PLoS ONE: c-myc kræves til vedligeholdelse af Gliom cancerstamceller

Abstrakt

Baggrund

malignt gliomer er blandt de mest dødelige kræftformer. Gliomer vise en slående cellulær heterogenitet med et hierarki af differentiering stater. Nylige undersøgelser støtte eksistensen af ​​cancer stamceller i gliomer, der er funktionelt defineret ved deres evne til omfattende selv-fornyelse og dannelse af sekundære tumorer, phenocopy de oprindelige tumorer. Da c-Myc oncoproteinet har anerkendt roller i normale stamcellebiologi, vi hypotese, at c-Myc kan bidrage til kræft stamcellebiologi som disse celler deler karakteristika med normale stamceller.

Metodologi /vigtigste resultater

Baseret på tidligere metoder, som vi og andre har anvendt, tumor cellepopulationer beriget eller depleteret for cancer stamceller under anvendelse af stamcellemarkør CD133 (Prominin-1). Vi kendetegnet c-myc ekspression i matchede tumorcellepopulationer ved hjælp af real time PCR, immunoblotting, immunofluorescens og flowcytometri. Her rapporterer vi, at c-Myc er højt udtrykt i gliom cancer stamceller i forhold til ikke-stamceller gliomaceller. At afhøre betydningen af ​​c-myc-ekspression i gliom cancer stamceller, målrettet vi dens udtryk ved hjælp lentivirally transduceret kort hårnål RNA (shRNA). Knockdown af c-myc i gliom cancer stamceller reduceret proliferation med samtidig cellecyklusstop i G

0 /G

1 fase og øget apoptose. Ikke-stamceller gliomaceller vises begrænset afhængighed af c-myc-ekspression for overlevelse og proliferation. Endvidere gliom cancer stamceller med nedsat c-myc niveauer undladt at danne neurosfærer

in vitro

eller tumorer, når xenotransplanted ind i hjernen på immunsvækkede mus.

Konklusioner /Betydning

Disse resultater understøtter en central rolle i c-myc i reguleringen spredning og overlevelse af gliomer cancer stamceller. Målretning core stamceller veje kan tilbyde forbedrede terapeutiske metoder til avancerede kræftformer

Henvisning:. Wang J, Wang H, Li Z, Wu Q, lathia JD, McLendon RE, et al. (2008) c-myc kræves til vedligeholdelse af Gliom cancerstamceller. PLoS ONE 3 (11): e3769. doi: 10,1371 /journal.pone.0003769

Redaktør: Juha Klefstrom, University of Helsinki, Finland

Modtaget: 11. juli, 2008; Accepteret: November 2, 2008; Udgivet: 20. november 2008

Copyright: © 2008 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Jialiang Wang er en modtager af den amerikanske Brain Tumor Association Basic Research Fellowship. Andre finansielle støtte blev leveret af Childhood Brain Tumor Foundation, Pediatric Brain Tumor Foundation i USA, Accelerate Brain Cancer Cure, Alexander og Margaret Stewart Trust, Brain Tumor Society, Goldhirsh Foundation, Duke Comprehensive Cancer Center Stem Cell Initiative Grant (JR ), NIH giver NS047409, NS054276, og CA116659 (JR). J.R. er en Damon Runyon-Lilly Clinical Investigator støttet af Damon Runyon Cancer Research Foundation og en Sidney Kimmel Foundation for Cancer Research Scholar. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den nye kræft stamceller model antyder, at tumorer er organiseret i et hierarki med en delpopulation af cancer stamceller ansvarlige for tumor vedligeholdelse og progression. Kræft stamceller er yderst tumorigene og phenocopy de oprindelige tumorer i gnaver xenograftmodeller. Udtynding af kræft stamcellepopulation Derved nedsættes potentiale til at initiere xenotransplantat tumordannelse af bulk tumorer [1], [2]. Kræft stamcellepopulation bidrager også til fast tumor angiogenese [3], metastase [4], og modstandsdygtighed over for kemoterapi og strålebehandling [3], [5], [6], [7], [8], [9]. Mens denne model er blevet valideret i en voksende liste af hæmatopoietisk og faste tumorer, de molekylære signalveje orkestrere biologi cancerstamceller mangler at blive belyst.

c-myc oncoprotein er blevet grundigt undersøgt for dets instrumentelle rolle i proliferation og vækst af normale og neoplastiske celler. Dereguleret c-Myc findes i forskellige humane tumorer og er ofte forbundet med fremskreden malignitet og dårlig prognose [10]. Som c-myc er for nylig blevet anerkendt som en vigtig regulator stamcellebiologiske, kan det tjene som et link forbinder malignitet og “stemness” [11]. I enten normale eller transformerede celler, c-Myc alene aktiverer en embryonisk stamcelle-lignende transkriptionel modul, som i høj grad korrelerer med tumormetastase og dødelighed [12]. Ektopisk c-myc ekspression i transformerede humane keratinocytter dramatisk øger cellefraktion for cancerstamceller og forbedrer tumorigenicitet [12]. Introduktion af c-Myc med andre transkriptionsfaktorer (herunder Oct3 /4, Sox2, og Klf4) genererer induceret pluripotente stamceller (IPS) celler fra differentierede celler [13]. Eksklusive c-myc fra denne kombination uden at fjerne endogene c-myc-ekspression, drastisk reducerer effektiviteten af ​​iPS celle produktion [13], [14], [15], [16]. Mens alle disse data antyder en rolle for c-myc i opretholdelsen af ​​stamceller, har andre funktioner af c-Myc i regulering stamcellebiologi også blevet beskrevet. Betinget knockout af c-myc i mus knoglemarven forhindrer ikke spredning eller selvstændig fornyelse af hæmatopoietiske stamceller [17]. Det snarere resulterer i ophobning af hæmatopoietiske stamceller i knoglemarven, hvilket antyder, at c-Myc specifikt styrer interaktionen mellem hæmatopoietiske stamceller og deres nicher. Derudover overekspression af c-Myc-østrogenreceptor fusionsprotein i humane epidermale stamceller drev differentiering snarere end proliferation [18], [19].

På grund af de anerkendte funktioner af c-Myc i både normal stamcellebiologi og neurale malignitet, undersøgte vi rollen af ​​c-Myc i human gliom cancer stamceller. Gliomer er den mest almindelige primære iboende tumortype af det centrale nervesystem. Høj kvalitet gliomer (World Health Organization kvaliteter III og IV) er blandt de mest dødelige menneskelige maligniteter [20]. I gliom, c-myc-ekspression korrelerer med graden af ​​malignitet [21]. Ekspression af c-Myc drevet af glial fibrillært surt protein (GFAP) -promoter i udviklingen muse astroglia inducerer tumorer, der ligner den humane glioblastoma multiforme [22]. I denne musemodel, tumormassen indeholder hurtigt delende subpopulation, der udtrykker c-myc og relativt hvilende tumorceller, der mangler c-myc-ekspression [22]. Vi har nu konstateret, at gliom cancer stamceller udtrykte højere niveauer af c-myc i forhold til matchede ikke-stamceller tumorceller og aktiviteten af ​​c-Myc er påkrævet for proliferation, vækst og overlevelse af gliomer cancer stamceller. Tab af c-Myc afskaffede xenograft dannelse ved gliom cancer stamceller, hvilket understreger en nøglerolle af c-Myc i gliom kræft stamcelle vedligeholdelse.

Resultater Salg

gliom cancer stamceller udtrykker høje niveauer af c-myc

for at undersøge de biologiske funktioner af c-myc i regulering af gliom cancer stamceller, vi først bestemt udtryk for c-myc i disse celler. Kortvarig kulturer beriget eller depleteret for cancer stamceller blev afledt fra human hjerne tumorprøver under anvendelse CD133 udvælgelse og karakteriseret som vi tidligere har vist [9]. Kvantitativ realtids-PCR viste, at CD133 + gliomceller udtrykte højere c-Myc mRNA niveauer end matchede CD133- gliomceller (figur 1A). De differentiel mRNA-niveauer oversat til højere niveauer af c-myc-protein i CD133 + gliomceller end matchede CD133- celler (Figur 1B). I overensstemmelse med tidligere rapporter [23], [24], de cancer stamceller beriget fraktioner udtrykte også høje niveauer af Olig2, en markør for voksne neurale multipotente progenitorer (figur 1B). For direkte at måle ekspressionen af ​​c-myc i humane hjernetumorer, vi evalueres yderligere c-myc-ekspression ved flowcytometri i både CD133 + og CD133- fraktioner af gliom celler akut isoleret fra humane kirurgisk biopsi prøver uden

in vitro

kultur (figur 1C). Ca. halvdelen af ​​CD133 + -celler var høj i c-myc-ekspression, hvorimod næsten 90% CD133- celler udtrykte lave niveauer af c-Myc (figur 1D). Vi undersøgt yderligere c-myc-ekspression i gliom cancer stamceller ved hjælp sektioner genereret fra akut frosne menneskelige gliom kirurgiske prøver. Fordi co-farvning med CD133 ikke var forenelig med antigen hentning metode kræves for c-myc farvning, vi co-farvet c-myc med en anden neural stamcelle markør Nestin. Mere end 90% af nestin positive gliomaceller var også c-myc positive (figur 1E). Disse data antyder, at c-Myc er højt udtrykt i gliom cancer stamceller.

(A) CD133- og CD133 + celler blev isoleret fra gliom kirurgiske biopsiprøver passeret kortvarig hos immunkompromitterede mus og kortvarigt dyrkes. Totalt RNA blev isoleret fra både CD133- og CD133 + celler. cDNA blev fremstillet ved revers transkription. Ekspression af c-Myc blev derefter bestemt ved kvantitativ realtids-PCR og normaliseret til p-actin og HPRT1. Relative mRNA-niveauer af c-myc i CD133- celler blev tildelt en værdi på 1. Data er repræsenteret som middelværdi ± S.E.M i denne og alle efterfølgende grafer (#: p 0,001). (B) Total cellulære lysater blev opløst ved SDS-PAGE. Proteinniveauer af c-Myc og Olig2 blev bestemt ved immunblotting. Actin blev blottet som lastning kontrol. (C) gliomceller blev isoleret direkte fra humane kirurgiske biopsiprøver, fikseret i 4% paraformaldehyd efter dissociation, mærket med anti-CD133-APC og anti-c-myc-FITC og underkastet FACS-analyse. (D) Procentdel af celler, der udtrykker høje niveauer af c-Myc inden for enten den CD133- fraktion eller den CD133 + fraktionen blev demonstreret (#: p 0,001). (E) Snit af frisk frosset humant gliom kirurgisk biopsiprøver blev fikseret og co-farvet for c-Myc (grøn) og Nestin (rød). Kerner blev modfarvet med Hoechst 33342. Repræsentative billeder (630 ×) blev demonstreret.

c-myc regulerer cellecyklus progression og spredning af gliomer cancer stamceller

c-myc spiller en nøglerolle i regulering cellulær proliferation ved at styre ekspressionen af ​​cellecyklusproteiner. At forespørge den rolle af c-Myc i cellecyklussen af ​​gliom cancer stamceller, målrettet vi c-myc-ekspression ved infektion med lentivirus udtrykker shRNA specifikt til c-myc. To forskellige shRNAs effektivt formindsket c-myc-ekspression i både CD133- og CD133 + gliomceller som vist ved kvantitativ realtids-PCR og immunoblotting (figur 2A og 2B). Lignende resultater blev fundet i en anden tumorprøve (T4597, data ikke vist). Udtømning af c-Myc reducerede signifikant S fasen cellepopulationen med samtidig forøgelse af G

0 /G

1 cellepopulation i CD133 + celler (p 0,001, figur 3). I modsætning hertil CD133- celler udviste en lavere proliferation med en mindre S-fase befolkning end matchede CD133 + -celler (Figur 3 og data ikke vist), og den cellecyklusfremadskriden i CD133- celler blev ikke ændret signifikant ved knockdown af c-Myc . Regulering af cellecyklussen ved c-Myc er almindeligt medieret gennem transkriptionel regulering af cycliner og cyclinafhængige kinaseinhibitorer, herunder cycliner D

1, D

2, og E og p21

WAF1 /CIP1 [26], [27] (https://www.myc-cancer-gene.org). Svækkende c-myc-ekspression specifikt reduceret cyclin D

1 proteinniveauer, men ikke cycliner D

2 eller E, i CD133 + celler (figur 2B). Derudover blev p21

WAF1 /CIP1 proteinniveauer opreguleret i cancer stamceller udtømt for c-Myc, hvorimod p53 niveauer blev kun moderat ændret (figur 2B). Kvantitativ realtids-PCR viste et lignende mønster af cyclin D

1 og p21

WAF1 /CIP1 regulering på mRNA-niveauer ved c-Myc i CD133 + celler, hvilket antyder c-Myc reguleret disse to gener på niveauet for transkription. I slående kontrast, cyklin D

1 og p21

WAF1 /CIP1 var minimalt ændret ved at banke ned c-myc på enten mRNA eller protein niveauer i CD133- celler. Især basal cyklin D

1-niveauer var højere i CD133 + celler end matchede CD133- celler, mens cyklin D

2 og cyclin E niveauet var højere i CD133- celler, hvilket antyder, at cyklin D

1, men ikke cycliner D

2 eller E, er kritisk for G

1 /S overgang i CD133 + gliom celler. Taget sammen antyder disse resultater, at c-Myc regulerer cellecyklusprogression i gliom cancer stamceller, i det mindste delvist, ved at kontrollere ekspression af cyclin D

1 og p21

WAF1 /CIP1.

( A) Tidlig passage ( P5) T3359 glioblastoma CD133- eller CD133 + celler blev inficeret med lentivirus dirigerende ekspression af enten ikke-targeting shRNA (NT) eller c-Myc specifik shRNAs (sh-1 og SH-2). MRNA-niveauer af c-myc, p21

WAF1 /CIP1, cyclin D

1 (cycD1) og cyclin D

2 (cycD2) blev bestemt ved kvantitativ realtids-PCR 3 dage efter infektion. (B) Protein niveauer af c-myc, p53, cyklin D

1, cyklin D

2, cyklin E og p21

WAF1 /CIP1 blev bestemt ved immunblotting.

(A, B) Tidlig passage ( P5) T3359 glioblastoma CD133- eller CD133 + celler blev inficeret med lentivirus dirigerende ekspression af enten ikke-targeting shRNA (NT) eller c-Myc specifik shRNAs (sh-1 og SH-2). Tre dage efter infektion blev cellerne fikseret i 75% ethanol og mærket med 10 ug /ml propidiumiodid. Cellecyklusfordeling blev bestemt ved flowcytometri. (A) data blev genereret fra tre uafhængige forsøg. *, P 0,05; #, S 0,001 med en-vejs ANOVA sammenligning af kontrolgrupperne til de tilsvarende c-myc Knockdown grupper. (B) representitive FACS plots vises. M1-sub G

0 fase; M2-G

0 /G

1 fase; M3-S-fase; M4-G2 /M-fasen.

Tidligere rapporter viste, at hjernen tumor stamceller isoleret fra humane kirurgiske biopsipræparater var aktivt proliferativ

in vitro

[28], [29], men antallet af matchede CD133- tumorceller steget knap efter en uge af kultur. Vore data at den relativt høje ekspression af c-myc i gliom cancer stamceller væsentligt for den cellecyklusregulering tyder på, at væksten af ​​disse celler også kan kræve c-Myc-aktivitet. Som påvist ved vækstkurve assays, det samlede antal kontrol- CD133 + -celler forøget omtrent seks eller syv gange i løbet af fem dage, hvorimod CD133 + -celler udtømt for c-Myc ikke har øget eller reduceret i antal (figur 4). Omvendt vækst af CD133- befolkning var kun moderat svækket med c-Myc knockdown (figur 4). Disse resultater antyder, at c-Myc fortrinsvis bidrager til vedvarende vækst af tumorfremkaldende celler.

(A) T3359, (B) T3832, og (C) T4597 CD133- og CD133 + -celler blev isoleret og inficeret som beskrevet. Celler blev derefter udpladet i plader med 96 brønde i tre eksemplarer ved 5000 celler per brønd for CD133- celler eller 1000 celler per brønd for CD133 + celler. Total levedygtige celleantal blev derefter bestemt ved CellTiter-Glo Luminescent Cell Levedygtighed Assay (Promega) dagligt. *, P 0,05; #, S. 0,001 med envejs ANOVA sammenligning af kontrolgrupperne til de tilsvarende c-myc Knockdown grupper på samme dag

Tab af c-myc inducerer apoptose i gliom cancer stamceller

c-Myc regulerer ikke blot cellulær proliferation men også cellulær overlevelse. I konkordans med en rolle i overlevelse, vi bemærkede en ophobning af døde celler i CD133 + fraktionen tømt for c-myc-ekspression under vækstkurven eksperimenter, der ikke var til stede i kontroller (data ikke vist). Omvendt blev tegn på celledød begrænset i matchede CD133- celler, uanset c-Myc status, hvilket antyder, at tabet af c-Myc kan specifikt inducerer apoptose i CD133 + celler. Rollen af ​​c-Myc i reguleringen apoptose forbliver kontroversiel. Tidligere rapporter har vist, at c-Myc fremmer apoptose i cancercellelinier og forskellige normale celletyper, hvorimod nedregulering af c-Myc også fører til apoptose under visse omstændigheder [30], [31], [32], [33]. For at skelne den anti-apoptotiske eller pro-apoptotiske rolle af c-Myc i gliom cancer stamceller, vi kvantificeret apoptotiske cellepopulationer efter knockdown af c-Myc. Annexin V-farvning afslørede, at depletion af c-Myc-induceret apoptose i CD133 + gliom-celler, hvorimod kontrol- CD133 + celler indeholdt en minimal apoptotisk population (figur 5A, C). I modsætning hertil CD133- befolkningen havde kun baggrundsfarvning af Annexin V uanset c-myc-niveauer. I overensstemmelse med disse data, blev den kombinerede caspase 3/7 aktivitet forøget i CD133 + celler efter c-myc knockdown, men ikke i matchede CD133- celler (figur 5B, D). Taget sammen antyder disse data, at c-myc er en overlevelsesfaktor for gliom cancer stamceller.

(A, B) T3359 og (C, D) T4597 CD133- og CD133 + celler blev isoleret og inficeret som beskrevet . (A, C) Seks dage efter infektion blev cellerne trypsiniseret og kvantificeret for apoptose ved anvendelse af Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit (Calbiochem). Procentdelen af ​​FITC positive celler blev bestemt ved FACS-analyse, og døde celler blev udelukket ved propidiumiodid-farvning. (B, D) Disse celler blev også udpladet i plader med 96 brønde ved 5000 celler per brønd for CD133- celler og 1000 celler per brønd for CD133 + celler efter infektion og selektion. Seks dage efter infektion blev kombinerede aktiviteter af caspase 3 og caspase 7 bestemmes af Caspase 3/7 Luminescens (Promega), og blev normaliseret ved de levedygtige celleantal bestemt af CellTiter-Glo assays som beskrevet i figur 4. * , p. 0,05 med envejs ANOVA sammenligning af kontrolgrupperne til de tilsvarende c-myc knockdown grupper

Tab af c-myc svækker neurosfære-dannelse ved gliom cancer stamceller

Deling visse centrale karakteristika ved normale stamceller, kræft stamceller er i stand til selv-fornyelse, som giver vedvarende vedligeholdelse af denne delpopulation og udvidelse af hele tumor. Serial neurosfære dannelse assay er blevet anvendt som et surrogat for selvfornyelse kapacitet af neurale stamceller [34], og blev for nylig anvendt i hjernetumor stamceller [9], [28]. I primære neurosfære formation assays, blev ca. 15% af kontrol CD133 + -celler dannede neurosfærer, hvorimod meget få sfærer dannet af celler udtømt for c-Myc (figur 6A). Neurosfærer udviklet i 100% af brønde i kontrolgruppen når udpladet med en tæthed på 100 celler /brønd og i 80-85% brønde når udpladet ved 10 celler /brønd (figur 6B). I modsætning hertil blev neurosfærer dannet af celler udtømt for c-myc ekspression i kun 10% (shRNA-1) eller 30% (shRNA-2) af brønde, når udpladet med en tæthed på 100 celler /brønd, mens der ikke sfærer blev fundet, når disse celler blev udpladet ved 10 celler /brønd. Notatet neurosfærer dannet af celler med reduceret c-myc-ekspression var markant mindre end de dannet af kontrol celler (Figur 6C) og blot kugler mødtes de minimale kriterier, der skal scoret i vores eksperimenter. Mangel på neurosfærer dannet af gliom cancer stamceller forarmet af c-myc foreslår nedsat selvfornyelse. Imidlertid blev vurderingen sekundær neurosfære dannelse udelukket fordi meget få sfærer blev frembragt i de knockdown grupper i den primære assay og neurosfærerne havde begrænset levedygtighed. Disse undersøgelser kunne derfor ikke helt afgøre, om c-myc-ekspression er nødvendig for selv-fornyelse af gliom cancer stamceller. Det forventes dog, at selv-fornyelse af gliom cancer stamceller hæmmes af knockdown af c-myc, baseret på vores observationer, at gliom kræft stamceller undladt at formere og undergik apoptose ved knockdown af c-myc.

(A) T3359 CD133 + celler blev inficeret med lentivirus og selekteres som beskrevet. Celler blev derefter udpladet ved 100 eller 10 celler per brønd i plader med 24 brønde i nærvær af 1 ug /ml puromycin. Otte brønde blev udpladet for hver gruppe. Antallet af neurosfærer i hver brønd blev bestemt i syv dage. Kugler, der indeholdt mere end 20 celler blev scoret. (B) Procentdel af brønde uden neurosfærer dannet blev kvantificeret. #, S 0,001 med en-vejs ANOVA sammenligning af kontrolgrupperne til de tilsvarende c-myc Knockdown grupper. (C) Repræsentative fotografier af neurosfærer dannet af celler, der udtrykker ikke-målrettet shRNA eller c-myc specifikke shRNA (barer = 50 um). (D, E) Lignende resultater blev påvist i T4302 CD133 + celler.

Knockdown af c-myc hæmmer tumorigent potentiale af gliom cancer stamceller

På baggrund af kravet om c- myc aktivitet for cellecyklusprogression, vækst og overlevelse, af CD133 + gliomceller i kultur, undersøgte vi rollen af ​​c-myc-ekspression i deres tumorigene potentiale. CD133 + gliomceller blev inficeret med ikke-targeting kontrol lentivirus eller lentivirus udtrykker c-Myc shRNA. Efter puromycinselektion blev 5000 celler af hver gruppe injiceres ind i hjernen på nøgne mus i fire eksemplarer. 100% af mus med kontrol celler hurtigt udviklede neurologiske tegn og vises store tumorer på histopatologi sammensat af pleomorfe celler featuring høj nukleare til cytoplasmatiske nøgletal, fremtrædende nucleoli med minimal cytoplasma, rask mitotisk aktivitet og central geografisk nekrose, i overensstemmelse med en høj kvalitet glial malignitet ( Figur 7). I modsætning hertil ingen mus injiceret med celler udtømt for c-myc ekspression udviklet tegn og efter 100 dage viste ingen tegn på neoplastiske celler (figur 7). Således c-Myc synes at være essentiel for cancer stamceller til at danne tumorer.

(A) T3359 CD133 + celler blev inficeret og selekteret som beskrevet. Efter selektion blev cellerne injiceret i hjernen hos athymiske BALB /c nu /nu mus (5000 celler per mus). Fire mus blev injiceret for hver gruppe. Mus i kontrolgruppen blev aflivet på udviklingen af ​​neurologiske tegn. Alle mus, der bærer c-myc knockdown gliomceller udviklede ikke neurologiske tegn og blev aflivet efter 100 dage uden tegn på tumor. Kaplan-Meier overlevelseskurver vises. (B) Repræsentative fotografier af hæmatoxylin og eosin farvning af intrakranielle xenotransplantattumorer (10 ×). (C) xenograftvæv for kontrolgruppen sammensat af pleomorfe celler med høj kerne og cytoplasma-forhold, fremtrædende nucleoli med minimal cytoplasma, rask mitotisk aktivitet og central geografisk nekrose (asterisk, 600 ×). (D) Kontrollen gliom xenograft udstillet fokusområder for bedre differentierede tumorceller med relativt mere eosinofil cytoplasma og celler med excentriske cytoplasmatiske profiler, der tyder på en gemistocytic udseende (pile, 400 ×). (E) xenograft tumor i kontrolgruppen udviser infiltration af tumorceller i det omgivende hjernevæv langs marginen. Det mitotisk aktive (pilespids) infiltrerende tumorceller udviser høj nukleare til cytoplasmatiske nøgletal og aflange fibrillær cytoplasma (pil) (600 ×). (F) mus hjernen injiceret med T3359 celler, der udtrykker c-myc shRNA viste ingen tegn på tumor på nålens injektionsstedet (pile, 200 ×).

Diskussion

Stammen kræft celle hypotese har affødt betydelig kontrovers, men tilstedeværelsen af ​​heterogenitet af tumorceller i nogle kræftformer er velkendt. Tumorceller, som udviser stamcelle-lignende egenskaber og initiere xenotransplantattumorer er blevet oprenset fra et stigende antal af cancere, herunder leukæmi [35], [36], hjerne [28], [29], bryst [37], kolorektal [38 ], [39], pancreas [40], og hoved og hals kræft [41]. Disse cancer stamceller er funktionelt defineret gennem analyser af selvfornyelse og seriel xenotransplantation analyser i gnavermodeller. Eksperimenter viser, at tumorigent potentiale af cancer stamceller er mindst flere størrelser højere end bulk tumorer. For eksempel, gliom cancerstamceller beriget ved udvælgelse af CD133 overfladeantigen danner ortotopisk xenotransplantattumorer med 500 celler i athymiske nøgne mus, mens 2 × 10

6 CD133- celler ikke kan [9]. I overensstemmelse med den potente tumorgenicitet hjernesvulst stamceller, viste vi her, at CD133 + gliom kræft stamceller kraftigt udtrykt c-Myc oncoprotein. FACS-analyse viste, at mindst halvdelen af ​​CD133 + -celler akut dissocieret fra humane kirurgiske biopsiprøver havde høje niveauer af c-Myc, mens hovedparten ( 85%) af CD133- celler blev c-myc-lav (figur 1D). Lignende co-ekspression af c-myc og en stamcelle markør, Nestin, blev identificeret direkte på menneskelige kirurgiske biopsi eksemplar sektioner (Figur 1E). Især gliom cancerstamceller udtrykker c-Myc shRNA beholdt stadig restniveauer af c-myc-protein (figur 2B, bane 5 og 6), der var højere end c-myc niveauer, der findes i CD133- celler, der udtrykker ikke-targeting shRNA (figur 2B, bane 1). Ikke desto mindre, de reducerede niveauer af c-myc var ude af stand til at understøtte proliferation, vækst, overlevelse og tumorigenese af gliomer cancer stamceller. En nylig musemodel for T-cellelymfom hjælp konditionelt udtrykte c-Myc også antyder, at vis tærskel niveau af c-Myc er nødvendig for at opretholde tumor fænotype [42]. Kollektivt, vores resultater fremhæve et nødvendigt krav om høj c-myc-ekspression i gliom cancer stamceller.

Der er blevet foreslået Kræft stamceller som langsomt cykling celler, ligesom deres somatiske stamceller modstykker [43]. Hurtige ekspansion af tumorer er så afhængige af de hurtigt delende stamfaderceller. Den langsomme cellecyklus kan give kræft stamceller en beskyttende mekanisme mod visse terapeutiske metoder, der er målrettet hurtige prolifererende celler. For eksempel i human akut myeloid leukæmi, de hvilende leukæmi stamceller er resistente over for kemo-lægemidler, afhængig af cellecyklus [44]. Ikke desto mindre kan karakteristika af kræft stamceller ikke nødvendigvis ens på tværs af forskellige typer kræft, og biologi cancer stamceller kan ændre sig i hele forskellige tumor udvikling. I hjernetumorer, Singh og medarbejdere først viste, at kun CD133 + kræft stamceller befolkning formere

in vitro

når akut isoleret fra humane kirurgiske biopsipræparater [28], [29]. Disse resultater svarede til de stærkt proliferative cancer stamceller, der blev karakteriseret i et RAS-induceret zebrafisk embryonal rhabdomyosarcom [45]. I den foreliggende undersøgelse, vi fastslået, at CD133 + gliom celler indeholdt en højere procentdel af S-fase celler og voksede hurtigere

in vitro

end matchede CD133- celler (figur 3 og 4). Vi fandt også, proliferation og vækst af gliomer cancer stamceller blev alvorligt svækket ved knockdown af c-Myc, men vigtigere, cellecyklusprogression af CD133- gliomceller var relativt ufølsomme over for tab af c-Myc. De transkriptionelle programmer reguleret af c-myc forbliver dårligt defineret og afhængig af celle tilstand [26], [46], men omfatter induktion af cyklin D

1 [47] og undertrykkelse af p21

WAF1 /CIP1 cyclin- afhængig kinase inhibitor [48], [49]. Konsekvent, ekspression af cellecyklus regulatorer nedstrøms for c-myc, herunder p21

WAF1 /CIP1 og cyclin D

1, blev ændret i gliom cancer stamceller efter c-myc knockdown, men ikke i CD133- celler. Disse data afdække en specifik rolle af c-Myc og dens downstream målgener ved regulering proliferation og vækst af CD133 + gliom cancer stamceller.

Apoptose kan induceres ved afvigende ekspression af visse onkogener, såsom c-Myc og E2F1, der kan fungere som en “fail-safe” mekanisme til at udrydde potentielle cellulær transformation [33], [50]. Apoptose induceret af c-Myc kan medieres gennem aktivering af ARF-MDM2-p53 pathway, eller ved at aktivere dødsreceptorer, såsom CD95 /Fas [33]. Imidlertid deregulering af c-Myc er almindelig i humane tumorer og er en indikator for dårlig prognose fordi tumorer er godt udstyret med forskellige anti-apoptose-mekanismer, der kan neutralisere den apoptotiske tryk indført ved c-Myc. Tumorigenese i c-myc transgene musemodeller accelereres hvis de kombineres med andre anti-apoptose-genetiske ændringer, såsom overekspression af Bcl-2 [51] eller Bmi1 [52], eller afbrydelse ARF-MDM2-p53 pathway [53]. Yderligere er det blevet påvist, at direkte vedvarende c-Myc-aktivitet er påkrævet for tumor opretholdelse i en række af betingede transgene musemodeller. Disse modeller viser, at inaktivering af c-Myc næsten uundgåeligt resulterer i tumorregression uanset tumortype med samtidig vækstinhibering, differentiering og apoptose (gennemgået i [54]). I nogle tilfælde, såsom osteosarkom [55] og hudtumorer [56], kortfattet inaktivering af c-Myc er tilstrækkelig til at inducere vedvarende tumorregression. afhængigheden af ​​c-Myc kan imidlertid være tumor-typespecifik. I visse betingede transgene modeller, reaktivering af c-Myc efter transient forstyrrelse genskaber tumorvækst [57], som kan involvere aktivering af hvilende cancer stamceller. Alternativt kan tumorer tilbagefald i en del af dyrene selv i fravær af c-Myc-aktivitet, hvilket antyder, at cancer stamceller kan have akkumuleret yderligere mutationer for at kompensere tab af c-Myc [58], [59], [60]. Den vedvarende tumorregression kan være forbundet med komplet udryddelse af cancer stamceller efter inaktivering af c-Myc, hvorimod cancer stamceller kan overleve og /eller flygte c-Myc afhængighed i tilbagevendende tumorer. Vores undersøgelse viste en markant induktion af apoptose efter c-Myc knockdown i cancer stamcellepopulation (figur 4), og de cancerstamceller udtømt for c-myc-ekspression ikke kunnet udvikle ortotopisk xenotransplantattumorer i nøgne mus (figur 6). Af særlig interesse, overlevelse af de ikke-stamceller gliomceller var ikke afhængig af vedvarende ekspression af c-myc. I en række nyere studier i andre kræftmodeller, rettet mod c-myc-ekspression nedsat cellulær proliferation og induceret aldring [61], [62], [63]. Disse modeller kan repræsentere resultatet af tab af c-Myc i mere homogene cancer cellepopulationer, især gensplejsede modeller drevet af overekspression af c-Myc. Vores undersøgelse har stor betydning som målrette c-myc har unikke fordele specifikke for cellulære rum i modeller, der repræsenterer cellulær heterogenitet. Selvom målretning c-Myc var tilstrækkelig til at forhindre tumorvækst i vores studier, de dikotome virkninger af c-Myc-inhibering, som vi har opdaget, kan støtte behovet for samtidigt at målrette ikke-stamceller celle tumorer i at opnå klinisk effekt. Således c-myc som en molekylær mål skal gribes an med raffinement som de fleste af tumorceller kan vise begrænsede terapeutiske respons, men en kritisk tumor befolkning – de cancer stamceller – kan hæmmes eller dræbes for at forbedre den overordnede tumor kontrol og mindske modstanden mod andre behandlingsformer.