PLoS ONE: Høj ABCG4 Expression er associeret med dårlig prognose i ikke-småcellet lungekræft Patienter behandlet med cisplatin-Based Chemotherapy

Abstrakt

ATP-bindende kassette (ABC) transportører er forbundet med dårlig respons på kemoterapi, og giver en dårlig prognose i forskellige maligniteter. Men sammenhængen mellem ekspressionen af ​​ABC undergruppe G element 4 (ABCG4) og prognosen hos patienter med ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) er fortsat uklar. NSCLC vævsprøver (n = 140) og normale lunge vævsprøver (n = 90) blev resektion fra patienter med stadie II-IV NSCLC mellem maj 2004 og maj 2009. ABCG4 mRNA og protein udtryk blev detekteret ved RT-PCR, western blot, og immunhistokemi. Patienterne fik fire cyklusser af cisplatin-baseret post-kirurgi kemoterapi og blev fulgt op indtil den 31. maj

st, 2014. ABCG4 positivitet var højere i NSCLC end i normale lungevæv (48,6%

vs

. 0 %,

P

0,001) og ABCG4 udtryk var signifikant forbundet med dårlig differentiering, højere tumor node metastase (TNM) fase, og adenocarcinom histologiske type (alle

P

0,001). Univariate (HR = 2,284, 95% CI: 1,570-3,324,

P

0,001) og multivariat (HR = 2,236, 95% CI: 1,505-3,321,

P

0,001 ) analyser viste, at ABCG4 ekspression var en uafhængig faktor associeret med en dårlig prognose i NSCLC. Patienter med ABCG4-positiv NSCLC havde kortere median overlevelse end ABCG4-negative NSCLC (20,1

vs

43,2 måneder,

P

. 0,001). Den prognostiske betydning af ABCG4 udtryk var tydelig i etaper III og IV NSCLC. Afslutningsvis blev høj ABCG4 udtryk forbundet med en dårlig prognose hos patienter med NSCLC behandlet med cisplatin kemoterapi

Henvisning:. Yang G, Wang XJ, Huang LJ, Zhou YA, Tian F, Zhao JB, et al. (2015) Høj ABCG4 Expression er associeret med dårlig prognose i ikke-småcellet lungekræft Patienter behandlet med cisplatin kemoterapi. PLoS ONE 10 (8): e0135576. doi: 10,1371 /journal.pone.0135576

Redaktør: Gergely Szakacs, Ungarsk Academy of Sciences, UNGARN

Modtaget: 29 oktober, 2014 Accepteret: 23, 2015; Udgivet: 13 August, 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (tilskud nr 81.172.224). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

omkring 1,5 millioner nye tilfælde af lungekræft er diagnosticeret årligt på verdensplan, og omkring 85% af dem er ikke-lille-celle lungekræft (NSCLCs) [1]. I 2012, omkring 58% af tilfældene af NSCLCs fandt sted i de mindre udviklede lande [2]. Kirurgi anses for at være den bedste behandling mulighed, men resektion er kun potentiel kurativ for 20-25% af tumorer [1]. De fleste patienter vil præsentere med en uhelbredelig sygdom og står over for en 5-års relativ overlevelsesrate på 17% med de nuværende standardbehandlinger [3]. Postoperativ kemoterapi med eller uden strålebehandling, forbedrer overlevelsen med 4% i absolut 5-års overlevelse, som det fremgår af en meta-analyse [4].

I øjeblikket cisplatin-baserede kombination med kemoterapi er de mest effektive first-line behandlingsformer til behandling af NSCLC, ifølge National Comprehensive Cancer Network (NCCN) retningslinjer (version 4,2014) [5]. Men effekten af ​​kemoterapi er begrænset, med responsrater (RRS) på 20-35%, progressionsfri overlevelse (PFS) på 3.1-5.5 måneder, og den samlede overlevelse (OS) 7.4-11.3 måneder [6,7]. Derfor har forbedring resultater efter kemoterapi været en af ​​de mest udfordrende spørgsmål på vellykket behandling af lungekræft [8]. Dette er primært tilskrives resistens, som forekommer i stort set alle kræftformer og er en alvorlig hindring for succes kemoterapi [6,7]. Det erkendes i stigende grad, at primære og sekundære narkotika modstande udviklingslande i cancerceller er de mest grundlæggende årsag underliggende kemoterapi fiasko [6,7].

Lægemiddelresistens er som regel resultat af overekspression af ATP-bindende kassette (ABC) transportører [9,10]. ABC transportproteiner er optimale kandidater som biomarkører for forudsigelse af kemoterapi modstand og prognose efter kemoterapi [11,12]. ABC transportører er transmembrane proteiner, der letter translokation af heterogene stoffer over cellulære membraner ved at udnytte energien af ​​ATP-hydrolyse [13]. Til dato har mindst 48 humane ABC transportør gener blevet identificeret, og de er blevet opdelt i syv underfamilier (ABCA gennem ABCG) [14]. Blandt disse ABCA2, ABCB1 (også kendt som P-glycoprotein eller multilægemiddelresistens 1 (MDR1)), ABCB4, ABCB11, ABCC1-6, ABCC10, ABCC11, og ABCG2 (også kendt som BCRP eller MXR) har alle vist sig at være forbundet med udstrømning og transport af cytotoksiske lægemidler (strukturelt forskellige kemoterapeutiske stoffer og deres metabolitter) af lungekræft celler, hvilket reducerer intracellulære medikamentkoncentrationer [15]. ABCA1 er også blevet identificeret som mediere resistens i lungekræft og resistente lungekræft-cellelinjer [16]. I øjeblikket er P-gp (ABCB1), MRP1 (ABCC1), og ABCG2 anses for at være det vigtigste stof transportører for deres roller i multiresistens observeret i mange tumorer og cellelinjer [17]. Selvom opdagelse og anvendelse af inhibitorer for ABC transportører er blevet undersøgt i de seneste år, disse inhibitorer var ikke helt vellykket overvinde resistens [18]. Som et resultat, er identificering af nye ABC narkotika transportproteiner og undersøgelser af deres mekanismer og inhibitorer yderst berettiget og yderst vigtigt at evaluere nye mål for at overvinde resistens.

Flere undersøgelser har vist, at medlemmerne af ABCG ( eller hvid) underfamilie er forbundet med cellulære lipid transport og resistens [19-21]. ABCG5 og ABCG8 er højt udtrykt i epitelceller i tarmen og sandsynligvis virke som en heterodimer; de er blevet associeret med udstrømningen af ​​plantesteroler og kolesterol i galde [22,23]. Over-ekspression af ABCG2 fører til resistens af forskellige cancercellelinier til antitumorlægemidler [24]. ABCG4 er det fjerde medlem af “G” familie, og er placeret på kromosom 11q23.3. Dette gen koder for et 3874-bp-transskript, og dets ekspression er overvejende intracellulært [25], men det præcise intracellulær lokalisering er endnu ikke vist [26]. Faktisk kan de forskellige ABC transportører lokaliseres i cellemembranen på mitokondrier, på Golgi-apparatet, på det endoplasmatiske reticulum, eller i kernemembranen, hvor de deltager i forskellige cellulære processer [26]. Ifølge tidligere undersøgelser [27-30], ABCG4 udtryk i NSCLC fortsat uklar. Tidligere undersøgelser har vist, at ABCG1 og ABCG4 er ansvarlige for transport af kolesterol på high density lipoprotein (HDL) partikler [31,32], og overekspression af ABCG4 giver også modstand til alkyl-phospholipid-analoger (miltefosin, edelfosin, og perifosine ) i

Leishmania

[33]. Men hvorvidt ABCG4 spiller en væsentlig rolle i prognosen efter kemoterapi, og om det har potentiale funktion mediere resistens i lungekræft også være uklart. Derfor er den nuværende undersøgelse fokuserede på forståelse af udtryk og post-kemoterapi prognostisk værdi ABCG4 i NSCLC.

I denne retrospektive studie undersøgte vi udtryk for ABCG4 i NSCLC. Vi evaluerede også værdien af ​​ABCG4 protein til at forudsige overlevelse i NSCLC patienter behandlet med cisplatin-baseret kombination kemoterapi.

Materialer og metoder

Patienter og prøver

I alt 140 NSCLC vævsprøver (74 tilfælde af lunge pladecellekræft og 66 tilfælde af lunge adenocarcinom) og 90 normale lunge vævsprøver (placeret 5 cm fra de primære tumorer) opnået ved kirurgisk resektion ved Institut for Thoracic Surgery, Tang Du Hospital Affiliated til den fjerde Military Medical University (Xi’an, Kina) mellem maj 2004 og maj 2009, blev undersøgt i den foreliggende undersøgelse. Tumor og normale lungevæv blev høstet ved hjælp af sterile kirurgiske instrumenter

Patienterne var i alderen 45-76 år (gennemsnit ± SD: 60,76 ± 6,88 år).. Alle prøver blev gennemgået af patologer, og histologisk klassificering af tumorer blev udført ifølge Verdenssundhedsorganisationens kriterier. Tumorer blev klassificeret som fase II (n = 42), III (n = 56) eller IV (n = 42) i henhold til de NCCN retningslinjer (Version 4,2014) [5]. Klinisk-patologiske karakteristika for alle patienter blev registreret. Ingen patient havde fået kemoterapi, strålebehandling, bioterapi, eller enhver anden operation før lungekræft kirurgi. Alle patienter blev behandlet med cisplatin-baserede kombination kemoterapeutiske regimer betragtes som standard postoperative regimer for NSCLC [5]. Alle patienter fik fire cyklusser af cisplatin-baserede kombination kemoterapeutiske regimer (cisplatin 75 mg /m

2 dage 1 + gemcitabin 1250 mg /m

2 dage 1, 8, hver 21 dage /pemetrexed 500 mg /m

2 dage 1 hver 21 dage /docetaxel 75 mg /m

2 dage 1 hver 21. dag). Opfølgning blev censureret den 31. maj

st, 2014, med en samlet opfølgning på 60 måneder. Den dag, hvor kemoterapi startede blev betragtet som udgangspunktet for estimering postoperativ overlevelse

Alle prøver blev delt i to dele:. Den første del blev placeret i en 0,1% diethylpyrocarbonat (DEPC) vand-behandlet frysning rør og opbevaret ved -80 ° C; den anden del blev fikseret i 10% neutral bufferet formalin og derefter dehydreret for paraffin indlejring.

Undersøgelsen protokollen blev godkendt af den regionale etiske komité for Klinisk Forskning i fjerde Military Medical University. Alle patienter forudsat skriftligt informeret samtykke til brug af deres medicinske journaler og vævsprøver til forskningsformål.

Reverse transcriptase-polymerasekædereaktion (RT-PCR)

Frosne vævsprøver (100 mg) blev høstet og malet til et fint pulver. A549-celler blev stabilt transficeret med pcDNA3.1 vektoren indeholdende ABCG4 (Takara Bio, Otsu, Japan) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA), ifølge fabrikantens protokol. Celler blev podet i plader med 6 brønde, og DNA-plasmider og transfektionsreagens blev tilsat 24 timer senere. Transficerede A549-celler blev dyrket i nærvær af G418 (400 mg /ml; Life Technologies Co., Grand Island, NY, USA). G418-resistente celler (A549-ABCG4) blev plukket til RT-PCR-analyse.

RNA-ekstraktion blev udført under anvendelse af Total RNA Kit I (Omega, Norcross, GA, USA). Koncentrationen og renheden af ​​RNA-prøver blev bestemt ved anvendelse af absorbans ved 260 og 280 nm (A260 /280) ved spektrofotometri (Beckman DU800, Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA).

cDNA-syntese blev udført ved anvendelse en revers transskription kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) under anvendelse af Random Primer hexamer, og RevertAid M-MuLV revers transkriptase. PCR-amplifikation blev udført ved hjælp af 2 × Taq Mastermix (CWBio, Beijing, Kina). Indledende denaturering blev udført ved 95 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 30 cykler af denaturering ved 95 ° C i 35 s, annealing ved 51 ° C i 35 s og ekstension ved 72 ° C i 35 s, med en endelig forlængelse ved 72 ° C i 5 min (tabel 1). PCR produkter blev analyseret på 2% agarosegeler under anvendelse af en gel imager (Alpha Innotech, Santa Clara, CA, USA).

Western blot-analyse

Frosne vævsprøver (100 mg) blev skåret i små stykker og homogeniseres i en radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) buffer [1 x PBS, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), 1% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 10 ug /ml leupeptin, 100 ug /ml p-aminophenylmethylsulfonyl fluorid (p-APMSF) og 10 ug /ml aprotinin] på is i 1 time og centrifugeret ved 14.000 x

g

i 30 min. A549-ABCG4 celler blev lyseret med RIPA-buffer på is i 1 time og centrifugeret ved 14.000 x g i 30 min. Supernatanten blev derefter høstet og proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af bicinchoninsyre (BCA) protein-assay. Proteinlysater (50 ug) blev separeret ved 12% SDS-polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner ved 2,5 mA /cm

3 i 30 min. Membraner blev blokeret med 5% skummetmælkspulver i 1 time ved stuetemperatur og inkuberet med de primære antistoffer (anti-ABCG4 polyklonalt kaninantistof, 1: 1000, Proteintech, Chicago, IL, USA; og anti-β-actin kanin monoklonalt antistof- , 1: 1000, CW Bio, Beijing, Kina) ved 4 ° C, natten over. Membraner blev derefter vasket med TBST-buffer (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCl og 0,1% Tween-20), og efterfølgende inkuberet med det sekundære antistof (gede-anti-kanin-antistoffer, 1: 5000, CW Bio, Beijing , Kina) ved 37 ° C i 1 time, efterfulgt af farveudvikling under anvendelse af Milipore chromogene kit til western blots (Billerica, MA, USA) og observation under en kemoluminescensanalysator (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Immunhistokemi

paraffinindstøbte væv blev skåret i 3-5-um sektioner for afvoksning og rehydrering. Immunhistokemi blev udført efter mikrobølgeopvarmning-baserede antigen hentning i 0,1 M citratpuffer (pH = 6,0) efterfulgt af inkubation med 3% H

2O

2 ved stuetemperatur i 30 min, 10% gedeserum ved stuetemperatur i 30 min, primært antistof (anti-ABCG4 kanin polyklonale antistof, 1:40 Proteintech, Chicago, IL, USA) natten over ved 4 ° C, biotin-mærket sekundært antistof (CW Bio, Beijing, Kina) ved stuetemperatur i 30 min og frisk fremstillet 3,3′-diaminobenzidin (DAB) til farveudvikling i 5 min. Snittene blev derefter grundigt skyllet med vand, re-farvet med hematoxylin, dehydreret, ryddet i xylen og monteret med et dækglas. Specificiteten af ​​anti-ABCG4 antistof blev testet ved hjælp ABCG4-blokerende peptider (1: 200; sc-34874; Santa-Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA, USA). De blokerende peptider blev tilsat til objektglas og inkuberet natten over ved 4 ° C. Derefter blev det primære antistof tilsættes og afsløret som beskrevet ovenfor.

Prøver blev klassificeret som “positiv”, når cellemembranen og /eller cytoplasma blev farves brun. Fem high-power felter (400 ×) blev udvalgt tilfældigt, og hver slide blev evalueret uafhængigt af to erfarne patologer blindet til de kliniske data. Phosphatbufret saltvand (PBS), i stedet for det primære antistof, blev anvendt som blank kontrol.

Prøver blev scoret ifølge farvningsintensitet og procentdelen af ​​positive celler. Resultaterne blev scoret baseret på følgende kriterier: a) procentdelen af ​​positive celler (≤5%: 0; 6-25%: 1; 26-50%: 2; 51-75%: 3; og 75% : 4); b) farvningsintensitet (ingen farve: 0; gul: 1; brown: 2; og tan: 3); og c) de to kvaliteter blev ganget sammen og prøver blev tildelt en af ​​4 niveauer: 0: negativ (-); 1-4: svagt positiv (+); 5-8: moderat positiv (++); 9-12: stærkt positiv (+++) [34]. For multivariat analyse og sammenligning med overlevelseskurverne, -blev defineret som negativ, og +, ++ og +++ blev alle defineret som positiv.

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS 18.0 (IBM, Armonk, NY, USA). Associationer mellem immunhistokemisk ekspression og kliniske variable blev evalueret ved Mann-Whitney U eller Kruskal-Wallis H test efter behov. Samlet overlevelse blev målt fra starten af ​​kemoterapi til datoen for død uanset årsag eller den dato, patienten sidst blev anset for at være i live. Overlevelseskurver blev estimeret ved Kaplan-Meier-metoden, og sammenlignet under anvendelse af log-rank test. Den Cox proportionel risiko model blev brugt til univariate og multivariate analyser. Korrelationer blev vurderet ved hjælp af Spearman rank korrelation analyse. De rang korrelationskoefficienter blev udtrykt som

r

s. 0.0≤

r

s

0,1 blev betragtet som ukorrelerede; 0.1≤

r

s

0,3 blev betragtet som svagt korreleret; 0.3≤

r

s

≤0.5 blev betragtet som moderat korreleret;

r

s

0,5 blev betragtet som et stærkt korreleret. Tosidet

P

-værdier. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

ABCG4 mRNA og protein udtryk i NSCLC og normale lungevæv

at undersøge ABCG4 mRNA-ekspression i NSCLC og normale lunge vævsprøver, RT-PCR blev udført på mRNA isoleret fra NSCLC væv (n = 14) og normale lungevæv (n = 2). Påvisning af et 383-bp PCR-produkt svarende til ABCG4 mRNA blev observeret i NSCLC væv (Fig 1B), mens ingen sådan bånd blev observeret i normale lungevæv (Fig 1A). Amplifikation af β-actin (416 bp) blev klart observeret i begge vævstyper (Fig 1).

β-actin blev anvendt som en intern reference. M: markør. (A) Bane 1: positiv kontrol (A549-ABCG4). Banerne 2-3: normal lungevæv (norm) (n = 2); (B) NSCLC væv (NSCLC) (n = 14, baner 1-14).

For at undersøge ABCG4 proteinekspression i NSCLC og normale lungevæv, western blot analyse blev udført i sæt prøver anvendes til RT-PCR. ABCG4 proteinekspression (60 kDa) blev observeret i NSCLC væv (Fig 2B og S1 Fig), men ikke i normale lungevæv (Fig 2A). β-actin (43 kDa) blev anvendt som en normalisering kontrol og blev observeret i begge vævstyper (fig 2 og S1 Fig).

Full blots blev vist i S1 Fig β-actin (43 kDa) var anvendes som en intern reference. (A) Bane 1: positiv kontrol (A549-ABCG4). Banerne 2-3: normal lungevæv (norm) (n = 2); (B) NSCLC væv (NSCLC) (n = 14, baner 1-14).

Disse resultater viste, at ABCG4 mRNA og protein udtryk var naturligvis forskellige mellem NSCLC og normale lungevæv.

Angivelse af ABCG4 protein i NSCLC og normale lungevæv ved immunhistokemi

for yderligere at undersøge ekspressionen af ​​ABCG4 protein i NSCLC blev immunhistokemi udført på NSCLC (n = 140) og normale lungevæv prøver (n = 90) (figur 3). Nr ABCG4 ekspression blev set i de normale vævsprøver (figur 3A). Nogle af de NSCLC prøver viste også ingen ekspression (-) (Fig 3B), medens andre prøver var svagt positive (+) (fig 3C), moderat positivt (++) (fig 3D), eller stærkt positiv for ABCG4 (++ +) (fig 3E). ABCG4-negativ farvning blev vist i NSCLC vævsprøver de (++) hjælp ABCG4 blokerende peptid (Fig 3F). Baseret på immunhistokemi blev ABCG4 ekspression påvist i 48,6% af NSCLC tilfælde (68/140, 40 +, 23 ++, og 5 +++), og blev ikke påvist i nogen af ​​90 normale lunge vævsprøver de (

P

. 0,001) (tabel 2)

(A) Normal lungevæv; (B) Negativ (-) farvning af ABCG4 i NSCLC væv; (C) Svagt positive (+) farvning af ABCG4 i NSCLC væv; (D) Moderat positiv (++) farvning af ABCG4 i NSCLC væv; (E) Stærkt positive (+++) farvning af ABCG4 i NSCLC væv; (F) Immunhistokemi viser ABCG4-negativ farvning i NSCLC væv (++) ved hjælp ABCG4 blokerer peptid. Forstørrelse:.. 200 ×

Disse resultater antydede, at ABCG4 blev udtrykt i NSCLC væv, og at det ikke blev udtrykt i normale lungevæv

associering mellem ABCG4 udtryk og klinisk-patologiske karakteristika hos patienter med NSCLC

Efter at have observeret, at ABCG4 blev overudtrykt i næsten halvdelen af ​​de NSCLC vævsprøver, blev sammenhængen mellem ABCG4 udtryk og egenskaberne ved de patienter undersøgt. Der var ingen signifikant sammenhæng med køn, alder eller rygevaner (alle

P

0,05). Imidlertid blev høj ABCG4 udtryk signifikant korreleret med lunge adenocarcinom (53,0%) i stedet for lunge pladecellekræft (44,6%) (

P

0,001), i dårligt (55,2%) snarere end godt /moderat ( 42,5%) differentierede NSCLC (

P

= 0,008), og med stigende tumor node metastase (TNM) fase II, III og IV (31,0%

vs

. 53,6%

vs

59,5%, henholdsvis) (

P

0,001) (tabel 3). Desuden blev ABCG4 ekspressionsniveauerne svagt positivt korreleret med den stigende TNM stadie (

r

s

= 0.210,

P

= 0,013) (data ikke vist) .

Disse data antydede, at ABCG4 udtryk var forbundet med tumor differentiering, TNM stadie og histologisk type, og at ABCG4 ekspressionsniveauerne var positivt associeret med TNM stadie.

associering mellem ABCG4 udtryk og overlevelse af NSCLC patienter behandlet med cisplatin kemoterapi

for at undersøge forholdet mellem ABCG4 udtryk og det kliniske resultat af NSCLC patienter behandlet med cisplatin-baseret kombinationskemoterapi, univariate og multivariate analyser blev udført ved hjælp af Cox proportional hazard model til at bestemme, om den prognostiske værdi af ABCG4 var uafhængig af andre faktorer. I univariat analyse, køn, rygevaner, alder, og histologi påvirkede ikke prognose (alle

P

0,05). ABCG4 udtryk (hazard ratio [HR]: 2,284), høj TNM stadie (HR: 3,124), og dårlig differentiering (HR: 1,869) var signifikant associeret med en dårlig prognose (tabel 4). Desuden faktorer, der var forbundet med en

P

-værdi 0,05 i univariat analyse blev medtaget i en multivariat analyse. Resultaterne viste, at ud over TNM fase (HR: 3,098) og differentiering (HR: 1,811), ABCG4 ekspression var en uafhængig prognostisk faktor for overlevelse af patienter med NSCLC. Den ABCG4-positiv værdi for OS gav en HR på 2,236 (tabel 4). Disse resultater indikerede, at ABCG4 ekspression var en negativ prognostisk faktor hos patienter med NSCLC behandlet med cisplatin kemoterapi.

OS kurver er vist i figur 4, ifølge ABCG4 ekspression status. Median overlevelse var 43,2 og 20,1 måneder hos patienter med ABCG4-negative og ABCG4-positive NSCLC henholdsvis (

P

0,0001, figur 4A). Median overlevelse var 54, 32 og 14.15 måneder hos patienter med fase II, III, og IV NSCLC, henholdsvis (

P

0,0001, figur 4B). Median overlevelse var 39,5 og 25,2 måneder hos patienter med godt /moderat og dårligt differentieret NSCLC henholdsvis (

P

= 0,0008, figur 4C). Median overlevelse i ABCG4-negative gruppe var 39,5 måneder sammenlignet med 21.05 måneder i ABCG4-positive gruppe i fase III (

P

= 0,0002, figur 4E). Desuden median overlevelse i ABCG4-negative gruppe var 31,9 måneder sammenlignet med 13,8 måneder i ABCG4-positive gruppe i stadie IV (

P

= 0,0226, figur 4F). Men median overlevelse i ABCG4-negative gruppe var, 54,2 måneder sammenlignet med 50,1 måneder i ABCG4-positive gruppe i fase II, og der var ingen signifikant forskel i OS med hensyn til ABCG4 udtryk (

P

= 0,8127, figur 4D).

(A) Kaplan-Meier kurver blev plottet at bestemme kumulativ overlevelse på NSCLC-patienter baseret på ABCG4 udtryk (negativ

vs

. positiv). (B) Kaplan-Meier kurver blev plottet at bestemme kumulativ overlevelse på NSCLC-patienter baseret på tumor node metastase (TNM) fase (II

vs

. III

vs

. IV). (C) Kaplan-Meier-kurver blev plottet for at bestemme den kumulative overlevelsesrate for NSCLC-patienter baseret på differentiering (dårligt

vs

. Moderat /brønd). (D) Kaplan-Meier kurver blev plottet at bestemme kumulativ overlevelse på NSCLC patienter med TNM stadie II baseret på ABCG4 udtryk (negativ

vs

. Positiv). (E) Kaplan-Meier kurver blev plottet at bestemme kumulativ overlevelse på NSCLC patienter med TNM stadie III baseret på ABCG4 udtryk (negativ

vs

. Positiv). (F) Kaplan-Meier kurver blev plottet at bestemme kumulativ overlevelse på NSCLC patienter med TNM stadie IV baseret på ABCG4 udtryk (negativ

vs

. Positiv). Negativ:-; Positiv: +, ++ og +++

Diskussion

Det er allerede blevet fastslået, at ABC transportører er involveret i MDR og har en effekt på effekten af ​​kemoterapi [. ,,,0],11,12]. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge ABCG4 og dens udtryk i NSCLC med henblik på at vurdere, om der er en sammenhæng mellem ABCG4 udtryk og patienternes resultat efter kemoterapi. I denne undersøgelse har vi tilvejebragt solid dokumentation for ABCG4 mRNA og proteinekspression i nogle prøver af NSCLC væv, men ikke i nogen af ​​de normale lungevæv. Desuden blev ABCG4 udtryk forbundet med forskellige kvaliteter af differentiering, TNM stadie, og histologisk type. Univariate og multivariate analyser foreslået, at TNM stadie, differentiering og ABCG4 udtryk var uafhængige faktorer involveret i prognosen i denne population af NSCLC patienter behandlet med cisplatin kemoterapi. Disse resultater foreslog en dårligere overlevelse hos patienter med ABCG4-positive NSCLC behandlet med cisplatin kemoterapi.

ABCG4 udtryk var signifikant højere i NSCLC vævsprøver sammenlignet med normale lunge vævsprøver. Desuden blev ABCG4 udtryk forbundet med forskellige kvaliteter af differentiering, TNM stadie, og histologisk type. Tidligere undersøgelser har vist, at trods ligheder i sekvensen, struktur og funktion af MDR mellem ABCG2 (BCRP) og ABCG4, er ABCG2 ikke forbundet med køn, rygevaner, performance status (PS), histologisk type, og TNM stadie i NSCLC [35 , 36], mens vi observerede associationer mellem ABCG4 og histologisk type, differentiering kvalitet, og TNM fase. En forklaring kan være, at specificiteten og mangfoldigheden af ​​sekvens og struktur mellem ABCG underfamilie transporter gener bidrager til denne uoverensstemmelse. Desuden ekspression af ABC underfamilie transportproteiner varierer med kliniske variable; for eksempel ABCB1 ekspression er signifikant højere hos kvinder end hos mænd, og højere i ikke-pladecellecarcinom end i pladecellecarcinom i NSCLC. Men ABCC2 udtryk er markant højere i stadie IV NSCLC sammenlignet med stadie IIIB, mens der ikke er nogen signifikant sammenhæng mellem ABCC1 /ABCC3 udtryk og kliniske variable i NSCLC [35]. Denne uoverensstemmelse skal undersøges yderligere. ABCG4 deler også visse ligheder med ABCG1. Imidlertid basal ATPase aktivitet af ABCG4 er lavere end den for ABCG1, og ABCG4 inhiberes ikke af de samme stoffer som ABCG1 [37]. Men for at den nøjagtige interaktion og den rolle af denne interaktion mellem ABCG1 og ABCG4 stadig brug belyses [38].

Tidligere undersøgelser har vist, at ABCG4 medierer udstrømningen af ​​endogene steroider i celler og overfører dem til høj- density lipoprotein (HDL), og dermed bidrage til at opretholde cholesterolhomeostase [30,39]. Imidlertid Castanys-Muñoz et al. har opdaget, at overekspression af ABCG4 også er involveret i alkyl-phospholipid-analoger (miltefosin, edelfosin, og perifosine) modstand i

Leishmania

[33]. Resultaterne af den foreliggende undersøgelse tyder en kortere overlevelse hos patienter med ABCG4-positive NSCLC behandlet med cisplatin kemoterapi. Vi spekulere, at patienter med ABCG4-positiv NSCLC kan vise modstand mod cisplatin kemoterapi. Vi foreslår, at ABCG4 kan tjene som et molekylært mål for reduktion af resistens i NSCLC. Forholdet mellem ABCG4 og resistens, og især multiresistens, vil være mere specifikt i fremtidige studier.

På den anden side, det var første undersøgelse for at undersøge forholdet mellem ABCG4 udtryk og prognose i patienter med NSCLC. Baseret på OS kurver, ABCG4-positive patienter havde en kortere median overlevelsestid end ABCG4-negative patienter med undtagelse af stadie II NSCLCs (

P

= 0.8127). Median overlevelse var ikke signifikant forskellig i trin II NSCLCs, som kan være fordi ABCG4 ekspressionsniveauer var relativt lavt i fase II NSCLCs, og at antallet af ABCG4-positive patienter med stadium II NSCLC var relativt lille (n = 13). Derfor bør dette resultat tolkes med forsigtighed. Den univariate og multivariate analyser viste, at ud over TNM stadie og differentiering, blev ABCG4 uafhængigt associeret med OS i NSCLCs behandlet med cisplatin-baseret kombinationskemoterapi. Disse resultater antyder, ABCG4 ekspression kan være uafhængig risikofaktor for prognose og prædiktiv biomarkør hos patienter med NSCLC behandlet med cisplatin-baseret kombinationskemoterapi. Vores resultater er i overensstemmelse med de Yoh et al. og Ota et al., som understøtter en prædiktiv rolle for ABCG2 i prognosen for NSCLC patienter behandlet med cisplatin-baseret kombinationskemoterapi [35,36]. Desuden har vi spekulere at ABCG4 mRNA-ekspression kan anvendes til at designe individualiserede kemoterapi for NSCLC-patienter.

Denne undersøgelse havde nogle begrænsninger. Faktisk prøvens størrelse var lille, og en større stikprøve ville være at foretrække. Vi havde også ingen raske kontrolpersoner, fordi lunge resektion hos raske individer er meget invasiv og uetisk. Men kontrol væv fra patienter med NSCLC var histologisk forskellige fra tumorvæv og 5 cm væk fra tumorer, så vi formodes dette var en effektiv kontrol under omstændighederne. Endelig vil intracellulær lokalisering af ABCG4 vurderes i et kommende arbejde. Yderligere undersøgelser vil være udføre på forskellige NSCLC cellelinjer der overudtrykker ABCG4 alene eller i kombination med andre ABC transportører, som skulle bidrage til at belyse den præcise rolle og funktion ABCG4 i NSCLC.

Konklusioner

Denne undersøgelse tyder stærkt på, at høj ABCG4 udtryk er forbundet med dårlig prognose hos patienter med NSCLC behandlet med cisplatin kemoterapi, og patienter med ABCG4-positive NSCLC kan vise modstand mod cisplatin kemoterapi. Desuden angår den foreliggende undersøgelse er den første til at indikere en potentiel rolle for ABCG4 ekspression som en uafhængig forudsigende faktor for dårlig prognose i NSCLC patienter behandlet med cisplatin-baseret kombinationskemoterapi. Imidlertid behov for yderligere undersøgelse med større stikprøve og celler til at bekræfte disse resultater, og den specifikke vej og mekanisme køre denne virkning har brug for yderligere undersøgelse. Disse kan føre til en ny tilgang til tilbageførsel af resistens over for kemoterapi narkotika ved at forstå ABCG4 og dens mekanisme i NSCLC.

Støtte Information

S1 Fig. . Fuld western-blot af ABCG4 protein (60 kDa) ekspression

β-actin (43 kDa) blev anvendt som en intern reference

doi:. 10,1371 /journal.pone.0135576.s001

(PDF)

S1 fil. . Rådata for cox proportionel risiko model analyse og Kaplan-Meier kurver

Bemærk: Køn: 0, mandlige; 1, kvindelig. Begivenhed: 0, død; 1, censurerede data. Alder: 0, ≥60; 1, 60.