PLoS ONE: Overekspression af Nuclear apoptoseinducerende faktor 1 Altered den proteomprofilen for Human Gastric Cancer Cell MKN45 og Induceret cellecyklusstop ved G1 /S fase

Abstrakt

Nuklear apoptose-inducerende faktor 1 (NAIF1) blev tidligere rapporteret at inducere apoptose. Endvidere ekspressionen af ​​NAIF1 var signifikant nedreguleret i humane gastriske cancervæv sammenlignet med hosliggende normale væv. Imidlertid er den mekanisme, hvormed den NAIF1 genet inducerer apoptose ikke fuldt klarlagt. Vores resultater viser, at NAIF1 minimalt blev udtrykt i alle de testede gastriske cancercellelinier. Vore data viser også, at NAIF1 er lokaliseret i kernerne i celler som detekteret ved overvågning af grøn fluorescens af NAIF1-GFP-fusionsproteinet med fluorescerende konfokal mikroskopi. Dernæst blev en sammenlignende proteom tilgang, der anvendes til at identificere den differentielle ekspression af proteiner mellem gastriske cancercellelinier MKN45 /NAIF1 (-) og MKN45 /NAIF1 (+). Vi fandt fem proteiner (proteasom 26S subunit 2, proteasom 26S subunit 13, NADH dehydrogenase Fe-S protein 1, chaperoninbindingsdomænet indeholdende TCP1 subunit 3 og thioredoxin reduktase 1), som var opreguleret og tre proteiner (ribonucleaseinhibitor 1, 14-3- 3 protein epsilon isoform og apolipoprotein AI bindende protein), der blev nedreguleret i MKN45 celler, der overudtrykker NAIF1. Vi opdagede også, at NAIF1 kunne inducere standsning af cellecyklus ved G1 /S-fase ved at ændre ekspressionen af ​​cellecyklusproteiner cyclinD1, cdc2 og p21. De differentielt udtrykte proteiner identificeret her er relateret til forskellige cellulære programmer med cellecyklus, apoptose, og signaltransduktion regulering og antyder, at NAIF1 kan være en tumor suppressor i gastrisk cancer. Vores forskning dokumenterer, at belyser rolle hvordan NAIF1 funktioner i mavekræft

Henvisning:. Yang M, Zhong J, Zhao M, Wang J, Gu Y, Yuan X, et al. (2014) Overekspression af Nuclear apoptoseinducerende faktor 1 Altered den proteomprofilen for Human Gastric Cancer Cell MKN45 og Induceret cellecyklusstop ved G1 /S fase. PLoS ONE 9 (6): e100216. doi: 10,1371 /journal.pone.0100216

Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ‘, Italien

Modtaget: Oktober 27, 2013; Accepteret: 23. maj 2014 Udgivet: 13 juni 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af National Key Basic Research Program Kina (2007CB914700). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er en af ​​de mest almindelige maligne sygdomme i verden forårsager ca. 8% og 10% af de årlige tilfælde og kræftdødsfald henholdsvis. Ifølge verdensomspændende epidemi rapport fra World Health Organization, er næsten en million gastriske kræfttilfælde og 738.000 dødsfald skønnes at have fundet sted i 2008 [1], [2]. Der er taget mange anstrengelser i klinisk; imidlertid mortalitet mavecancerpatienter er stadig så høj som 70% [2]. En af årsagerne til denne høje dødelighed er, at gastrisk kræftpatienter ofte ikke diagnosticeret indtil fremskredent stadium, hvilket er for sent at give effektiv behandling. Der er derfor et klart behov for at finde nye biomarkører og effektive strategier for tidlig diagnosticering og behandling af mavekræft.

Proteomics er blevet brugt i mange forskningsområder, herunder kræftforskning. Fælles prøver i proteomisk analyse for kræftforskning omfatter væv og blod fra kræftpatienter, samt kræft cellelinjer med forskellige baggrunde eller forskellige behandlinger [3] – [6]. Disse proteomikanalyser blev brugt til at undersøge oprindelsen og udviklingen af ​​kræft eller at lede efter diagnostiske biomarkører. De resultater, vi opnåede gennem proteomiske metoder ikke kun på grund af direkte regulering af transkriptionel niveau, men også afspejle post-translationelle modifikationer af proteiner [3], [7]. Derfor kan vi analysere både ekspression og regulering af protein med proteomikanalyser. Trods masser af nye teknikker, har 2-dimensionel elektroforese kombineret med massespektrometri forblev den mest anvendte metode til proteomisk analyse.

Den menneskelige gen, der koder for nuklear apoptose-inducerende faktor 1 (NAIF1) er placeret på kromosom 9q34.11 . NAIF1 koder for et protein med en

Myb

-lignende domæne i den N-terminale region [8], [9]. Tidligere undersøgelser har vist, at overekspression af NAIF1 i humane cancercellelinjer HeLa og MKN45 inducerer apoptose [8], [10]. . Desuden Luo

et al

fandt, at NAIF1 væsentligt udtrykkes ved normal gastrisk væv, mens dens udtryk er nedreguleret eller tabt i gastrisk cancer væv (

P

0,001). Desuden NAIF1 udtryk var højere i veldifferentieret (

P

= 0,004) end i moderately- eller dårligt differentieret mavekræft [10]. Imidlertid rolle NAIF1 ved regulering af cellulær proteinekspression profil er ukendt.

I den foreliggende undersøgelse anvendte vi proteom teknologi baseret på 2-dimensional elektroforese kombineret med MALDI-TOF massespektrometri til at identificere proteiner associeret med biologiske funktioner NAIF1. Proteinekspressionen profiler af den gastriske cancercellelinie, MKN45 med eller uden NAIF1 overekspression blev analyseret og sammenlignet ved anvendelse 24 cm pH 3-10 NL range immobiliseret pH-gradient (IPG) strimler. For at validere disse data, målte vi RNA ekspressionsniveauer af alle de forskelligt udtrykte proteiner og tre proteiner blev yderligere bekræftet ved Western blotting. Vores resultater viser, at NAIF1 inducerer standsning af cellecyklus ved G1 /S-fase ved at regulere ekspressionsniveauerne af cyclinD1, cdc2 og p21-protein. Resultaterne af vores undersøgelse kan føre til en bedre forståelse af, hvordan NAIF1 arbejder inducere apoptose og også kan kaste lys over den diagnose og behandling af gastrisk kræft i fremtiden.

Materialer og metoder

celledyrkning og transfektion

Humane gastriske cancercellelinier MKN45, BGC823, AGS og SGC7901 blev opnået fra tumorcellen Bank of Chinese Academic of Medical Sciences og dyrket i flydende Dulbeccos minimale essentielle medium (DMEM) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 100 IU /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære. DNA-transfektion blev udført ved anvendelse af X-tremeGENE HP DNA-transfektionsreagens (Roche, Schweiz) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

Ekspressionsplasmider

Ekspressionsplasmiderne pEGFP-N1-NAIF1, som udtrykker et NAIF1-GFP-fusionsproteinet, og pEGFP-N1, som udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP), blev venligst stillet til rådighed af Dr. Qing Luo [10].

cellecyklusfordeling analyse

Eksponentielt voksende celler blev transficeret med pEGFP-N1-vektoren eller pEGFP-N1-NAIF1 plasmid. Celler blev høstet ved 24 timer eller 48 timer efter transfektion, og 1 × 10

6 celler blev vasket to gange med phosphatbufret saltvand (PBS) og fikseret med 4% paraformaldehyd ved 4 ° C i 1 time. Efter centrifugering blev cellepellets resuspenderes i farveopløsning (0,05 mg /ml propidiumiodid (PI), 0,2 mg /ml RNase, og 0,1% Triton X-100) ved 4 ° C i 15 minutter i mørke. Flowcytometrianalyse for GFP og PI blev udført under anvendelse af en BD LSR II celle analysator (BD, San Jose, CA, USA). PI-fluorescens blev målt blandt GFP positive cellepopulation og afgivelsen af ​​de cellecyklus blev analyseret under anvendelse ModFit LT3.2 software. Tre separate prøver blev fremstillet, og alle assays blev udført tre gange.

Kvantificering af apoptose

Kvantificering af apoptose blev udført under anvendelse af PE Annexin V Apoptose Detektion Kit I (BD). Kort fortalt blev BGC823 eller MKN45 celler transficeret med pEGFP-N1-vektoren eller pEGFP-N1-NAIF1 plasmid. Efter 24 timer eller 48 timer efter transfektion blev cellerne høstet, vasket med koldt PBS to gange og derefter resuspenderet med bindingsbuffer (10 mM Hepes /NaOH (pH 7,4), 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCI

2) . De resuspenderede celler blev inkuberet med phycoerythrin (PE) konjugeret Annexin V (AV) og 7-amino-actinomycin (7-AAD), og derefter målt ved flowcytometri under anvendelse af BD LSR II celle analysator. kunne påvises fire distinkte cellepopulationer i et dot-plot: levedygtige celler (AV

– /7-AAD

-), tidlig-fase apoptotiske celler (AV

+ /7-AAD

– ), sen-fase apoptotiske celler (AV

+ /7-AAD

+) og nekrotiske celler (AV

– /7-AAD

+). Mindst 10.000 GFP-positive celler blev talt pr prøve, og data blev rapporteret som procentdelen af ​​apoptotiske celler (AV

+ /7-AAD

– og AV

+ /7-AAD

+ ) blandt det totale antal celler. Tre uafhængige prøver blev forberedt, og alle assays blev gentaget tre gange.

Konfokal scanning

Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne vasket tre gange med PBS og fikseret med 4% paraformaldehyd i 15 min. ved stuetemperatur. At øge permeabiliteten af ​​cellemembranen, blev celler inkuberet med 0,5% Triton X-100, efterfulgt af inkubation med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) at farve kerner. Cellulær fordeling af NAIF1 blev analyseret ved at overvåge den grønne fluorescens af NAIF1-GFP-fusionsproteinet under anvendelse af en Leica Microsystems Heidelberg GmbH mikroskop.

Protein forberedelse til 2-DE

For hver prøve 5 × 10

6 celler blev høstet og lyseret i 1 ml lysisbuffer (7 M urinstof, 2 M thiourinstof, 2% CHAPS, 20 mM DL-dithiothreitol (DTT), 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 30 mM natriumfluorid, og 0,25 mg /ml RNaseA) i 1 time ved stuetemperatur og derefter centrifugeret ved 4 ° C i 30 minutter. ved 12.000 rpm. Supernatanten blev overført til et nyt rør og koncentreret med 0,1 M NH

4COOH. Lysepuffer blev tilsat til et slutvolumen på 800 pi, og proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af et Bradford-assay (Tiangen, Beijing, Kina).

todimensional elektroforese

todimensional elektroforese blev udført som tidligere beskrevet [5]. Kort fortalt blev 1 mg af proteiner fortyndet til 450 gl med rehydrering buffer (7 M urinstof, 2 M thiourinstof, 2% CHAPS, og 20 mM DTT). IPG strimler (IPG, 24 cm, pH 3-10, NL, GE Limit.) Blev hydreret med de rehydrerede prøver i 18 timer ved stuetemperatur. Proteinerne blev udsat for isoelektrisk fokusering med en Ettan IPGphorIII (GE, CT, USA) successivt i 1 time ved 100 V, 1 time ved 250 V, 1 time ved 500 V, 1 time ved 1000 V, 1 time ved 3000 V, 1 time ved 5000 V, 2 timer ved 8000 V, og 6 timer ved 8000 V for at få i alt 80 Kvh. Efter isoelektrisk fokusering blev IPG-strimler ækvilibreret med ækvilibrering puffer I (6 M urinstof, 150 mM Tris-HCI (pH 8,8), 30% glycerol, 2% SDS, 1% DTT) i 15 min. efterfulgt af en anden inkubering med et andet ækvilibrering buffer II (6 M urinstof, 150 mM Tris-HCI (pH 8,8), 30% glycerol, 2% SDS, 2,5% iodacetamid) i 15 min. Den anden dimension af SDS-PAGE blev udført med 12,5% SDS-PAGE geler ved hjælp af Ettan Dalt SIX lodrette systemer (GE).

Gel farvning og billedanalyse

SDS-PAGE geler blev fikseret i fastsættelse-buffer (10% CH

3COOH, 40% C

2H

5OH, og 50% Hedeselskabet

2O) i 30 min. Gelerne blev derefter vasket i ddH

2O i 10 min. 3 gange og farvet med Coomassie blue G-250.

Gelerne blev scannet med en billedopløsning scanneren med MagicScan software til at evaluere pletmønstre. Imagemaster platin-software (version 5,0) blev anvendt til at analysere gelbilleder. De pletter, som blev observeret på både kontrol- gel og NAIF1 gel blev analyseret, og intensiteten af ​​hver plet blev kvantificeret ved beregning af stedet volumen efter normalisering af gelen billedet. Kvantitativ analyse af gel billeder (tre gentagelser /prøve) blev taget og pletter med statistisk signifikant forskel (t-test, *

P

0,05). Blev skåret ud og fordøjet til identifikation

Protein identifikationer

differentielt udtrykte protein spots blev udtrukket og de-farvet i 50 mM NH

4HCO

3 /acetonitril (50/50) og tørret ved vakuum centrifugering. Gelstykkerne blev derefter spaltet med 10 ng /ml trypsin (Promega, WI, USA) i 50 mM NH

4HCO

3 puffer ved 37 ° C natten over. Den trypsin væske blev overført til et rent rør, fortyndet med 100 ul 60% acetonitril /0,1% trifluoreddikesyre og behandlet med ultralyd i 15 minutter, tre gange. Alle de erhvervede væske blev opsamlet og vakuumtørret og opbevaret ved -80 ° C. De eluerede peptider blev analyseret under anvendelse af et Bruker Ultraflex MALDI-TOF /TOF udstyret med SCOUT kilde ved BGI-Beijing. Resultaterne af massespektrum blev kontrast mod pattedyr sekvenser fra (ikke-redundant) database NCBInr for peptid masse fingeraftryk identifikation.

RNA Isolation, RT og Real-time Q-PCR

Total RNA var ekstraheret ved anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens protokol. cDNA blev syntetiseret ved revers transkription under anvendelse af 1 ug total RNA med oligo (dT)

18 primere og M-MuLV revers transkriptase (TAKARA).

I omvendt transkriptionelle PCR, primere til NAIF1 og β-actin var som følger: NAIF1 forstand, 5’AGCCACGGTCACCCTGACACA-3 ‘, og anti-sense, 5’CGTGTCTGCATGCTGGGCCAT-3’; p-actin sense, 5’GGGCACGAAGGCTCATCATT-3 ‘, og anti-sense, 5’AGCGAGCATCCCCCAAAGTT. Alle primere blev designet ved hjælp NCBI blast og købt fra Sangon, Beijing.

Kvantitativ PCR blev udført med SYBR Green qPCR Kit (TAKARA, Japan) med en 20 pi reaktion, der er oprettet i henhold til fabrikantens anvisninger. Målgenekspression blev analyseret under anvendelse passende realtid qPCR primere (tabel 1). β-actin blev anvendt til normalisering. Real-time qPCR blev udført på en ABI7300 cyklusapparat (ABI, MA, USA) med følgende betingelser: denaturering i 30 s ved 95 ° C, efterfulgt af 40 cykler denaturering i 5 s ved 95 ° C, og forlængelse i 31 s ved 60 ° C. Smeltekurveanalyse blev udført i slutningen at validere specificiteten af ​​det forventede PCR-produkt. Relative ekspression blev beregnet ved anvendelse af de to standard curve metoder. Tre uafhængige prøver blev fremstillet for hver tilstand og hvert eksperiment blev udført tre gange.

Western Blotting

Western blotting blev udført som tidligere beskrevet. Kort fortalt blev 2 × 10

6 celler høstet med mediestrøm, pelleteret ved centrifugering i 5 minutter ved 500

g

, og vasket 3 gange med PBS. Cellerne blev derefter lyseret med 100 pi lysisbuffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,5% NP-40, 0,1% SDS og 50 ug /ml PMSF, med frisk tilsat proteinase inhibitor cocktail) på is i 30 min. Lysater blev centrifugeret ved 13.000 rpm i 15 min. og proteinkoncentrationen blev målt ved anvendelse Bradford metoder. Halvtreds mikrogram proteiner blev separeret på 12% SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid-membraner. Membranerne blev blokeret med 5% BSA i TBST i en time ved stuetemperatur efterfulgt af inkubation med primært antistof opløsninger ifølge producentens instruktioner (β-actin, 1:5000, Sigma; NAIF1, 1:1000, Santa Cruz; 14- 3-3 ε, 1:500, Santa Cruz, TCP1-γ, 1:1000, Abcam, TXNRD1, 1:1000, Abcam, CyclinD1, 1:1000, CST, cdc2, 1:500, CST, og p21, en :500, CST). Membranerne blev vasket 3 gange med TBST, efterfulgt af inkubation med passende sekundære antistoffer i to timer ved stuetemperatur. Signalerne blev påvist ved anvendelse af ECL Chemiluminescence systemet. β-actin blev anvendt som kontrol.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Data blev udtrykt som middelværdi ± SD. Den t-test blev anvendt til statistisk sammenligning. En tilhørende værdi på

P.

0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Transficerede NAIF1 lokaliseret i nucleus

Begge omvendt transkriptionelle PCR og Western blotting eksperimenter viste, at NAIF1 minimalt blev udtrykt i gastrisk cancer cellelinjer, MKN45, BGC823, AGS, og SGC7901; henviser NAIF1 blev let detekteret, da den blev transficeret ind i cellerne (fig. 1A og B). Transficerede vi en NAIF1-GFP-fusion konstruktion til MKN45 og BGC823 celler og et GFP-vektoren blev anvendt som kontrol. Konfokal mikroskopi viste, at når celler blev transficeret med pEGFP-N1-NAIF1 konstrukt blev grøn fluorescens detekteret kun i kerner; tværtimod blev den grønne flurescent signal detekteret i hele celle, når transficeret med GFP-vektoren (fig. 1C). De samme resultater blev også observeret i andre cellelinjer, såsom BGC823 (fig S1). Disse resultater bekræftede, at transficerede NAIF1 protein er lokaliseret i kernen.

(A) Reverse transkriptionel PCR viser NAIF1 ikke udtrykkes på RNA-niveau i de testede celler. Plasmid indeholdende NAIF1 genet blev anvendt som en skabelon for den positive kontrol og ddH

2O blev anvendt som template for negativ kontrol. (B) Western-blotting viste, at NAIF1 ikke udtrykkes på proteinniveauet i de fire testede gastriske cancercellelinier. MKN45 celler, der overudtrykker NAIF1-GFP-fusionsproteinet blev anvendt som positiv kontrol. Den transficerede NAIF1 bånd blev detekteret mellem proteinet molekylvægtmarkører 55 og 75 kD; mens blev detekteret nogen bånd mellem 40 og 55 kD, som er den forudsagte position af NAIF1 proteinet. (C) Subcellulær fordeling af NAIF1. MKN45 celler blev transficeret med enten NAIF1-GFP-fusion konstrukt eller GFP-vektoren. De øverste tre billeder repræsenterer NAIF1-GFP-fusionsproteinet udsendes udelukkende i kerner, mens billederne nedenfor repræsenterer GFP er fordelt i hele cellen.

NAIF1 induceret cellecyklusstandsning ved G1 /S-fase

cellecyklus profil af gastriske cancerceller under påvirkning af NAIF1 blev undersøgt næste. GFP-positive celler blev analyseret for at sikre den korrekte population blev anvendt (Figur S2). Flowcytometrisk analyse viste, at NAIF1 inducerede en væsentlig ændring i fordelingen af ​​cellecyklussen: en forøgelse af cellepopulationen i G0 /G1-fasen og et fald i S-fasen blev observeret i celler, der overudtrykker NAIF1 sammenlignet med celler transficeret med tom vektor, både efter transfektion 24 timer og 48 timer. Som vist i fig. 2A, flowcytometri afslørede, at 24 timer efter transfektion, ca. 54% af BGC823 celler transficeret med pEGFP-N1-vektoren var i G0 /G1-fasen, og 34% og 12% af cellerne var i S-fasen og G2 /M-fase, henholdsvis . På den anden side, i BGC823 celler transficeret med pEGFP-N1-NAIF1 konstruere der var en klar stigning i procentdelen af ​​celler i G0 /G1-fasen (74%), såvel som en nedgang i procentdelen af ​​celler i S-fase (26%) og G2 /M-fase (0%). Otteogfyrre timer efter transfektion, cirka 36% af de BGC823 kontrolceller var i G0 /G1-fasen, og 59% og 5% af cellerne er i S-fasen og G2 /M-fasen. I BGC823 celler transficeret med pEGFP-N1-NAIF1 opføre, ca. 55% af cellerne var i G0 /G1-fasen, og 37% og 8% af cellerne var i S-fasen og G2 /M-fasen, hhv. I MKN45 celler, 24 timer efter transfektion, ca. 56% af cellerne transficeret med pEGFP-N1-vektoren var i G0 /G1-fasen, og 29% og 15% af cellerne var i S-fasen og G2 /M-fasen, hhv. Ca. 76% af MKN45 celler transficeret med pEGFP-N1-NAIF1 konstruktion var i G0 /G1 fasen, og de procentdele af celler i S-fasen og G2 /M fase blev reduceret til 24% og 0%, hhv. Otteogfyrre timer efter transfektion, ca. 43% af MKN45 kontrolceller var i G0 /G1-fasen, og 43% og 14% af cellerne var i S-fasen og G2 /M-fasen, hhv. I MKN45 celler transficeret med pEGFP-N1-NAIF1 opføre, ca. 56% af cellerne var i G0 /G1-fasen, og 28% og 16% af cellerne var i S-fasen og G2 /M-fasen, henholdsvis (fig. 2B). Disse resultater viser klart, at overekspression af NAIF1 induceret cellecyklusstop ved G1 /S fase af gastriske cancerceller BGC823 og MKN45.

(A) og (B) kolonner viser forskellige cellecyklusfordeling mellem celler transficeret med NAIF1 og med GFP-vektoren 24 timer eller 48 timer efter transfektion i (A) BGC823 celler og (B) MKN45 celler. For at sikre den rette befolkning blev GFP-positive population analyseres. * Signifikant forskel (

P

0,05). (C) Western blotting viser ændringen i cellecyklus regulering proteiner associeret med NAIF1 induceret G1 /S-fase cellecyklusstandsnings. β-actin blev anvendt som kontrol. Kvantificerede data er vist som middelværdi ± SD (n = 3); Signifikant forskel fra NAIF1 overekspression gruppe, Students t-test, * P. 0,05

For at klarlægge den mekanisme, hvormed NAIF1 induceret cellecyklusstop undersøgte vi de mulige roller cyclinD1, p21 og cdc2 proteiner , som er vigtige i cellecyklusregulering i G1 /S-fase. Otteogfyrre timer efter transfektion blev ekspressionsniveauerne af cyclinD1 og cdc2 faldet i forhold til kontrolcellerne, både i BGC823 og MKN45 celler. Derudover blev ekspressionsniveauerne af p21 forøget (fig. 2C). Salg

Sammenlignende proteomanalyse af mavens cancercellelinie MKN45 med eller uden ekstra ekspression af NAIF1 protein

proteinprofiler af MKN45 celler transficeret med pEGFP-N1-NAIF1-konstruktioner som den behandlede gruppe eller med pEGFP-N1 vektor som kontrolgruppen blev målt ved 2-dE 48 timer efter transfektion. I alt blev over 700 spots løst, hvoraf 11 proteiner var 1,5 gange forskelligt udtrykt som bestemt ved analyse med Imagemaster version 5.0. De differentielt udtrykte protein pletter blev udskåret fra gelen, og 8 proteiner blev identificeret med MALDI-TOF /TOF-analyse. Repræsentativt behandlet gruppe og kontrolgruppe 2-DE-gel kort er vist i fig. 3A og de differentielt udtrykte protein spots er markeret. Megascopic 2-DE-gel billeder af hver af de differentielt udtrykte protein spots er repræsenteret i fig. 3B og 3C. Fem af proteinerne var opreguleret i den behandlede gruppe, herunder NADH dehydrogenase (ubiquinon) Fe-S protein 1 (NADUSF1), chaperoninbindingsdomænet indeholdende TCP1 subunit 3 (TCP1-γ), thioredoxin reduktase 1 (TXNRD1), proteasome 26S subunit 2 ( PSMC2) og proteasom 26S subunit 13 (PSMD13). 3 proteiner blev nedreguleret, herunder ribonucleaseinhibitor 1 (RNH1), 14-3-3 protein epsilon isoform (14-3-3 ε) og apolipoprotein A-I-bindende protein (APOAIBP). Tabel 2 viser specifikke oplysninger om disse proteiner og deres niveau af differentieret udtryk.

(A) Repræsentant 2-DE-kort over MKN45 celler transficeret med kontrol plasmid eller NAIF1. (B) og (C) Megascopic billeder og relative volumen intensitet af differentierede udtrykt proteiner. (B) Repræsenterer de up-reguleret protein point, mens (C) repræsenterer de ned-regulerede proteiner.

Validering af differentielt udtrykte proteiner

Real-time qPCR og vestlige blotting blev udført for at verificere de 2-dE-resultater. Genekspressionsniveauer af de identificerede proteiner blev analyseret ved real-time qPCR og er i overensstemmelse med de 2-DE-resultater, bortset fra ét protein, 14-3-3ε (fig. 4A). Tre proteiner blev udvalgt baseret på deres betydning og sandsynlige funktioner til yderligere analyse ved western blotting for at kontrollere de 2-DE-resultater. Resultaterne viser, at protein ekspressionsniveauerne af TXNRD1 og TCP1-γ blev forøget betydeligt i NAIF1 gruppen sammenlignet med kontrolgruppen (

P

0,05), mens det protein udtryk niveau på 14-3-3ε var signifikant nedsat i NAIF1 gruppen (

P

0,05) (Figur 4B.). Samlet set Western blot resultater er i overensstemmelse med 2-DE resultater.

(A) Kontrol af 2-DE resultater af real-time qPCR. * Signifikant forskel (

P

0,05) ** Signifikant forskel (

P

0,001). (B) Kontrol af 2-DE resultater ved western blotting og den relative volumen intensiteten af ​​differentierede udtrykt proteiner, ved hjælp af β-actin som kontrol. * Signifikant forskel (

P

0,05).

Diskussion

Der er udført flere undersøgelser til at beskrive NAIF1 gen; dog lidt om den proteomprofilen NAIF1 er overudtrykt. Formålet med den foreliggende undersøgelse var at påvise og identificere proteiner, hvis ekspression er ændret i MKN45 celler, der overudtrykker NAIF1. Endvidere er fremlagt dokumentation for at forklare, hvordan NAIF1 funktioner til at inducere celle apoptose og andre aktiviteter. En 2-DE-strategi blev anvendt i denne undersøgelse på grund af dens bekvemme metode og høj effektivitet. I alt vi påvist og identificeret 5-proteiner, der blev opreguleret og 3-proteiner, der blev nedreguleret i MKN45 celler, der overudtrykker NAIF1 sammenlignet med kontrolgruppen. De identificerede proteiner indebærer en række fysiologiske aktiviteter, såsom protein nedbrydning, styring af celle redox homeostase, cellecyklusprogression, cytoskeleton regulering, cellulært stress respons, apoptose og regulering af stofskiftet. Cellecyklus profil af gastriske cancercellelinjer BGC823 og MKN45 blev også undersøgt, og vores resultater viste, at overekspression af NAIF1 kan inducere standsning af cellecyklus ved G1 /S-fasen via ændring af ekspressionsniveauerne af regulering cellecyklusproteiner cyclinD1, cdc2 og p21 .

Resultater fra western blotting og omvendt transkriptionel PCR viste, at NAIF1 minimalt blev udtrykt i mavens kræftceller. Dataene præsenteres heri, er analog med Luo konklusion i væv [10]. Desuden har vi bekræftet, at NAIF1 er en nuklear protein i mavens kræftcellelinjer MKN45 og BGC823. Eftersom genomisk DNA findes hovedsagelig i kernen, Disse data antyder, at NAIF1 kan fungere i kernen ved interaktion med genomisk DNA og nukleoprotein for at påvirke ekspressionen af ​​gener og proteiner omfattende. Derfor udførte vi proteomanalyse at undersøge proteomisk profilering af MKN45 celler, der overudtrykker NAIF1.

Unormal regulering af cellecyklus er en bemærkelsesværdig egenskab ved cancerceller [11]. Undersøgelser har vist, at mange små molekyler kan aktivere cellecykluskontrolpunkter og inducere cellecyklus arrest, som tillader celler at reparere defekter. Imidlertid kan mislykket repairation føre til apoptose [12] – [15]. Vores resultater viser, at NAIF1 inducerer standsning af cellecyklus ved G1 /S-fase. Overgang fra G1 til S-fasen kræver aktivering af samlingen af ​​cyclinD-Cdk4 /6 og cyclin-cdc2 (også kendt som Cdk1). I mellemtiden p21 inhiberer aktiviteten af ​​Cdc2 og medierer montering og aktivering af cyclinD-cdk4 /6 i cytoplasmaet, samt inhibering deres aktivitet i kernen [16]. I denne undersøgelse western blotting-analyse påvises, at protein ekspressionsniveauer af cyclinD1 og cdc2 blev reduceret, mens proteinet ekspressionsniveauet af p21 blev forøget i celler, der overudtrykker NAIF1. Disse resultater antyder, at G1 /S cellecyklusstandsning induceret af NAIF1 medieres gennem p21 og cyclinD1 pathway. Derudover demonstrerede vi, at 48 timer efter transfektion populationen af ​​apoptotiske celler øgedes ca. 10% i celler, der overudtrykker NAIF1 som følge af standsning af cellecyklus (fig S3).

26S proteasomet er en konservativ organel i alle eukaryote celler og den er ansvarlig for intracellulær proteinnedbrydning [17]. Proteiner, der nedbrydes af 26S-proteasomet er involveret i en række biologiske processer, herunder apoptose, cellecyklus, og vækst og regulering af ekspressionen af ​​mange gener, som igen regulerer andre processer [18]. Forstyrrelse af proteinet nedbrydning ligevægt fører til oprindelsen og udviklingen af ​​kræft. , 26S proteasomet er således et attraktivt cancerterapi target. Her fandt vi, at to underenheder af 26S proteasomet, PSMC2 og PSMD13, var begge opreguleret i MKN45 celler, der overudtrykker NAIF1. PSMC2 og PSMD13 er underenheder af 19S proteasomet, som er den regulerende partikel (RP) af 26S-proteasomet. PSMC2 er en ATPase mens PSMD13 er en ikke-ATPase. Nogle forskere mener, at 26S proteasomhæmning kan føre til apoptose af carcinomaceller, og proteasominhibitorer kunne anvendes til behandling af cancer [19] – [21]. En undersøgelse af Tan

et al.

Antyder, at tumornekrosefaktor (TNF) -α aktiverer 26S proteasomet system ved opregulering ekspressionsniveauerne af 26S proteasom underenheder [22]. TNF-α er et velkendt cytokin, som kan inducere apoptose i en række cancerceller, og nu anvendes i klinikken som et regionalt behandling af lokalt fremskreden bløddelssarkomer og metastase melanomer at undgå for amputation lemmer [23]. Ligesom TNF-α, NAIF1 også har evnen til at inducere apoptose, hvilket indebærer, at 26S-proteasomet kan være involveret i apoptose proces induceret af NAIF1.

Vore data viser også, at to proteiner, TXNRD1 og NDUFS1, er opreguleret af NAIF1. TXNRD1 regulerer redoxtilstand af protein thioler i pattedyrceller, og funktioner i både fremme og forebyggelse af cancer i forskellige former for carcinomer [24] – [27]. Der har ikke været nogen undersøgelser for at undersøge den rolle, TXNRD1 i mavekræft. Det er vores opfattelse, kan TXNRD1 deltage i undertrykkelsen af ​​mavekræft genesis eller opregulering af TXNRD1 kan være en adaptiv mekanisme som reaktion på oxidativt stress genereret ved overekspression af NAIF1. Den NDUFS1 genet koder for et 75 kDa Fe-S-subunit, som er en af ​​de syv mitokondriske underenheder af kompleks I [28]. Kompleks I er den største af de respiratoriske kæde enzymer og mangel på komplekse I er den vigtigste årsag til en række medfødte mitochondriske sygdomme, såsom Leigh-syndrom [29]. Derudover 75 kDa-underenheden af ​​kompleks I er en caspase substrat, som er involveret i den mitokondrielle apoptose pathway. Caspase spaltning af NDUFS1 er påkrævet for flere mitokondrielle forandringer forbundet med apoptose, herunder ATP-niveauer, ROS produktion og tab af plasmamembranintegritet og så videre [30]. Da NAIF1 inducerer apoptose gennem mitokondrie vej [8], vi hypotesen, at den opregulering af NDUFS1 deltager i apoptose proces fremkaldt af NAIF1.

TCP1-γ er blevet identificeret som en chaperonin i eukaryot cytosol. Tidligere forskning har vist, at TCP1-γ er betydelig udtrykt i tumorer i hepatocellulært carcinom i forhold til de parrede tilstødende ikke-maligne tumorvæv [31], [32]. Men forholdet mellem TCP1-γ og mavekræft er stadig ukendt, og der er behov for yderligere undersøgelse.

På den anden side, vi identificeret tre proteiner, 14-3-3ε, RNH1 og APOAIBP, der var ned- reguleret i MKN45 celler, der overudtrykker NAIF1. 14-3-3 er et protein familie bestående af multifunktionelle proteiner, som binder til og modulerer funktionen af ​​en lang række cellulære proteiner.