ved at inducere apoptose og standsning af cellecyklus i forskellige cancercellelinier [7] – [10]. Disse nonantimicrobial aktiviteter har gjort dem unikke blandt andre bredspektrede antibiotika. Gatifloxacin eller 8-methoxy fluorquinoloner er den nyere (fjerde) generation fluorquinolon som udviser samme antibiotiske virkninger ved at målrette bakteriel DNA-gyrase og topoisomerase [11] – [13], og er også en potent lægemiddel i flere stærkt smitsomme sygdomme såsom, seksuelt overførte sygdomme, Toxoplasmose og Tularæmi [14] – [16]. Ligesom andre fluorquinolon familiemedlemmer er det også kendt at have visse immunmodulerende virkninger

in vitro

i forskellige cellelinier såvel som det er under kliniske forsøg til behandling af lungetuberkulose [17]; [18]. Have så meget lignende konsekvenser med andre fluoroquinoloner familiemedlemmer, ikke er blevet indberettet væksthæmmende aktivitet mod cancer cellelinjer for Gatifloxacin. Endvidere er pancreasvæv gennemtrængende effektivitet meget godt beskrevet [19] i tilfælde af fluorquinoloner som fristet os at udforske den mekanisme, hvormed Gatifloxacin undertrykker pankreatisk vækst kræftcelle. I denne undersøgelse undersøgte vi virkningen af ​​Gatifloxacin på overlevelse og proliferation af pancreas cancer cellelinjer (MIA PaCa-2 og Panc-1) og fandt, at Gatifloxacin var i stand til at undertrykke proliferation af begge cellelinier, med MIA PaCa-2 er mere følsom end Panc-1. Den differentielle resultat kan skyldes forskel i funktionelle TGF-p-receptorer i de to cellelinier med MIA PaCa-2 er følsomme over for TGF-β1 og Panc-1 er resistent da de mangler funktionel TGF-β type I receptoren [20]. Vi fandt, at Gatifloxacin anholdelser celler i G

2-fase via inaktivering af cdc2-cyclinB1 kompleks ved phosphorylering af cdc2 på Tyr15 gennem p53 aktivering. Endvidere viser vi, at Gatifloxacin kan inducere p21 og P27 niveauer i MIA PaCa-2 og Panc-1-celler henholdsvis hvorved S-fasen. Vi viste endvidere, at Gatifloxacin var i stand til synergi den antiproliferative aktivitet af gemcitabin og cisplatin i begge cellelinier.

Resultater

Gatifloxacin hæmmer proliferationen af ​​pancreas carcinomceller

In vitro

for at vurdere anti-proliferative effekt af Gatifloxacin, vi brugte MIA PaCa-2 og Panc-1 pancreas carcinom cellelinjer. Vi studerede først virkningen af ​​forskellige doser (0-400 pg /ml) af Gatifloxacin på levedygtigheden af ​​MIA PaCa-2 og Panc-1-celler i 24 timer og 48 timer under anvendelse af MTT-assayet. Som vist i figur 1, GFX behandling resulterede i tid og dosis-afhængigt fald i celleproliferation i MIA PaCa-2 og Panc-1-celler end på forskellige niveauer. Gatifloxacin behandling resulterede i 15-46% (p = 0,002) fald i cellelevedygtighed i MIA PaCa-2 og 1-43% (p = 0,007) fald i cellelevedygtighed i Panc-1-celler efter 24 timer (fig 1A i) . Vi observerede 19-73% (p = 0,0016) fald i cellelevedygtighed i MIA PaCa-2 og 11-72% (p = 0,00016) fald i cellelevedygtighed i Panc-1-celler efter 48 timer (fig 1A ii). Ovenstående data viser tydeligt MIA PaCa-2 til at være mere følsomme over for Gatifloxacin end Panc-1 ved alle doser. Et slående observation fra disse data var faldet i levedygtighed, er mere udtalt ved højere doser (100, 200 og 400 ug /ml) af Gatifloxacin behandling efter 24 timer og 48 timer behandling i begge cellelinier og dermed vi tog disse koncentrationer og tid punkter for at udføre yderligere eksperimenter.

MTT-assay af MIA PaCa-2 og Panc-1-celler efter behandling med Gatifloxacin (0-400 pg /ml) i 24 timer (AI) og 48 timer (All). Celler blev podet i 96 brønds plader (1 × 10

4 celler /brønd), der fik lov til at adhærere natten og blev efterfølgende behandlet med stigende koncentration af Gatifloxacin i 24 og 48 timer. Lodrette akse repræsenterer% proliferationshastighed henviser horisontale akse repræsenterer stigende koncentration af Gatifloxacin i ug /ml. Dataene er middelværdier ± SEM tre uafhængige forsøg udført in triplo. * P 0,01 sammenlignet med vehikelkontrol. (B) Annexin V-PE bindende i MIA PaCa-2 (i-v) og Panc-1 (VI-x) efter behandling med Gatifloxacin i 48 timer som vurderet af 7-AAD og AnnexinV farvning. (I) og (vi) Hjælpestof-behandlede kontrolceller, (II) og (VII) celler behandlet med 100 ug /ml, (iii) og (viii) celler behandlet med 200 ug /ml, (iv) og (ix) celler behandlet med 400 ug /ml Gatifloxacin. (V) MIA PaCa-2-celler og (x) Panc-1-celler behandlet med curcumin 60 uM i 24 timer som positiv kontrol. Lodrette akse repræsenterer 7-AAD positive celler henviser vandrette akse repræsenterer Annexin V-PE positive celler. Repræsenterer tre uafhængige forsøg er blevet vist med lignende resultater. (C) Western blot-analyse af ekspressionen af ​​Bax-proteinet under indvirkning af Gatifloxacin i et tidsrum (24, 48 h) og dosis (0, 100, 200, 400 ug /ml) afhængig måde. p-actin blev anvendt som en loading kontrol. (D) Caspase 3, 8, 9-aktivitet af MIA PaCa-2 og Panc-1-celler behandlet med Gatifloxacin i tid (24, 48 h) og dosis (0, 100, 200, 400 ug /ml) afhængig måde. Bar graf repræsenterer gennemsnit ± SEM fra tre uafhængige forsøg

Gatifloxacin inducerer cellecyklusstop på S og G

2 -. Fase i bugspytkirtlen carcinomceller uden induktion af apoptose

Vi Derefter undersøgte, om Gatifloxacin-medieret fald i levedygtighed MIA PaCa-2 og Panc-1-celler er på grund af apoptose /nekrose. Vi først kontrolleret for induktion af apoptose ved annexin assay. Som vist i figur 1B fandt vi ikke nogen væsentlige ændringer i apoptotisk /nekrotisk befolkning på alle doser af Gatifloxacin sammenlignet med vehikelbehandlede celler i begge cellelinier på 24 timer samt ved 48 h hhv. For yderligere at indlægget validere vores annexin data, vi næste kontrolleret ekspressionsniveauet af proapoptotiske protein Bax ved Western blotting og aktivitet af caspase -3, -8 og -9 i en dosis og tid afhængig måde under påvirkning af Gatifloxacin. Vi fandt ikke nogen væsentlig ændring hverken i Bax proteinniveau (figur 1C) eller caspase -3, -8 og -9 aktivitet (figur 1D), hvilket viser, at Gatifloxacin ikke hindrer levedygtigheden af ​​celler. Resultater af Annexin V og caspase-aktivitet blev også valideret med en positiv kontrol, curcumin (60 uM i 24 timer).

Vi næste

målt på

cellecyklus

status MIA PaCa-2 og Panc-1 celler i tilstedeværelse af 100, 200, 400 ug /ml Gatifloxacin på 24 og 48 timer (figur 2 ). Cellecyklusfordeling analyse viste, at Gatifloxacin hæmmer cellecyklusprogression ved at arrestere cellerne i S og G

2-fase i begge cellelinier. I MIA PaCa-2-celler, stigning i procentdelen af ​​celler i S-fase var fra 9 ± 1,1% (vehikelbehandlede celler) til 21 ± 2,1% (400 ug /ml), med ledsagende fald i procentdelen af ​​celler i G

2 fase fra køretøj behandlet 31 ± 2,1% til 18 ± 2,7% (400 mg /ml) og ingen ændring i procentdelen af ​​celler i G

1 fase blev observeret i celler udsat indtil 24 timer. Men ved 48 timer, cellerne begyndte at akkumulere i G

2 fase fra 24 ± 3% (bærerbehandlede) til 67 ± 2,5% ved 200 ug /ml Gatifloxacin og dette blev reduceret til 40 ± 2% ved 400 ug /ml af Gatifloxacin (Figur 2i og øverste panel). I Panc-1 celler begyndte at akkumulere i S-fase fra 8 ± 1% (bærerbehandlede) til 14 ± 1,5% (400 ug /ml), men i modsætning til MIA PaCa-2, begyndte cellerne at akkumulere i G

2- fase fra 24 timer og fremefter fra 29 ± 1% (køretøj behandlet) til 56 ± 3% og var begrænset tilbage til 32 ± 1,05% ved 400 mg /ml (Figur 2ii og øverste panel). Ingen stigning i SubG1 top blev observeret i både cellelinier. Tilsammen vores data tyder på, at Gatifloxacin ikke inducere apoptose, men forårsager en anholdelse af celler i S og G

2-fase i pancreas carcinomceller.

Effekter af Gatifloxacin på cellecyklus blev undersøgt ved hjælp af PI ( propidiumiodid) farvning. Celler blev behandlet med (0-400 pg /ml) Gatifloxacin i 24 og 48 timer, opsamlet og farvet med PI. Her Pink peak repræsenterer G

1-fase, Grøn peak repræsenterer S-fasen og Blue peak repræsenterer G

2-fase henholdsvis. Øvre panel viser repræsentative for tre uafhængige forsøg med lignende resultater og nedre panel repræsenterer bar diagram af celler i forskellige faser. Søjlediagram repræsenterer middelværdi ± SEM fra tre uafhængige forsøg. (I) repræsentant søjlediagram for MIA PaCa-2, (ii) repræsentant søjlediagram for Panc-1.

Gatifloxacin forårsager Aktivering af TGF-β1 /SMAD Complex /p21 i MIA PaCa-2 og aktivering af p27 i Panc-1

Nylige undersøgelser har vist, at en af ​​fluorquinolon, ciprofloxacin undertrykker coloncancer celleproliferation ved at arrestere dem i S-fase gennem TGF-β1 og TGF-β1 er også meget velkendt for årsag cellecyklus arrest i bugspytkirtelkræftceller [21]; [22]. Til

undersøge

hvorvidt Gatifloxacin-

induceret

S-fasen anholdelse var

TGF

-β

afhængig

vi kontrolleret niveauerne af TGF-β1 på transkriptionelle samt translationelle niveau. Vi fandt Gatifloxacin behandling (100, 200, 400 ug /ml) for at forbedre TGF-β1-ekspression på dosisafhængig måde ved 1,5-2 fold (p 0,01) på det transskriptionelle niveau og 1,3-2 gange (p 0,01) ved translationel niveau efter 48 h i MIA PaCa-2 celle, men ikke i Panc-1 celler (Figur 3AI, 3BI). Da vi

fandt signifikant stigning i

TGF-β1 ekspressionsniveau ved 400 ug /ml, gjorde vi tidsforløbet undersøgelse og bemærkede, at TGF-β1 begyndte stigende transkriptionelt inden for 4 timer (p = 0,023) af behandlingen og nået maksimum af 12 timer (p 0,01) og derefter nåede et plateau på 16 timer (Figur 3Aii). Men translationelt, bliver TGF-β1 aktiveres inden for 8 h (p = 0,039) og kun nået til sin maksimale udtryk ved 16 timer (p 0,01) (Figur 3Bii), som vurderet ved real time PCR og western blotting. Der er stigende tegn på, at Smad transkriptionsfaktorer medierer vækstinhiberende virkning af transformerende vækstfaktor-β1 (TGF-β1) i mange celletyper [23]. For at undersøge det relative bidrag af individuelle Smad proteiner til TGF-β1 signalering, blev protein ekspression af Smad2 og Smad3 analyseret ved western blotting af celleekstrakter efter 48 timers Gatifloxacin behandling (100, 200, 400 ug /ml) i MIA PaCa-2 celler. Som vist i figur 3CI observerede vi signifikant stigning i phospho-Smad3 (

pSmad3 ved Ser 423

), mens der ikke var nogen ændring i niveauet af

phospho

–

Smad2

(

pSmad2 ved Ser 467

) efter 48 timer af Gatifloxacin behandling ved alle doser i MIA PaCa-2 celler. Endvidere forbedres i phospho-

Smad3

(

pSmad3

) viste sig at være på en dosisafhængig måde (1,3-2,4 fold, p = 0,0127) sammenlignet med vehikel-behandlede celler. Nok beviser er der for at støtte, at aktiveret Smad2 eller Smad3 dimeriserer med Smad4 og translokerer til kernen, hvorved den aktiverede komplekser associeret med Smad-bindende element (SBEs) i initiativtagere til mange gener, der fører til deres induktion [24] – [26]. p21

WAF1 /Cip1 er et sådant gen, som vides at være involveret i TGF-β1 medieret regulering af celleproliferation [27]. For at bestemme om Smad3 translokeres som reaktion på TGF-β1 stimulation i MIA Paca-2-celler, vurderede vi den subcellulære fordeling af Smad3 /4 og som forventet blev der observeret signifikant fald i Smad-3 og Smad-4-protein-ekspression i cytosolisk fraktion og der var ledsagende stigning i Smad-3 og Smad-4-protein ekspression i nukleare fraktion i Gatifloxacin behandlet MIA PaCa-2-celler i en dosis og tidsafhængig måde (figur 3Cii). Samtidig analyserede vi også ekspressionen af ​​p21

WAF1 /Cip1, downstream effektor af TGF-β1, der er kendt for at være en afgørende regulator af cellecyklusprogression. Ligesom p21, p27 er en cyclin-afhængig kinase inhibitor, der regulerer G

1-S-fasen af ​​cellecyklusprogression, dermed kontrolleres vi ekspressionen af ​​p21 og p27 ved western blot-analyse [28]. Vi observerede signifikant stigning (1,4-1,7 fold, p = 0,038) i niveauerne af p21 og markant fald (0,57-0,35 fold, p = 0,012) i niveauerne af p27 på en dosisafhængig måde efter 48 timers Gatifloxacin behandling sammenlignet til køretøjer behandlede celler (figur 4Ai). Interessant stigning i p21 sås først efter TGF-β1 aktivering dvs. efter 12 timer (p = 0,035), i MIA PaCa-2-celler (Figur 4Aii). Men i tilfælde af Panc-1 celler, der mangler funktionel TGF-β1 vi ikke finde aktivering af p21, men vi finder aktiveringen af ​​P27. Vi observerede signifikant stigning (1,8-2,3 fold, p = 0,021) i niveauerne af p27 på en dosisafhængig måde efter 48 timer af Gatifloxacin behandling sammenlignet med vehikel-behandlede celler (fig 4Ai). Samtidig vi kontrolleres også niveauerne af Skp2 der formidler ubiquitinering og nedbrydning af p27 /p21 i både cellelinierne MIA Paca-2 og Panc-1 som respons på Gatifloxacin behandling (0, 100, 200 og 400 ug /ml) [29] . Vi fandt signifikant stigning (2,7-4,3 fold, p = .008 i MIA PaCa-2-celler og 4,3-6,3 fold p = 0,005 i Panc-1) i Skp2 niveauer i både cellelinier. Som forventet fandt vi invers korrelation mellem Skp2 og p27 /p21 (figur 4Ai). Tilsammen denne undersøgelse viser, at TGF-β1 /Smad3 /p21, er en af ​​de veje, der fører til S-fasen i MIA PaCa-2-celler og p27 spiller afgørende rolle i S-fasen af ​​Panc-1-celler.

(a) (i) Real Time PCR-analyse af TGF-β1-ekspression i MIA Paca-2 og Panc-1-celler behandlet med Gatifloxacin på en dosisafhængig måde, (ii) Real Time PCR-analyse af TGF-β1-ekspression i MIA PaCa-2-celler behandlet med 400 ug /ml Gatifloxacin på en tidsafhængig måde. 18S rRNA blev anvendt til at normalisere resultaterne. (B) Western blot-analyse af TGF-β1-ekspression i MIA PaCa-2 og Panc-1-celler behandlet med Gatifloxacin på en dosisafhængig måde (i) Western blot-analyse af TGF-β1-ekspression i MIA Paca-2-celler behandlet med 400 ug /ml Gatifloxacin på en tidsafhængig måde (ii). Data er repræsentative for typisk forsøg gentaget tre gange med lignende resultater. Søjlediagram repræsenterer middelværdien ± SEM. (C) (i) Virkning af Gatifloxacin på receptormedierede Smads (pSmad-2 og pSmad-3), når de vurderes i helcellelysat i MIA PaCa-2-celler. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (Ii) translokation af Smad 3-4 kompleks fra cytoplasmaet til cellekernen under påvirkning af Gatifloxacin i en dosis (0, 100, 200, 400 ug /ml) og tidsafhængig måde (0, 6, 12, 18, 24 timer) blev bedømt ved western blotting. Nuklear og Cytoplasmatiske fraktioner blev separeret som beskrevet i afsnittet “Materiale og metoder”. Lamin B (Nuclear specifikt protein) og α-tubulin (cytoplasmatisk specifikt protein) blev anvendt som indlæsning kontroller.

(A) (i) Western blot analyse af p21, p27 og Skp2 udtryk i MIA PaCa -2 og Panc-1-celler behandlet med Gatifloxacin på en dosisafhængig måde. β-Actin blev anvendt som ladningskontrol for p21 og p27, hvorimod Lamin B blev anvendt som ladningskontrol for Skp2, (A) (ii) Western blot-analyse af p21-ekspression i MIA Paca-2-celler behandlet med 400 ug /ml Gatifloxacin på en tidsafhængig måde. Data er repræsentative for typisk forsøg gentaget tre gange med lignende resultater. Søjlediagram repræsenterer middelværdien ± SEM. * P 0,01, # p 0,05 versus kontrol. Gatifloxacin medieret S fasen er TGF-β1 afhængige i MIA PaCa-2 (B) (i) MTT-analyse af MIA PaCa-2 og Panc-1-celler i nærvær af rekombinant-TGF-β1 i 48 timer. Lodrette akse repræsenterer% proliferationshastighed henviser horisontale akse repræsenterer stigende koncentration af rekombinant-TGF-β1 i ng /ml. Dataene er middelværdier ± SEM tre uafhængige forsøg udført in triplo. * P 0,01, # p 0,05 versus kontrol. (B) (ii) Afskaffelse af S-fasen anholdelse i MIA PaCa-2 celler som vurderet ved PI (propidiumiodid) farvning. Celler transficeret med TGF-β1 siRNA (48 h) og krypterede siRNA alongwith utransficerede celler blev behandlet fra 100 pg /ml til 400 ug /ml Gatifloxacin (24 h) efter 24 timers transfektion, opsamles og farvet med PI. Venstre panel repræsenterer søjlediagrammet hvor lodrette akse repræsenterer% DNA-indholdet i S-fasen og horisontale akse repræsenterer Gatifloxacin koncentration i pg /ml. Søjlediagram repræsenterer middelværdi ± SEM fra tre uafhængige forsøg. * P 0,01, # p 0,05 versus kontrol. Højre panel viser western blot for knockdown effektivitet af TGF-β1 siRNA. (1) repræsenterer utransficerede kontrolceller, (2) TGF-β1 siRNA transficerede celler, (3) TGF-β1 siRNA transficerede celler med 400 ug /ml af Gatifloxacin, (4) siRNA transficerede celler, (5) siRNA transficerede celler med 400 ug /ml Gatifloxacin. Gatifloxacin medieret S fasen anholdelse er p21 afhængig i MIA PaCa-2 og p27 afhængige i Panc-1 celler. (C) Afskaffelse af S-fasen i MIA PaCa-2-celler transficeret med p21 siRNA (i) og Panc-1-celler transficeret med p27 siRNA (ii), henholdsvis som bedømt ved PI (propidiumiodid) farvning. Celler transficeret med p21 /p27 siRNA og krypterede siRNA (48 h) alongwith utransficerede celler blev behandlet med 100 ug /ml til 400 ug /ml af Gatifloxacin (24 h) efter 24 timers transfektion, opsamles og farvet med PI. Venstre panel repræsenterer søjlediagrammet hvor lodrette akse repræsenterer% DNA-indholdet i S-fasen og horisontale akse repræsenterer Gatifloxacin koncentration i pg /ml. Højre panel viser western blot for knockdown effektivitet p21 eller p27 siRNA. (1) repræsenterer utransficerede kontrolceller, (2) p21 /p27 siRNA transficerede celler, (3) p21 /p27 siRNA transficerede celler behandlet med 400 ug /ml Gatifloxacin, (4) scrambled siRNA transficerede celler, (5) scrambled siRNA transficerede celler behandlet med 400 ug /ml Gatifloxacin. Søjlediagram repræsenterer middelværdi ± SEM fra tre uafhængige forsøg. * P 0,01, # p. 0,05 versus kontrol

Gatifloxacin Mediated S-fasen Arrest er TGF-β1 /p21 Afhængige i MIA PaCa-2 og p27 Afhængige i Panc-1 celler

for at bekræfte rollen af ​​TGF-β1 til at undertrykke proliferation blev rekombinant TGF-β1 transficeret med varierende doser (0-100 ng /ml) i MIA PaCa-2 og Panc-1-celler i 48 timer og MTT-assay blev udført . Vi observerede, at over ekspression af TGF-β1 undertrykte signifikant MIA PaCa-2-celleproliferation på en dosisafhængig måde. Vi observerede signifikant fald (35%, p 0,05, figur 4Bi) i celleproliferation i en koncentration på 100 ng /ml i MIA PaCa-2-celler, men ikke i Panc-1-celler. Vores resultater er i overensstemmelse med resultaterne af Francisco j nicolas

et al

hvilket tyder Panc-1 til at være resistente over for TGF-β1 inducerede vækst anholdelse. Yderligere for at bekræfte den rolle, TGF-β1 i mediering af S-fasen induceret af Gatifloxacin i MIA PaCa-2, vi tavshed TGF-β1-ekspression ved hjælp siRNA og gjorde cellecyklusanalyse. Som vist i figur 4Bii, blev S-fasen helt afskaffet på alle de tre doser af Gatifloxacin anvendt i TGF-β1 siRNA transficerede celler sammenlignet med scrambled siRNA transficerede celler eller ikke-transficerede celler. Følgelig vi næste forsøgt at bestemme den rolle, p21 og p27 på S-fasen i TGF-β1 følsom MIA PaCa-2 eller resistente Panc-1-celler henholdsvis. Vi fandt, at p21 siRNA transficeret MIA PaCa-2 (figur 4CI) og p27 siRNA transficerede Panc-1-celler (figur 4Cii) kraftigt inhiberer Gatifloxacin inducerede S-fasen i forhold til krypterede siRNA på alle doser. siRNA medieret knock down af TGF-β1, p21 og p27 blev også bekræftet ved hjælp af Western blot-analyse (figur 4Bii, Ci og CII). siRNA medieret Knockdown resultater tyder på, at S-fasen anholdelsen af ​​Gatifloxacin er TGF-β1 /p21 afhængige i MIA PaCa-2 og p27 afhængige i Panc-1 celler.

Gatifloxacin Forhindrer Pakt og forårsager G

2-fase standsning i p53-afhængig måde i begge cellelinier

Forskellige undersøgelser har vist, at p53 kan aktivere ekspressionen af ​​p21, som derefter inhiberer cyclin-afhængige kinaser og fører til standsning af cellecyklus [30]. Tilsvarende Pakt har også vist sig at være en kritisk regulator af celleoverlevelse og cellecyklusprogression bortset fra negativ regulering p53 [31]. Derfor har vi næste kontrolleret ekspression af p53, total AKT og Pakt i nærvær eller fravær af forskellige doser af Gatifloxacin. Figur 5A og 5B viste aktivering af p53 ved begge transkriptionelle og translationelle niveau. Vi fandt Gatifloxacin behandling ved 100 og 200 ug /ml dosis forøger p53-ekspression med 1,4-2 gange (p 0,01) transcriptionaly og 1,8-2,45 fold (p 0,01) translationelt i MIA PaCa-2-celler og 1,75-2,5 fold (p lt ; 0,013) transcriptionaly og 1,4-2,0 fold translationelt i Panc-1 celler efter 48 h (figur 5Ai, 5Bi) sammenlignet med køretøjer behandlede celler. Vi fandt ikke nogen ændring i p53 mRNA-niveau /protein niveau i begge cellelinier ved 400 ug /ml Gatifloxacin (figur 5B). Da vi fik maksimal ekspression ved 200 ug /ml, gjorde vi tidsforløbet eksperiment ved 200 ug /ml Gatifloxacin og bemærkede, at p53-ekspression begyndte stigende i 8 timer af Gatifloxacin behandling, transcriptionaly (p = 0,032) samt translationaly (p = 0,022) i Panc-1-celler, men der blev forsinket stigning i p53-ekspression i MIA PaCa-2-celler, som udløser markant først efter 24 timer transcriptionaly (p = 0,034) samt translationaly (p = 0,048) og nåede maksimum ved 40 h (p 0,01) og videre i begge cellelinier (figur 5Aii, 5Bii). Som vist i figur 5Bi, Gatifloxacin (100, 200, 400 ug /ml) behandling forårsagede signifikant fald i Pakt (Ser 473) niveauer på en dosisafhængig måde ud fra 0.86-0.51 fold (p = 0,027) i MIA PaCa-2 og 0,89 -0,41 fold (p 0,01) i Panc-1-celler henholdsvis uden ændring af de samlede AKT niveauer. Vores tid-kursus Forsøget viste, at op til 16 timer var der ikke meget fald i p-Akt (Ser 473) niveauer, men efter 16 timer var der

signifikant

fald i Pakt niveauer (p 0,01) i MIA PaCa -2 celler. I Panc-1-celler, op til 24 timer var der ingen reduktion i Pakt niveauer og fald blev signifikant fra 32 h (p 0,01). Fremefter i overværelse af 400 ug /ml Gatifloxacin behandling (figur 5Bii)

(a) (i) Real Time PCR-analyse af p53-ekspression i MIA Paca-2 og Panc-1-celler behandlet med Gatifloxacin på en dosisafhængig måde, (ii) Real Time PCR-analyse af p53-ekspression i MIA PaCa-2 og Panc-1-celler behandlet med 200 ug /ml Gatifloxacin på en tidsafhængig måde. 18S rRNA blev anvendt til at normalisere resultaterne. (B) (i) Western blot-analyse af p53, AKT og Pakt Ekspression i MIA PaCa-2 og Panc-1-celler behandlet med Gatifloxacin på en dosisafhængig måde, (ii) Western blot-analyse af p53, AKT og Pakt ekspression i MIA Paca-2 og Panc-1-celler behandlet med Gatifloxacin på en tidsafhængig måde. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. Data er repræsentative for typisk forsøg gentaget tre gange med lignende resultater. Søjlediagram repræsenterer middelværdien ± SEM. * P 0,01, # p 0,05 sammenlignet med kontrol

Næste, for at undersøge, om anholdelsen induceret af Gatifloxacin er p53 afhængig, den transskriptionsinhibitor ActinomycinD (ActD) og proteinsyntese inhibitor cycloheximid. (CHX) blev anvendt, og blev udført cellecyklusanalyse. Som vist i figur 6A i nærvær af 200 ug /ml Gatifloxacin der var fuldstændigt G

2-fasen, som blev afskaffet i nærværelse af CHX (2 ug /ml) og ActD (1 ug /ml) efter 48 h i både cellelinier. Højre panel i figuren viser effekten af ​​CHX og Act D reducere p53-niveauer. Vores resultater foreslog, at Gatifloxacin forårsager G

2-fase anholdelse i en p53 måde. Vi kunne ikke bruge siRNA her, fordi det er meget veldokumenteret, at både MIA PaCa-2 og Panc-1 har mutation i p53 [32]. For yderligere at bekræfte rolle af p53 i Gatifloxacin inducerede G2-standsning, en sammenligning mellem responserne i isogene HCT116 vildtype p53 + /+ og mangelfuld p53 – /- cellelinjer blev gjort. Vi behandlede både cellelinierne med Gatifloxacin (100, 200, 400 ug /ml) i 24 timer og fundet signifikant stigning i p53-protein niveau i vildtype HCT116 p53 + /+, som var magen til MIA PaCa-2 og Panc-1. Denne induktion blev dog ikke observeret i p53 mangelfuld HCT116 p53 – /- celler behandlet under de samme betingelser (figur 6Bi). Vi sammenlignede også cellepopulationen standset i G2-fase efter Gatifloxacin behandling af begge cellelinier HCT116 cellelinier. Vores data viste signifikant stigning i G2-fasen fra 27% til 41% i HCT p53 + /+ cellelinie, men ingen ændring i G2-fase subpopulation i HCT p53 – /- cellelinje derved peger mod vores teori af p53 som et mål for gatifloxacin (fig 6Bii). Vi derefter også bekræftet virkningen ved samtidig at kontrollere ekspressionen af ​​p53-protein på en dosisafhængig måde (Gatifloxacin 0, 100, 200, 400 ug /ml) i to andre p53 positive cellelinier MCF7 (2-3,08 gange stigning, p = 0,0078 ) og A549 (2,1-4,8 gange stigning, p = 0,0085) (figur 6C).

(A) Venstre panel viser cellecyklus-analyse af MIA PaCa-2 og Panc-1 celler, når der dyrkes i nærvær eller fravær af p53 transskriptionsinhibitor ActinomycinD (1 ug /ml) eller Translational inhibitor cycloheximid (2 ug /ml) sammen med 200 ug /ml Gatifloxacin i 48 timer og højre panel viser p53-proteinekspression i MIA PaCa-2 og Panc- 1-celler i nærvær eller fravær af 200 ug /ml Gatifloxacin med eller uden 2 ug /ml CHX eller 1 ug /ml ActD. % Her angiver procentdelen af ​​G

2 fase delpopulation. (B) (i) Western blot-analyse for p53-ekspression i HCT116 p53 + /+ og P53 – /- cellelinjer behandlet med Gatifloxacin på en dosisafhængig måde i 24 timer. (Ii) Cellecyklusanalyse af HCT116 p53 + /+ og P53 – /- behandles med Gatifloxacin (0-400 pg /ml) i 24 timer. % Her angiver procentdelen af ​​G

2 fase delpopulation. (C) Western blot-analyse af p53-proteinekspression i MCF 7 og A549-celler behandlet med Gatifloxacin på en dosisafhængig måde. Søjlediagram repræsenterer middelværdien ± SEM. * P. 0,01, sammenlignet med kontrol

Gatifloxacin Formindsker Niveauerne af S og G

2-fasede Regulatory CDK’er og Cycliner i begge cellelinier

For at dissekere den biokemiske begivenheder styrer overgangen fra en celle cyklus fase undersøgte vi niveauerne af flere cellecyklusproteiner efter behandling med Gatifloxacin. Cyclin A, cyclin E og CDK2 regulerer normal S-fase progression [33]; [34], og vi fandt Gatifloxacin til sænke ekspressionsniveauerne for disse proteiner i begge cellelinier på en dosisafhængig måde efter 48 timer (figur 7A). På lignende måde Gatifloxacin behandling i både cellelinier også forårsaget nedregulering af cyclin B1 ekspression, som er involveret i G

2-fase progression. Vi fandt imidlertid stigning i ekspressionen af ​​inhiberende phosphorylering af cdc2 ved Tyr-15 samt samlede cdc-2-niveauer i både cellelinier, hvorimod der ikke var nogen ændring i ekspressionen af ​​Cdc25C.

(A