PLoS ONE: Den WSB1 Gene er involveret i kræft i bugspytkirtlen Progression

Abstrakt

Baggrund

bugspytkirtelkræftceller generere metastaser fordi de kan overleve stress pålagt af det nye miljø i værtens væv. At efterligne denne proces, er bugspytkirtelkræftceller som ikke stressede i standard dyrkningsbetingelser injiceret i nøgne mus. Fordi de udvikler xenografter, bør de have udviklet tilstrækkelig stress respons. Karakterisering dette svar kan give nye strategier til at blande sig med kræft i bugspytkirtlen metastaser.

Metodologi /vigtigste resultater

I de menneskelige bugspytkirtelkræft cellelinjer Panc-1, Mia-PaCa2, Capan-1, Capan -2 og BxPC3, vi brugte Affymetrix mikromatrice at sammenligne udtryk for 22.000 gener in vitro og i de tilsvarende xenotransplantater. Vi identificerede 228 gener overudtrykt i xenotransplantater og karakteriseret konsekvenserne af en af ​​dem, WSB1, i kontrollen af ​​apoptose og celleproliferation. WSB1 genererer 3 alternativt splejsede transkripter koder distinkte proteinisoformer. I xenotransplantater og i humane pancreas tumorer, er global udtryk for WSB1 mRNA let øget mens isoform 3 er stærkt overudtrykt og isoformer 1 og 2 ned-reguleret. Behandling Mia-PaCa2 celler med stress-fremkaldende stoffer forårsagede lignende ændringer. Henviser retrovirus-tvungen ekspression af WSB1 isoformer 1 og 2 fremmet cellevækst og sensibiliserede cellerne til at gemcitabine- og doxorubicin-induceret apoptose, WSB1 isoform 3-ekspression reduceret celleproliferation og forøget resistens over for apoptose, viser, at stress-induceret modulering af WSB1 alternativ splejsning øger modstanden mod apoptose af bugspytkirtelkræftceller.

konklusioner /betydning

data om WSB1 regulering støtter hypotesen om, at aktivering af stress-reaktionsmekanismer hjælper kræftceller oprettelse metastaser og foreslå relevans for kræft udvikling af andre gener overudtrykt i xenografter

Henvisning:. Archange C, Nowak J, Garcia S, Moutardier V, Calvo EL, Dagorn JC, et al. (2008) Den WSB1 Gene er involveret i kræft i bugspytkirtlen Progression. PLoS ONE 3 (6): e2475. doi: 10,1371 /journal.pone.0002475

Redaktør: Juan Valcarcel, Centre de Regulació Genòmica, Spanien

Modtaget: Marts 4, 2008; Accepteret: 18. maj 2008; Udgivet: 25 Jun 2008

Copyright: © 2008 Archange et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. INSERM, La Ligue, Canceropole PACA, INCA

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er en meget dødelig sygdom med en dårlig lang. -term overlevelsesraten for patienter med lokalt fremskreden og metastatisk stadier [1] – [3]. Hovedårsagerne til denne dårligt resultat er vores manglende evne til at diagnosticere kræft i bugspytkirtlen på et tidligt stadium på grund af manglen på specifikke symptomer, placering af pancreas dybt ind i bughulen og tidlig forekomst af metastaser. Derfor, i de fleste patienter, på tidspunktet for diagnosen, har regional lymfeknude og levermetastaser af kræft i bugspytkirtlen indtraf, hvilket begrænser effektiviteten af ​​de eneste kendte helbredende muligheder, som skal omfatte kirurgisk resektion [4] – [6]. Til dato har radioterapi eller kemoterapi ikke resulteret i signifikant forbedring i overlevelse på lang sigt [7]. Årsagerne til bugspytkirtelkræft endnu ikke præcist forstået. Mange genprodukter viser deregulerede funktioner. Talrige vækstfaktorer og deres receptorer er overudtrykt under udviklingen af ​​kræft i bugspytkirtlen [7] -. [9], men disse resultater har næppe medført nogen forbedring i bugspytkirtelkræft terapi

Vores strategi for at identificere nye potentielle mål for pancreas kræftbehandling er baseret på den idé, at tumor- progression altid ledsages af ændringer i mikromiljø, og at dens succes afhænger af evnen af ​​kræftceller til at tilpasse sig denne nye mikromiljø. Faktisk er det kendt, at cancer progression omfatter flere successive trin. Inden for den primære tumor cellerne først udvælges på grundlag af hurtig vækst, lav respons på apoptotiske signaler og en evne til at undslippe værtens immunsystem. Disse celler forlader den primære tumor og migrere gennem organismen. Men ikke alle af dem vil generere metastaser i alle væv. Denne proces er selektiv og afhænger både af kapaciteten af ​​tumorceller ved oprettelse interaktioner med værten væv og af deres evne til at styre de miljøfaktorer, som de er udsat i deres nye placering. Fænotypen af ​​tumorcellen er tilpasset til dets oprindelige miljø, miljøet af organet, hvori den primære tumor udviklet. Da miljøet, som målorganet er forskellig fra den oprindelige, vil det sætte den invaderende tumor celle under microenvironmental stress pres. Som følge heraf kan evnen af ​​tumorcellen at modstå at stress være afgørende for succesen af ​​metastase udvikling. Cellen vil aktivere sit forsvar program for at overleve, og hvis det lykkes, formere sig. Vores mål var at identificere de gener, der er involveret i dette program, fordi inhibering af deres ekspression kan være en ny måde at målrette pancreascancer. I dette papir beskriver vi et panel af potentielle pancreas cancer gener valgt at bruge en xenograft strategi og analysere strukturen og funktionen af ​​en af ​​dem, den WSB1 genet i relation til pancreas tumor progression.

Resultater

panelet af kræft i bugspytkirtlen stress gener

den model, vi valgte at etablere panel af potentielle pancreas progression gener er følgende: vi brugte 5 humane bugspytkirtelkræft cellelinjer med forskellige genetiske baggrunde, Panc-1 Mia-PaCa2, Capan-1, Capan-2 og BxPC3. Vi gjorde den hypotese, at, i standard dyrkningsbetingelser, er disse celler ikke stresset af deres mikromiljø. Ved injektion i nøgne mus, vil de blive udsat for stress i et andet miljø xenotransplantatet efterligne metastase. Selvom xenograft model afspejler kun delvis hvad der virkelig sker med metastase, er det en god måde at sætte celler i et miljø helt forskellige fra deres sædvanlige. Som følge heraf en vigtig stress vil blive genereret, til hvilke cellerne skal modstå. I hver cellelinie, sammenlignede vi udtrykkene for 22.000 gener in vitro og i xenotransplantater, ved hjælp af Affymetrix microarray tilgang. At sikre, at udvalgte gener er repræsentative for en stor del af humane pancreatiske tumorer, blev kun gener, hvis ekspression modificeret mindst to i alle 5-tumorer blev overvejet. Under disse betingelser kunne vi vælger 228 gener overudtrykkes i tumorer og 13, som blev nedreguleret. De fulde data er tilgængelige online på https://www.inserm-u624.univ-mrs.fr/affymetrix/. Flere blandt de mest overudtrykte gener er dårligt karakteriseret hvis ikke helt uudforsket. Som et første skridt, vi valgte at fokusere på WSB1 (WD-repeat og SOCS Æske med-1), fordi, som det er beskrevet herunder, det viste den oprindelige træk ved generering, ved alternativ splejsning, 3 variant udskrifter koder distinkte proteinisoformer, hvis regulering i xenotransplantater og ved udsættelse for flere spændinger ikke samordnes.

WSB1 ekspression i pancreas tumorxenotransplantater

komplet protein genereres af transkript variant 1, isoform 1, er sammensat af 3 domæner (et N terminale domæne, et protein-protein-interaktion domæne omfattende 8 WD-gentagelser, og en SOCS boks) (figur 1). Isoform 2 mangler næsten hele N-terminale domæne og det første WD-repeat. Endelig en præmatur stopkodon i isoform 3 frembringer et trunkeret protein, der mangler den C-terminale del af proteinet, der svarer til 6 WD-gentagelser og SOCS boksen.

A. Skematisk fremstilling af WSB1 isoformer 1 blev 2 og 3. B. WSB1 isoformer udtrykt som EGFP eller V5 tag fusionsproteiner og subcellulære lokalisering blev analyseret ved direkte fluorescens af efter immuncytokemi hjælp EGFP eller V5 antistoffer henholdsvis.

Hvis den globale ekspression af genet, detekteres af 213406_at Affymetrix probe svarende til transkriptionen af ​​alle tre isoformer, er kun steget 1,17 til 2,38 gange i muse-xenotransplantater afhængig af cellelinien, ekspression af isoform 3, detekteres af 201295_s_at Affymetrix probe, forøges fra 4,63 til 20,32 gange (tabel 1). Disse resultater blev kontrolleret ved kvantitativ RT-PCR-analyse. Vi udviklede

Homo sapiens

-specifikke primere til at analysere uafhængigt udtrykkene for WSB1 isoform 3, isoformer 1 + 2 og isoformer 1 + 2 + 3 (global udtryk) (Figur S1). Vi fandt, at den globale ekspression af WSB1 blev forøget 1,75 til 3,93 gange i tumorer (data ikke vist). Interessant udtryk for isoform 3 blev forøget med 3,7-9 gange mens der af isoformer 2 + 3 blev reduceret med 5 til 20% (figur 2), i aftale med DNA chip data. Derfor snarere end en stigning i WSB1 global udtryk i xenografter tumorer, sammenlignet med celler opretholdt in vitro, observerede vi et markant skift i alternativ splejsning til fordel for isoform 3, som bliver i høj grad fremherskende i tumorer.

Angivelse af WSB1 isoformer 1 + 2 og 3 mRNA blev vurderet ved QRT-PCR i bugspytkirtelkræft cellelinjer og i mus xenotransplanterede tumorer (A), i humane pancreas cancer prøver (B), og i Mia-PaCa2 celler efter behandling med stress-fremkaldende stoffer ( C). Værdier er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse. af kombineret resultater fra to uafhængige forsøg udført tredobbelt. (*, P 0,05).

For at kontrollere den kliniske relevans af disse fund, målt vi udtryk for de WSB1 isoformer ved kvantitativ RT-PCR i 8 humane pancreas adenocarcinom prøver. Vi observeret i disse tumorer en meget stærk overvægt af isoform 3-ekspression med et lavt niveau af isoformer 1 + 2 (figur 2). Dette antyder, at ekspression profil WSB1 observeret hos mus xenotransplantater repræsenterer, hvad der sker i human pancreascancer.

Cellular stress modulerer WSB1 alternativ splejsning til fordel for isoform 3

Vores hypotese er, at nogle af generne overudtrykt i tumorer aktiveres som reaktion på stress forårsaget af det nye væv mikromiljø. I vores eksperimentelle model, miljøet af bugspytkirtelkræftceller er faktisk helt anderledes, når de dyrkes

in vitro

eller dyrkning i

nøgen

mus, med hensyn til næringsstoffer, vækst matrix, hormoner, etc. men nogle af disse ændringer kan være vigtigt nok til at påvirke genekspression, men ikke til det punkt at inducere stress. For at kontrollere, om de observerede ændringer i WSB1 genekspression er faktisk en konsekvens af stress, vi overvågede expressoin af WSB1 mRNA isoformer i Mia-Paca2 celler, som reaktion på stress genereret af forskellige behandlinger. Disse behandlinger påvirker forskellige tilgange bør også give oplysninger om funktionen af ​​WSB1. De omfattede induktion af apoptose med staurosporin eller adriamycine og gemcitabin som blokerer DNA-syntese, DNA-beskadigelse ved γ-bestråling, metabolisk stress ved serumudsultning og hypoxi eller anoxi. Som vist i figur 2, alle behandlinger resulterede i en meget beskeden ændring i ekspressionen af ​​WSB1 isoformer 1 + 2 og i en kraftig stigning i isoform 3-ekspression. Derfor WSB1 isoform 3 udtryk synes at øges som reaktion på stress, uanset stress pathway involveret. Selvom vi ikke kan udelukke, at dette er til dels påvirket af tilstedeværelsen af ​​stroma i tumorer, tyder disse resultater på, at ændringerne i alternativ splejsning observeret for WSB1 i vores xenograft model faktisk moduleres af celle stress. Lignende resultater blev opnået med Panc1 celler (data ikke vist).

Subcellulær lokalisering af WSB1 isoformer 1, 2 og 3

For at analysere den subcellulære lokalisering af WSB1 isoformer 1, 2 og 3 vi subklonet de 3 cDNA’er ind i pEGFP-N1-vektoren til opnåelse WSB1 isoformer som EGFP-WSB1 fusionsproteiner. Disse plasmider blev transficeret ind i HeLa-celler, og efter 24 timer, isoformer 1, 2 og 3 viste sig som cytoplasmatiske prikker. Der blev ikke fundet forskelle i dot størrelse eller tal mellem de tre isoformer. EGFP-WSB1 fusionsproteiner kan erhverve unormale rumlige konformationer forhindre dem at nå den normale placering af proteinet og eventuelt inducere aggregatdannelse som kunne forklare vores observationer. Som en kontrol, vi subklonet de WSB1 isoformer i pcDNA4 at producere tre WSB1-V5 mærkede proteiner. Plasmider blev transficeret ind i HeLa-celler og anti-V5-antistoffer anvendes til at påvise 24 timer senere isoformerne ved immuncytokemi. Interessant, den subcellulære fordeling af V5-mærkede isoformer var meget lig den, observeret for EGFP-WSB1 isoformer (figur 1).

WSB1 øger celledeling

lidt om WSB1 funktion. WSB1, også kendt som SWIP1, blev først identificeret ved Vasiliauskas et al. [10] ved at søge humane sekvenser svarer til kylling genet swip1. WSB1 aktier 88% aminosyre identitet med kylling swip1. Forfatterne viste, at swip1 blev reguleret af sonisk pindsvin i somitter og lemmer knopper i udviklingslandene kylling. For nylig Dentice et al. [11] fremlagde dokumentation for, at WSB1 er en del af en E3 ubiquitinligase for thyroid hormon-aktiverende iodothyronin deiodinase-2. Det er vigtigt at bemærke, at alle tidligere forsøg er blevet udført i kylling, hvor der er konstateret kun to isoformer, svarende til humane isoformer 1 og 2. Derfor er funktionen af ​​dette gen i human cancer, især for dens isoform 3, er fuldstændig ukendt. Vi undersøgte først rolle WSB1 på celleproliferation. Til dette formål inhiberede vi WSB1 ekspression ved transfektion Mia-Paca2 med en siRNA, der er målrettet de 3 isoformer. Som vist i figur 3, 48 timer efter transfektion denne siRNA effektivt reduceret WSB1 global ekspression med 85% (80% for isoformer 1 + 2 og 89% for isoform 3). Cellevækst blev målt hver 24. time, startende 48 timer efter siRNA transfektion ved direkte celletælling og ved MTT-assayet. I begge tilfælde resultater indikerer, at celler transficeret med WSB1 siRNA voksede langsommere end celler transficeret med kontrol siRNA (figur 3). Lignende resultater blev opnået med Panc1 celler (data ikke vist). BrdU inkorporering eksperimenter bekræftede disse resultater. Imidlertid kunne denne forskel skyldes en stigning i celledød frem til en nedsat proliferation af WSB1 siRNA-transficerede celler. For at teste denne hypotese, vurderede vi apoptose ved at måle caspase-3-aktivitet i celler transfekteret med disse siRNA. Caspase-3-aktivitet var den samme i celler transficeret med WSB1 siRNA eller med kontrol siRNA. Desuden, når apoptose blev induceret ved behandling med staurosporin eller doxorubicin, celler transficeret med WSB1 siRNA viste en lavere caspase-3-aktivitet end kontrolceller (figur 3). Taget sammen antyder disse resultater stærkt, at WSB1 ekspression forøger cellevækst ved at øge celleproliferation snarere end ved at reducere celledød.

A. Mia-PaCa2 celler blev transficeret med et siRNA rettet mod WSB1 mRNA og ekspression af WSB1 isoformer 1 + 2 + 3, 1 + 2 og 3 mRNA’er blev analyseret ved QRT-PCR. B. Mia-PaCa2 celler blev transficeret med WSB1 siRNA og væksten blev analyseret ved direkte celletælling (B), MTT analyse (C) eller ved BrdU-inkorporering (D) som beskrevet i afsnittet Materialer og Fremgangsmåder. E. Mia-PaCa2 celler blev transficeret med WSB1 siRNA og caspase 3-aktivitet blev målt i ubehandlet og efter behandling med staurosporin eller doxorubicin. Værdier er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse. af kombineret resultater fra to uafhængige forsøg udført tredobbelt. (*, P 0,05).

En specifik rolle for isoform 3

Angivelse af WSB1 isoform 3 induceres i humane bugspytkirtelkræftceller både in vitro efter udsættelse for en stress og in vivo, når disse celler vokse som xenotransplantater i mus. Det er også i høj grad fremherskende i humane pancreas tumorer, hvilket antyder, at de 3 isoformer har forskellige funktioner. For at karakterisere disse funktioner vi genereret stabile cellelinier, der udtrykker hver isoform af WSB1 separat som WSB1-EGFP-fusionsproteiner, ved at transducere Mia-PaCa2 celler med retrovirus kodende WSB1 isoformer 1 blev 2 eller 3. Ekspression af fusionsproteiner dokumenteret ved western blot (figur S2). Vi målte cellevækst ved direkte tælling hver 24 timer i løbet af 4 dage og fandt, at celler, der udtrykker isoform 1 eller 2 voksede hurtigere end kontrol celler, der udtrykker EGFP alene. Men til vores overraskelse, celler, der udtrykker isoform 3 voksede langsommere end celler, der udtrykker isoformer 1 eller 2, eller kontrolceller (figur 3). Som tidligere, vi udelukkes, at dette skyldtes øget celledød, fordi caspase-3-aktivitet var den samme i de 3 cellelinier (data ikke vist). Desuden bekræftede disse observationer cellecyklusanalyse. Faktisk fandt vi S /G1 faseforhold højere i celler, der udtrykker isoformer 1 eller 2 end i kontrolceller, og langsommere i celler, der udtrykker isoform 3 (figur 4). Derfor WSB1 isoformer 1 eller 2 og isoform 3 har modsatte effekter på celleproliferation, isoform 3 inhibering pancreas cellevækst henviser isoformer 1 og 2 stimulere deres proliferation.

A. Mia-PaCa2 celler blev transduceret med retrovirus, som udtrykker WSB1 isoformer 1, 2 eller 3 som EGFP-fusionsproteinet eller EGFP alene som en kontrol og selekteret med puromycin. Cellevækst blev målt ved direkte tælling efter udpladning 10

5-celler i 48-brønds skåle hver dag under 4 dage. B. Efter synkronisering med 24 h serum-udsultning, blev celler inkuberet i serumholdigt medium i 24 timer, farvet med propidiumiodid og cellecyklus blev analyseret med et flowcytometer. C. S /G1-forhold. Værdier er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse. af kombinerede resultater fra to uafhængige forsøg udført i tre eksemplarer (A) eller trice i tre eksemplarer (B og C) (*, p 0,05).

WSB1 isoform 3 reducerer modtagelighed for stress-induceret celledød

Siden udtryk for isoform 3 induceres af stress, vi undersøgt, om det kan påvirke modtageligheden af ​​cellerne at understrege celledød. Vi indgav Mia-Paca2 celler, der udtrykker isoformer 1, 2 eller 3 til behandling med 100 eller 150 uM doxorubicin vides at inducere apoptose, og måles cellelevedygtighed efter 6 timer. Vi observerede med begge medikamentkoncentrationer øget celledød i celler, der udtrykker isoformer 1 eller 2, sammenlignet med kontrolceller. Tværtimod celler, der udtrykker isoform 3 var markant mere resistent (Figur 5). At kontrollere disse resultater blev celler behandlet i 48 timer med 150 og 350 uM gemcitabin og cellelevedygtigheden blev vurderet. En profil ligner doxorubicin-behandlede celler blev opnået, celler, der udtrykker isoformer 1 og 2 er mere følsomme over for lægemidlet end kontrolceller, i modsætning til celler, der udtrykker isoform 3 (figur 5). Disse lægemidler dræbe delende men ikke standsede celler, men forskellene efter 6 timers behandling er for vigtige til fuldstændigt forklares med, at langsommere voksende celler dør langsommere. Disse resultater viser, at overekspression af WSB1 isoform 3 og nedregulering af isoformer 1 og 2 som reaktion på cellulære stress resulterer i øget modstand til apoptose.

Mia-PaCa2 celler blev transduceret med retrovirus, der udtrykker WSB1 isoformer 1 , 2 eller 3 som EGFP-fusionsprotein eller EGFP som kontrol og selekteret med puromycin. Celler blev behandlet med gemcitabin (100 og 150 uM) i 48 timer eller med doxorubicin (150 og 350 uM) i 6 timer. Cellelevedygtighed blev målt ved MTT. Værdier er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse. af kombineret resultater fra to uafhængige forsøg udført tredobbelt. (*, P 0,05).

Diskussion

Hypotesen understøtter dette arbejde er, at bugspytkirtlen tumorprogression og metastase forekommer kun, når cirkulerende kræftceller succes kan modstå de belastninger, der genereres af ny mikromiljø, som værten væv. Hvis undslupne kræftcellerne ikke blev indsendt til stress i nye miljøer, ville metastaser udvikle sig i alle væv. Faktisk klinisk observation er, at de primære kræftformer udvikler sig i en given orgel altid udvikle metastaser i de samme andre organer, sandsynligvis dem, hvor disse kræftceller er i stand til at modstå stress forårsaget af de miljømæssige forhold. Derfor kan terapeutiske strategier, som interfererer med de mekanismer, der beskytter kræftceller fra stress bremse eller forhindre den metastatiske proces. Det første skridt i retning af sådanne strategier er at identificere de gener, som giver resistens over for den nye mikromiljø under tumor udvikling. Dette kan opnås ved at sammenligne ved DNA-array-genekspression i celler, der vokser i forskellige microenvironmental betingelser, vælg derefter generne overudtrykt under forhold med tumorvækst. At efterligne stress, som optræder under metastase-dannelse i patienter, brugte vi en eksperimentel opstilling baseret på en xenotransplantat pancreatisk tumor model. Vi sammenlignede genekspressionsprofilerne af humane pancreas cancer cellelinjer vokser in vitro under standard dyrkningsbetingelser (mikromiljø A) og under tumorudvikling efter injektion i nøgne mus (mikromiljø B). Faktisk viste mange gener overekspression i den nye mikromiljø og hvis nogle af dem kan overudtrykkes som svar på de signaler som celle-til-celle eller celle-til-ekstracellulære matrix kontakt, kan andre være impliceret i resistens over for stress. Vi valgt som bedste kandidater generne stærkt overudtrykt i xenotransplantaterne genereret af alle 5 cellelinjer. Blandt kandidatgener, valgte vi at karakterisere i detaljer WSB1 fordi det præsenterede yderligere interesse for generering af alternative splejsning tre forskellige isoformer, hvis regulering ved udsættelse for stress er ikke koordineret. Selvom overekspression af isoformer 1 + 2 + 3 er moderat, 1,75 til 3,93 gange afhængigt af celletypen, er isoform 3 stærkt overudtrykt (3,7 til 9 gange). Tværtimod er ekspression af isoformer 1 + 2 faldt til 5 til 20% i xenotransplantater. Interessant, isoform 3 er også i høj grad fremherskende i humane pancreas tumorer, hvilket understøtter vores arbejdshypotese.

Selvom U133A GeneChip er designet til at målrette de menneskelige sekvenser, vi kan ikke udelukke en potentiel krydshybridisering nogle sonder med mus sekvenser. Det er derfor, designet

Homo sapiens

-specifikke primere til qPCR. qPCR blev udført på mus embryonale fibroblaster cDNA under samme betingelser som for humant pancreas cDNA og der var ingen DNA-amplifikation efter 45 cyklusser, selv om vi var i stand til at amplificere hele isoform 3 fra den samme muse embryonale fibroblaster cDNA ved en PCR med primere matching perfekt sekvenser fælles for begge arter (fremadrettet 5′-CCATGAGCCAGCTTTCCC-3 ‘; Reverse 5′-TCACACCAATATTGCTGCCAC-3’). Derfor konkluderede vi, at vores qPCR primere er menneske-specifikke, og at fremme ekspressionen af ​​de isoform 3 forekommer i humane epitelceller og ikke i mus stroma.

For at validere at WSB1 er faktisk en stress-induceret gen, vi indsendt bugspytkirtlen celler til flere spændinger og observeret, at ekspressionen af ​​WSB1 isoform 3 altid var stærkt aktiveret mens ekspressionen af ​​isoformer 1 + 2 var uændret eller mindskes. Det cellulære stress regulerer WSB1 udtryk ved at modulere sin splejsning er faktisk interessant, men ikke original, da en sådan regulering allerede var beskrevet for andre gener. For eksempel modulationer af alternativ splejsning forekommer for Arabidopsis SR protein homologer, atSR30 og atSR45a, som reaktion på stress fra omgivelserne [12]. Også, UV og γ-stråling samt cisplatin behandling inducerer alternativ splejsning af HDM2 [13] og eksponering af primære lymfocytter til en stress inducerer fremkomsten af ​​TSG101 splejsningsvarianter [14]. Endelig i neuroner, acetylcholinesterase skift fra isoform AChE-S til normalt sjældne isoform AChE-R som reaktion på flere spændinger [15]. Det vigtige punkt er, at stress-induceret modulering af alternativ splejsning af ekspressionen af ​​WSB1 isoformer er meget lig, hvad vi observeret under xenograft tumor progression.

Det er bemærkelsesværdigt, at den menneskelige WSB1 isoform 3 sekvens er blevet permanent undertrykt fra databaser for at være en nonsens-medieret mRNA nedbrydning (NMD) kandidat. NMD er et mRNA overvågning pathway, der sikrer den hurtige nedbrydning af mRNA’er indeholdende præmature oversættelse termineringskodoner og derved forhindre ophobning af trunkerede og potentielt skadelige proteiner [16]. I denne undersøgelse, viser vi en ophobning af isoform 3 mRNA efter stress induktion i xenograft og i humane pancreas tumorer i modsætning til hvad man kunne forvente i en NMD sammenhæng. Så selv om dets sekvens kunne relateres til NMD, er det indlysende, at WSB1 isoform 3 mRNA ikke nedbrydes hurtigt og ikke synes at være en reel mål for NMD. Vi fastslog også, ud ved RT-PCR-amplifikation og sekventering af hele isoform 3 mRNA, at en præ-mRNA detekteres i stedet for isoform 3 mRNA (data ikke vist).

De fysiologiske konsekvenser for bugspytkirtelkræftceller af stress-inducerede ændringer i andelene af WSB1 isoformer, med hensyn til væksthastighed og resistens over for apoptose, er vigtige. Ekspression af WSB1 isoformer 1 eller 2 viste sig at accelerere cellecyklus henviser ekspression af isoform 3, tværtimod, aftog den ned. Når alle isoformer blev samtidig ramt af et siRNA i Mia-PaCa2 eller Panc1 vækst celler var signifikant reduceret, hvilket var forventet, fordi isoformer 1 og 2 er rigelige i celler ikke-stressede, der viser normal vækst. Derfor, i stresstilstande vækst er begrænset både af reduceret ekspression af isoformer 1 og 2 og ved overekspression af isoform 3. På den anden side er ekspressionen af ​​isoform 1 eller 2 forøger følsomheden af ​​celler til pro-apototic stimuli, hvorimod ekspression af isoform 3 øger deres modstand. Igen, stress-induceret hæmning af isoformer 1 og 2 ekspression og overekspression af isoform 3 både hjælper cellerne med at klare et andet miljø. De molekylære mekanismer, som disse proteiner kan påvirke cellevækst og resistens over for apoptose i modsatte retninger er endnu ikke fastlagt, selv om tabet i isoform 3 i den C-terminale del af isoform 1 sandsynligvis bør udgøre en del af det. Men på trods af vigtige strukturelle forskelle, de 3 WSB1 isoformer er ligeledes fordelt i cytoplasmaet, som vist i figur 1.

Afslutningsvis rapporterer vi, at skiftet i WSB1 isoform-ekspression observeret i humane bugspytkirtelkræftceller indgivet til en stress ligner skiftet observeret, når disse celler er xenotransplanteret i nøgne mus eller i humane pancreas tumorer. Hvis at skift resulterer i nedsat væksthastighed af cellerne, det øger også betydeligt deres modstand mod apoptose. Disse data understøtter den hypotese, at aktiveringen af ​​stress-reaktionsmekanismer hjælper kræftceller oprettelse metastaser, idet samme WSB1 isoform forhold er observeret i bugspytkirtlen adenokarcinomer. Hvorvidt stress-inducerede ændringer i WSB1 isoform udtryk er nødvendig for tumor udvikling, som ville gøre det et potentielt terapeutisk mål, er dog stadig at blive undersøgt.

Materialer og metoder

cellelinjer og celle dyrkningsbetingelser

Den humane pancreascancer-afledt Mia-PaCa2, BxPC3, Panc-1, Capan-1 og Capan-2, og Phoenix amfotrope viral pakning cellelinjer blev dyrket som anbefalet af American Type Culture Collection.

Subkutan tumor induktion i nøgne mus Salg

Suspensioner af pancreatiske cellelinjer, (10

7/200 pi PBS) injiceret subkutant i flanken af ​​mandlige athymiske 7-8 uger gamle nøgne mus, og tumorer fik lov at udvikle sig i 30 dage. Alle undersøgelser blev udført i overensstemmelse med EU-regler for dyreforsøg.

Menneskelige pancreas tumor prøver

bugspytkirtlen væv blev opnået fra patienter, der undergik bugspytkirtlen resektion ved Institut for Kirurgi, Hopital Nord, Marseille, Frankrig. Institutional Review Board godkendelse blev opnået fra Comité d’Ethique de l’Institut Paoli Calmettes (Marseille, Frankrig). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra patienterne i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen.

RNA isolering

Total RNA blev isoleret ved den Trizol (Gibco-BRL) procedure.

Microarray Salg

forsøget blev udført på U133 2,0 Plus GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA), som tidligere beskrevet [17], og analyseres med Microarray Suite 5.0-softwaren (Affymetrix).

Behandlinger

I nogle forsøg Mia-Paca2 celler blev behandlet i løbet af 24 timer med 10 pM Doxorubicin (Sigma), 0,5 uM Staurosporin (Sigma) eller 350 uM Gemcitabin (Eli Lilly) eller forelægges 24 timer serum deprivation, eller at y-bestråling (5Grays)

hypoxi /Anoxia

Oxygenkoncentrationer blev ændret ved hjælp af en hypoxi inkubator kammer (katalog # 27310; Stem Cell Technologies). og passende gasblandinger (Linde gas, Frankrig ), følge anvisningerne fra producenten. Celler blev indsendt til 5 timer iltmangel (5% CO

2, 95% N

2), eller til 6-18 h hypoksi (5% CO

2, 94,8% N

2 og 0,2% O

2).

Kvantitativ RT-PCR-analyse

Første cDNA blev syntetiseret ved hjælp Udvid revers transkriptase (Roche, Meylan, Frankrig). Kvantitativ PCR blev udført ved anvendelse af Roche Light Cycler-system og reagenser, efter producentens anvisninger. Primere anvendt og betingelserne for annealing var 5′-AGTGTCAGACTGATCTGG-3 ‘og 5′-ACAGTAGACGGATTCTTCAA-3′, 58 ° C i 7 sek; 5’-GATCATACTGAAGTGGTCAG-3 ‘og 5′-GCCCAAATTCCATCAGAATG-3′, 56 ° C i 14 sek; og 5’-GATCGTGGTTAGTTTGGG-3 ‘og 5′-TGGGTCACCAACTTGAG-3’, 57 ° C i 6 sek; for global ekspression af wsb1, isoformer 1 + 2 og isoform 3 hhv. (Se supplerende fig S1) Hver prøve blev analyseret to gange, og forsøget blev gentaget to gange. Resultater blev analyseret ved anvendelse RelQuant (Roche) og udtrykt som et forhold mellem TATA-boks-bindende protein (TBP) eller af styreværdier (ubehandlede celler).

Transfektioner

Celler blev transficeret under anvendelse FuGENE HD ( Roche Diagnostics) ifølge producentens anvisninger med pEGFP-N1-plasmidet (Clontech) indeholdende fuld-længde humant WSB1 cDNA, isoform 1, 2 eller 3 (henholdsvis NM_015626, NM_134265, NM_134264), eller intet insert. De 3 isoformer blev også subklonet i pcDNA4-V5-Et plasmid (Invitrogen).

WSB1 fluorescens

muse-anti-V5-antistof (InVitrogen) blev anvendt til at detektere V5-mærkede WSB1 proteiner og afsløret af ged Chromeo 488-konjugeret anti-muse-sekundært antistof (ActiveMotif). Celler, der udtrykker EGFP-WSB1 fusionsproteiner blev kun fastsættes. Celler blev monteret i forlænge Gold (Invitrogen) og analyseret med et Nikon I90 mikroskop (40 × /APO plan /NA1.40).

retroviral vektor og retroviral genoverføring

3