PLoS ONE: Målretning af Wnt /β-Catenin signalvejen i leverkræft Stamceller og leverkræft cellelinier med FH535

Abstrakte

Aktivering af Wnt /β-catenin vej er blevet observeret i mindst 1/3 af hepatocellulære karcinomer (HCC), og et betydeligt antal af disse har mutationer i β-catenin gen. Derfor kunne en effektiv inhibering af denne vej tilvejebringe en ny fremgangsmåde til behandling af HCC. Den purposed med denne undersøgelse var at bestemme, om FH535, som tidligere blev vist at blokere β-catenin pathway, kunne inhibere β-catenin aktivering af målgener og inhibere proliferation af leverkræft stamceller (LCSC) og HCC-cellelinier. Brug af β-catenin responsiv reportergener, vores data indikerer, at FH535 kan inhibere målgen aktivering ved endogen og exogen udtrykte β-catenin, herunder konstitutivt aktiv form af β-catenin, der indeholder en Serine37Alanine mutation. Vores data indikerer også, at proliferation af LCSC og HCC linjer inhiberes af FH535 på en dosis-afhængig måde, og at dette korrelerer med et fald i procentdelen af ​​celler i S-fase. Endelig viser vi også, at ekspression af to velkarakteriserede mål for β-catenin, cyklin D1 og Survivin, reduceres med FH535. Tilsammen disse data indikerer, at FH535 har potentiel terapeutisk værdi i behandling af leverkræft. Vigtigt er det, disse resultater tyder på, at denne behandling kan være effektiv på flere niveauer ved at målrette både HCC og LCSC

Henvisning:. Gedaly R, Galuppo R, daglig MF, Shah M, Maynard E, Chen C, et al. (2014) Målretning af Wnt /β-Catenin signalvejen i leverkræft Stamceller og leverkræft cellelinier med FH535. PLoS ONE 9 (6): e99272. doi: 10,1371 /journal.pone.0099272

Redaktør: Zhiyuan Gong, National University of Singapore, Singapore

Modtaget: 30 oktober, 2013; Accepteret: 12. maj 2014 Udgivet: 18 juni 2014

Copyright: © 2014 Gedaly et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne publikation blev støttet af tilskud nummer UL1RR033173 [TL1 RR033172, KL2 RR033171] fra National center for Research Resources (NCRR), DK074816 (BTS) finansieret af Kontoret for direktøren, National Institutes of Health (NIH), og støttet af NIH køreplan for medicinsk forskning. Denne forskning blev også støttet af flowcytometri og Cell Sorting delte ressource fra University of Kentucky Markey Cancer Center (P30CA177558). Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter NCRR og NIH. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hepatocellulært carcinom (HCC), den mest almindelige leverkræft, er den femte mest almindelige kræftform og den tredje højeste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1] – [2]. Den alarmerende stigning i HCC forekomst i Europa og Nordamerika i de seneste år er relateret primært til hepatitis C-virus-infektion, selv om andre faktorer såsom overdreven alkoholforbrug og fedme bidrager også til denne stigning [3]. Ætiologien af ​​HCC er kompleks og involverer en lang række genetiske og epigenetiske ændringer og forstyrrelser af forskellige signalveje, herunder Wnt /β-catenin, Ras /Raf /MAPK, PI3K /AKT /mTOR, HGF /c-MET, IGF, VEGF og PDGF pathways. Blandt disse er Wnt /β-catenin pathway betragtes blandt de mest vanskelige at inhibere [4]. I øjeblikket få kemiske midler målrettet mod Wnt /β-catenin pathway er tilgængelige eller under undersøgelse [5].

Aktivering af den kanoniske Wnt /β-catenin pathway involverer bindingen af ​​Wnt proteiner til celleoverfladen Frizzled receptorer og LRP5 /6 co-receptorer. I mangel af Wnt-proteiner, meget af det cellulære β-catenin er bundet til E-cadherin på cellemembranen. Cytosolisk β-catenin er konstitutivt phosphoryleret ved specifikke serinrester ved en enzymatisk kompleks, som omfatter adenomatøs polyposis coli (APC), Axin og kinaserne glycogensynthasekinase-3β (GSK-3β) og casein kinase I, markere den for ubiquitinmedieret proteolyse. Under disse betingelser, TCF /LEF transkriptionsfaktorer er bundet til deres beslægtede elementer DNA anerkendelse sammen med medlemmer af Groucho familien af ​​co-repressorer, forsikrer den transkriptionelle inaktivering af β-catenin målgener. Indgreb af Wnt proteiner med Frizzled receptoren aktiverer Dishevelled protein, hvilket resulterer i dissociation af cytosoliske destruktive kompleks og inhibering af GSK-3β. Dette fører til stabilisering og akkumulering af cytoplasmatisk β-catenin, som derefter trænger ind i kernen, binder TCF /LEF-proteiner og fører til den efterfølgende dissociation af Groucho co-repressorer, rekruttering af coaktivator p300 og aktivering af β-catenin-målgener [ ,,,0],6] – [9]. Mange af målene for β-catenin, herunder cyclin D1, c-myc og Survivin, fremme cellecyklusprogression og inhiberer apoptose [10] – [12]. I overensstemmelse med disse data, er aktivering af Wnt /β-catenin pathway set i en række forskellige cancere, herunder HCC. Aberrant aktivering af Wnt /β-catenin pathway er blevet observeret i mindst 1/3 af HCC, og omkring 20% ​​af HCCs har mutationer i β-catenin-genet. Mere end 50% af HCC tumorer vise nukleare akkumulering af β-catenin indikerer, at andre faktorer kan være involveret, såsom afvigende methylering af tumorsuppressorer APC og E-cadherin, inaktivering af casein-kinase og GSK-3β, eller øget sekretion af Wnt ligants [4] -. [5]

Der har været stigende interesse i rollen for leverkræft stamceller (LCSC) i tumorigenese, tumor progression, invasion og metastaser. Kræft stamceller teori foreslår, at en tumor består af en heterogen population af celler, der danner en distinkt cellulær hierarki. Nylige undersøgelser har givet overbevisende beviser for, at disse celler findes i faste tumorer i mange typer, herunder, hjerne, bryst, kolorektal, lever, bugspytkirtel og prostatacancer. I 2006 isolerede to forskellige grupper en CD133 + delpopulation fra HCC-cellelinjer og beskrevet højere proliferative og tumorigent potentiale i overensstemmelse med stamcelle egenskaber. CD44 blev også fundet som et vigtigt markør anvendes i kombination med andre stamcellemarkører bedre definition overfladen fænotype af LCSC. Det er blevet påvist, at CD133 + og CD90 + celler co-udtrykker CD44 + er mere aggressive end de, der udtrykker CD133 eller CD90 alene [13] – [14]

De kemiske midler, som anvendes til at målrette Wnt- /β-catenin pathway. er på membranen, cytosol og transkriptionsfaktor-niveauer [5]. Den lille molekylære middel FH535 er en dobbelt inhibitor af peroxisomproliferatoraktiveret receptor (PPAR) og β-catenin /TCF /LEF. FH535 er blevet vist at inhibere proliferation af HCC og hepatoblastoma cellelinier og dets specificitet på inhibering af β-catenin /TCF /LEF-aktivitet blev vist i hepatoblastoma HepG2 [15].

Formålet med denne undersøgelse blev at afgøre, om FH535 kan inhibere aktiveringen af ​​β-catenin-regulerede gener ved endogen og ektopisk udtrykte β-catenin i HCC-cellelinier Huh7, Hep3B og PLC og leverkræft stamceller (LCSC). Specificiteten af ​​FH535 på hæmning af β-catenin via TCF /LEF aktivering blev analyseret i dobbelt luciferase reporter transficeret i LCSC og i HCC celler. Spredning, cellecyklus, og andre målrettede gener og proteiner blev analyseret.

Materialer og metoder

2.1 Celledyrkning

HCC cellelinje Huh7 [16] var en gave fra Dr. Guangxiang Luo (University of Alabama – Birmingham). HCC-cellelinier Hep3B og PLC blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Hep3B og PLC begge udtrykker HBV-overfladeantigen, og Huh7 ekspres hepatitis delta-antigen. The Hep3B er p53 negativ, PLC’en har reduceret p53-ekspression, og Huh7 har øget p53-protein-niveau [17] – [18]. Disse cellelinier blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), glutamin og penicillin /streptomycin. De leverkræft stamceller (LCSC; Catalog # 36.116-43, CelProgen, San Pedro, CA, USA) blev udvidet til og anvendes inden for de første 4 passager i CelProgen komplet vækstmedier med 10% FBS i ekstracellulære matrix (ECM ) coatede kolber (CelProgen). Flowcytometri profil og tumorgenicitet af LCSC er vist i figurerne S1 og S2. Andre cellelinjer blev dyrket i standard plast bagværk uden ECM belægning. Celler blev dyrket i NuAire inkubator (Plymouth, MI, USA) ved 37 ° C med 5% CO

2.

2.2 Kemikalier

FH535, XAV939 og LiCl blev købt fra Sigma- Aldrich (St. Louis, MO, USA). Methyl-

3H-thymidin (2 Ci /mM) var fra MP Biomedicals (Costa Mesa, CA, USA). X-Treme Gene 9 og Turbofect transfektionsreagenser var fra Roche (Indianapolis, IN, USA) og Thermo Scientific (Waltham, MA, USA), hhv. Propidiumiodid-baserede cellecyklusanalyse kit var fra genscript (Piscataway, NJ, USA). Alle andre kemikalier var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

2.3 Plasmider

TOPFlash luciferasereportergen, som indeholder 3 kopier af et TCF /Lef bindingssted og FOPFlash luciferase reporter, identisk med TOPFlash undtagen TCF /LEF steder er blevet muteret, blev indkøbt fra Addgene (Cambridge, MA, USA) [19]. PRL Renilla luciferase vektor var fra Promega (Madison, WI, USA). Ekspressionsvektorer for vildtype-β-catenin og βCatS37A blev tilvejebragt af S. Byers [20] og E3-pGL3, indeholdende muse alpha-fetoprotein enhancer E3 fusioneret til pGL3-promotoren, blev beskrevet tidligere [21].

2.4

3H-thymidin-assay

Dette assay blev udført som tidligere beskrevet af vor offentliggjorte fremgangsmåde og af andre forskere [22] – [24]. Kort beskrevet blev celler podet i 96 brønds plader ved 1,000-5000 celle /brønd i 0,2 ml DMEM + 10% FBS og behandlet to gange med forskellige koncentrationer af FH535 i 72 timer. Cellerne blev pulseret med

3H-thymidin ved 1 uCi /brønd i 4 timer. Alternativt blev celler dyrket ved 2500 celler /brønd i 0,1 ml medium i 24 timer, efterfulgt af samtidig tilsætning af FH535 (0-15 uM) og

3H-thymidin (1 uCi /brønd) til et endeligt volumen på 0,2 ml /brønd., efterfulgt af inkubation i yderligere 18 timer. I begge situationer i slutningen af ​​inkubationen blev cellerne vasket og fikseret i 0,3 ml 10% trichloreddikesyre (TCA) i 12 min. Efter aspiration af TCA blev cellerne lyseret i 0,2 M NaOH /0,2% SDS i 40 min.

3H-thymidin-inkorporering blev målt ved scintillationstælling i en Packard Scintillation Analyzer (Covina, CA, USA). Vi har ikke foretaget MTT assay for celleproliferation at sammenligne med

3H-thymidin, fordi der er farve reaktion mellem FH535 og MTT assayreagens (thiazolyl blå tetrazolium bromid). Koncentrationen af ​​FH535 at forårsage en 50% hæmning af celle dyrket (IC

50) blev bestemt ved følgende fremgangsmåde. No-drug data blev anvendt som 100% ved Y-aksen, og fra dette til en 50% inhibering på Y-aksen blev bestemt. Fra 50% værdi punkt, vi drage en parallel linie til X-aksen (den lægemiddelkoncentration akse) for at identificere indlægget punkt på kurven koncentration. Fra krydset vi drage en parallel linje til Y-aksen, og find krydset på X-aksen. Dette kryds punkt på X-aksen er IC

50 point. Alle forsøg blev udført mindst to gange.

2,5 Forbigående transfektioner og Dual luciferaseassays

For transfektioner blev Huh7, PLC og LCSC belagt på 3 × 10

5 celler /brønd i en ml dyrkningsmedium i 12-brønds plader; efter 24 timer blev celler cotransficeret med TOPFlash /PRL vektorer (DNA-forhold 10:1) eller FOPFlash /Prl vektorer (DNA-forhold 10:1) under anvendelse X-treme Gene 9 (Roche, Indianapolis, IN, USA) transfektionsreagens efter producentens anvisninger. Efter 6 timer blev mediet aspireret, og cellerne blev tilsat 1 ml dyrkningsmedier indeholdende forskellige koncentrationer af FH535, DMSO alene (vehikel), og /eller 10 mM LiCI. I alle tilfælde den endelige koncentration af DMSO var 0,08%. Mængden af ​​vehikel DMSO blev holdt konstant i lægemiddelbehandlinger og slutkoncentrationen af ​​DMSO i hver behandling var den samme og er designet til mindre end 0,1%. Efter 36 timer blev dobbelt luciferaseassays gjort med Promega Dual Luciferase Assay System (Madison, WI, USA) ifølge producentens protokoller. Luciferaseaktivitet blev målt i Lumat LB 9507 luminometer (Berthold Technologies, Oak Ridge, TN, USA). Kort fortalt blev cellerne vasket en gang med sterilt PBS, og lyseret i 1 × lysepuffer (Promega) (0,25 ml /brønd) i 15 minutter ved stuetemperatur. Ti pi råt cellelysat (fremstillet ifølge Promega Protocol) blev tilsat til 50 pi luciferaseanalyse LARII substrat i et 12 x 75 mm polystyrenrør (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) for at måle ildflueluciferaseaktivitet, efterfulgt af tilsætning af 50 pi Stop og Glo substrat til måling af Renilla luciferaseaktivitet. Den målte Renilla luciferase-aktivitet blev anvendt til at normalisere den målte ildflueluciferase aktivitet.

I co-transfektioner med β-catenin ekspressionsvektorer celler blev udpladet med 1 x 10

5 celler /brønd i 24-brønds plader. Celler blev transficeret med 340 ng Luciferase reporter plasmid, 170 ng β-catenin-ekspressionsplasmidet, og 10 ng pRL /brønd under anvendelse af Turbofect transfektionsreagens (Pittsburg, PA, USA). Efter 5-6 timer blev FH535 (eller DMSO vehikelkontrol) tilsat. Efter yderligere 36 timer blev celleekstrakter (fremstillet ifølge Promega-protokol) fremstillet og anvendt umiddelbart eller opbevaret ved -80 ° C. Alle transfektioner blev udført in duplo og gentaget mindst to gange. Luciferaseassays blev udført med celleekstrakter bruger Dual Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA) ifølge producentens protokoller. Luciferaseaktivitet blev målt i to eksemplarer.

2.6 Cell cycle analysis Salg

Huh7 celler blev dyrket i DMEM + 10% FBS i 24 timer. Cellerne blev vasket med serumfrit DMEM 3 gange, derefter dyrket i DMEM + 0,1% FBS i 24 timer til synkronisering af cellerne. Cellerne blev derefter dyrket i DMEM + 10% FBS med forskellige koncentrationer af FH535 i 24 timer. Cellerne blev høstet og farvet med propidiumiodid (PI) og analyseret ved flowcytometri ifølge genscript protokollen. LCSC blev dyrket i CelProgen komplet vækstmedium og behandles på samme måde som anført ovenfor.

2.7 RT-PCR og vestlige analyse

RT-PCR.

Celler blev dyrket i DMEM + 10% FBS i 100 mm vævskulturskåle indtil -70% konfluens og derefter behandlet med DMSO alene eller stigende koncentrationer af FH535 i DMSO for 38 timer. Til RNA-analyse blev celler høstet og cDNA blev fremstillet som beskrevet [21]. Kvantitativ PCR blev udført med SYBR green anvendelse af Bio-Rad MyiQ termisk cykliseringsapparat med følgende primere: Survivin (BIRC5, CAAGGAGCTGGAAGGCTGG og GTTCTTGGCTCTTTCTCTGTCC), cyclin D1 (CCND1: GGATGCTGGAGGTCTGCGA og TAGAGGCCACGAACATGCAAGT), og β2-mikroglobulin (B2M: GACTTTGTCACAGCCCAAGATAG og TCCAATCCAAATGCGGCATCTTC ).

Western Blot.

Huh7 celler (5 x 10

5) blev dyrket i DMEM + 10% FBS i 100 mm vævskulturskåle i 72 timer. Efter ændring med frisk medium, blev cellerne behandlet med 0, 2,5, 5 og 10 uM af FH535 for 38 timer. DMSO ( 0,1%) blev anvendt som vehikelkontrol. Proteinkoncentrationer i celleekstrakterne blev analyseret med mikro BCA proteinassay kit ifølge udbyderens protokol (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA). Specifikke antistoffer blev opnået fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Western Blot band densitet blev analyseret med NIH ImageJ software (Bethesda, Maryland, USA), og normaliseret ved β-actin. Alle de andre procedurer blev udført som beskrevet tidligere [25].

2.8 Statistisk analyse

Alle analyser blev udført ved hjælp af softwaren SPSS-version 20 (International Business Machines Corporation, Endicott, NY, USA) . Data er præsenteret som gennemsnit ± SE. Envejs ANOVA efterfulgt af Tukey korrektion blev anvendt til sammenligning af middelværdier. Niveauet af statistisk signifikans blev sat til

s

. 0,05

Resultater

3.1 FH535 hæmmer transkriptionel aktivering medieret af vildtype og konstitutivt aktive β-catenin

FH535 har vist sig at blokere signalering gennem endogen β-catenin i flere cellelinjer, herunder hepatoblastoma HepG2 [15]. For yderligere at udforske denne forordning og at teste, om FH535 kunne blokere ektopisk β-catenin, co-transfektioner med β-catenin ekspressionsvektorer og TCF4-afhængige luciferase reporter vektor TOPFlash blev udført i de humane HCC-cellelinjer Huh7 og Hep3B (fig. 1 ). I begge cellelinier, co-transficeret vildtype-β-catenin-ekspressionsvektor øgede luciferaseaktivitet fra TOPFlash næsten 15 gange sammenlignet med celler co-transficeret med tom vektor (E. V.) kontrol. Denne β-catenin-afhængig stigning blev inhiberet af FH535 på en dosis-afhængig måde. β-catenin er ofte muteret i forskellige cancerformer, herunder HCC. En naturlig mutation ændrer serin i position 37; dette ændret form af β-catenin er resistent over for nedbrydning af APC kompleks og har således højere stabilitet. For at teste, om denne form for aktiverede form af β-catenin også kunne blokeres af FH535, en ekspressionsvektor for βCatS37A, hvor serin i position 37 er blevet ændret til en alanin, blev cotransficeret med TOPFlash. Som forventet βCatS37A-medieret transaktivering af TOPFlash var signifikant højere end transaktivering med vildtype β-catenin. Men i begge cellelinier, βCatS37A-medieret transaktivering signifikant inhiberet af FH535. Som kontroller blev celler også co-transficeret med FOPFlash, der er identisk med TOPFlash bortset fra at TCF4 steder er blevet muteret og derfor ikke længere reagerer på p-catenin; FOPFlash blev ikke aktiveret af vildtype β-catenin eller βCatS37A som vist i figur 1.

Huh7 (Panel A) og Hep3B (Panel B) HCC-celler blev transficeret med luciferase reportergener TOPFlash (venstre paneler) , som indeholder tre TCF bindingssteder, eller E3-pGL3 (højre paneler), som indeholder AFP enhancer element E3, som har en særdeles konserveret TCF site. Celler blev desuden co-transficeret med en ekspressionsvektor, der indeholdt intet insert (tom vektor kontrol, E. V.), vildtype-β-catenin (β-catenin), eller et konstitutivt aktiv form af β-catenin (βcatS37A). Renilla luciferase blev anvendt til at styre for variationer i transfektionseffektivitet. Seks timer efter tilsætningen af ​​DNA blev celler behandlet med DMSO alene (ingen behandling) eller stigende mængder af FH535. Efter 48 timer blev luciferase niveauer bestemmes; ildflueluciferase blev normaliseret til Renilla. I begge cellelinier, FH535 inhiberede β-catenin-afhængig aktivering af målgener. *

P

0,05. Eksperimentet blev udført to gange med lignende resultater.

TOPFlash indeholder tre konsensus TCF4 bindende motiver, giver lydhørhed til p-catenin. For at teste om FH535 også kunne blokere β-catenin-medieret transaktivering af en TCF4 motiv i forbindelse med en naturlig regulatoriske region, blev co-transfektioner udført med E3-pGL3. E3 er en ~340 bp fragment, der indeholder alpha-fetoprotein (AFP) enhancerelement E3, en af ​​tre forstærkere, som styrer hepatisk ekspression af muse AFP-genet. E3 indeholder bindingssteder for flere faktorer, herunder Foxa /HNF6, C /EBP, orphan nukleare receptorer, og TCF4 [26] – [27]. Vi har for nylig vist, at denne enhancer er reguleret af p-catenin i celler og transgene mus [21]. E3-pGL3 blev transaktiveres af β-catenin og i et større omfang af βCatS37A (fig. 1). Imidlertid var dette transaktivering med både vildtype- og S37A former af β-catenin blokeret af FH535 på en dosis-afhængig måde.

3.2 FH535 inhiberer β-catenin-medieret transkriptionel aktivering i LCSC

Tidligere undersøgelser har vist, at β-catenin signalering er forhøjet i EpCAM-positive celler med LCSC egenskaber [28]. Vi har tidligere beskrevet, at CD133 +, CD44 +, CD24 + LCSC aggressivt danne tumorer, når små antal af disse celler injiceres i nøgne mus [29]. For at teste evnen hos FH535 til at inhibere β-catenin i disse LCSCs blev transiente transfektioner udført med TOPFlash. Som kontroller blev TOPFlash også transficeret i HCC-cellelinier Huh7 og PLC (fig. 2). I alle tre populationer, ubehandlede celler udviste lave luciferase niveauer. Ved behandling med den GSK-3β-inhibitor LiCI, hvilket fører til endogen β-catenin-aktivering [30], TOPFlash aktivitet steget dramatisk. FH535 blokerede effektivt LiCl-medieret aktivering af TOPFlash på en dosis-afhængig måde. Interessant denne inhibering var mere robust i LCSC end i både HCC cellelinie. Som kontrol blev transfektioner også udført med FOPFlash, som ikke længere reagerer på p-catenin. Som forventet blev luciferaseaktivitet i FOPFlash-transficerede celler hverken forhøjet med LiCl eller inhiberes af FH535.

LCSC (venstre panel), Huh7 (midterste panel) og HPLC (højre panel) celler blev cotransficeret med TOPFlash eller FOPFlash luciferase reportergener sammen med Renilla luciferase. Efter 6 timer blev cellerne efterladt ubehandlede (ingen behandling) eller behandlet med LiCl alene eller LiCI med stigende mængder af FH535. LiCI er en kendt aktivator af β-catenin. Efter yderligere 36 timer blev cellerne høstet og luciferase blev bestemt; ildflueluciferase blev normaliseret til Renilla. TOPFlash aktivitet var stærkt induceret i alle tre cellepopulationer; denne aktivering blev hæmmet af FH535. Den negative kontrol FOPFlash udviste minimal reaktion på LiCl eller FH535. TOPFlash hæmning af FH535 var mere robust i LCSC end i enten HCC cellelinje. *

P

0,003, # P 0,001. Eksperimentet blev udført to gange med lignende resultater.

3.3 FH535 inhiberer proliferation af LCSC og HCC-cellelinier

Talrige undersøgelser har vist, at β-catenin spiller en vigtig rolle i proliferation under normal udvikling og i cellulær transformation i mange væv, herunder leveren. Leverudvikling forringes i fravær af β-catenin, og mutationer, som aktiverer β-catenin pathway findes i omkring 1/3 af HCC [4] – [5]. Endvidere kan væksten af ​​voksne liver progenitor stamceller (ovale celler) inhiberes ved at blokere β-catenin pathway. Da vores data viste, at FH535 kan blokere β-catenin-medieret transkriptionel aktivering, vi også testet, om spredning af LCSC og HCC cellelinjer er påvirket af dette stof. LCSC blev dyrket i nærvær af 10% eller 1% serum og med mellem 5 uM og 30 uM FH535 i 72 timer, og celle proliferation blev overvåget ved

3H-thymidininkorporering (fig. 3A og 3B henholdsvis). Proliferation faldt med stigende mængder af FH535, med en mere dramatisk reduktion observeret i celler dyrket i nærvær af lavere serum; koncentrationen af ​​FH535 at forårsage en 50% hæmning af celle dyrket (IC

50) var 13,8 pM for celler dyrket i 10% serum og 5,1 uM for celler dyrket i 1% serum. Denne inhibering var mere potent end der ses med XAV939 (IC

50 = 55 uM), som inhiberer tankyrase og dermed stabiliserer axin og fremme β-catenin-nedbrydning (fig. 3C) [31]. FH535 også blokeret proliferation af HCC celler ved koncentrationer, der svarede til den, der ses med LCSC (IC

50 på 10,9 pM, 9,25 pM og 6,6 pM for Huh7, PLC og Hep3B henholdsvis; Fig.3D). For at bekræfte at FH535 faktisk hæmmede celledeling og ikke føre til øget celledød, blev FH535 og

3H-thymidin tilsættes samtidigt til Huh7 celler, som derefter blev dyrket i 18 timer. I dette scenarie observerede vi en signifikant inhibering af proliferation ved 2,5, 5, 10 og 15 uM af FH535 behandling sammenlignet med kontrol (p 0,05, n = 6), med FH535 ved 15 uM forårsager en 41% inhibering (fig S3 ). Disse data indikerer, at FH535 inhiberer celleproliferation snarere end at øge celledød.

Celler blev podet i plader med 96 brønde i 0,2 ml medium som beskrevet nedenfor i 72 timer, efterfulgt af tilsætning af

3H -thymidin ved 1 uCi /brønd i 4 timer. Inkorporering af

3H-thymidin blev bestemt ved scintillationstælling. I panel A, B og D, var den endelige koncentration af DMSO i hver brønd 0,05%; i panel C, slutkoncentrationen DMSO i hver brønd var 0,1%. (

A

) LCSCs blev udpladet med 1000 celler /brønd i DMEM med 10% FBS sammen med DMSO alene eller med stigende mængder af FH535. (

B

). LCSCs blev udpladet med 5000 celler /brønd i DMEM med 1% FBS med DMSO alene eller med stigende koncentrationer af FH535. (

C

). LCSCs blev udpladet i DMEM med 10% FBS ved 1000 celler /brønd med DMSO alene eller stigende koncentrationer af XAV939. (

D

). Huh7, Hep3B og PLC-celler blev udpladet i DMEM med 10% FBS ved 1000, 2500, og 5000 celler /brønd, henholdsvis med DMSO alene eller stigende koncentrationer af FH535.

P

værdier for alle tre cellelinjer behandlet med FH535 sammenlignes med kontroller. Eksperimentet blev udført to gange med lignende resultater.

3.4 FH535 inducerer cellecyklusstop i HCC cellelinje Huh7 og i LCSC

evne FH535 til at hæmme celledeling fik os til at undersøge cellecyklusfordeling efter behandling. Huh7-celler blev synkroniseret ved vækst i 0,1% FBS i 24 timer og dernæst dyrket i nærvær af 10% FBS og med ingen FH535 eller FH535 på 7,5 uM og 15 uM. Efter 24 timer blev cellerne høstet, og DNA-indholdet blev analyseret ved propidiumiodid-farvning. I nærvær af FH535, var der en statistisk signifikant stigning i antallet af celler i G0 /G1 og en tilsvarende reduceret i procentdelen af ​​celler i S-fase i forhold til celler dyrket i fravær af FH535 (fig. 4A). Antallet af celler i G2 blev ikke signifikant ændret ved FH535. Desuden var der ingen sub-G1 peak påvist ved flowcytometri, hvilket indikerer, at FH535 ikke var fremme apoptose ved koncentrationerne bliver brug (se fig S4). Vi gjorde også cellecyklus analyse i LCSC efter FH535 behandling og fundet FH535 på 15 uM betydeligt forårsaget G1 fasen anholdelse i LCSC (P = 0,012). FH535 også signifikant reduceret G2 /M-fasen i LCSC efter 24 timer på 7,5 uM og 15 uM FH535 behandling (P = 0,038 og P 0,001), ingen signifikant S-fasen inhibering blev observeret i LCSC (p = 0,446) (fig. 4B.). Vore data svarer til tidligere offentliggjorte resultater og afspejler β-catenin regulering af cellecyklus er forskellig i forskellige celletyper [32] – [33]. Cellecyklus regulatorer (cycliner, CDK’er og myndigheder) kan variere i forskellige celletyper, som kunne føre til forskellige reaktioner efter FH535 behandling. Dette kan værd at udforske i vores fremtidige studie.

A. Huh7 celler blev dyrket i DMEM + 10% FBS i 24 timer. Cellerne blev vasket med serumfrit DMEM 3 gange, derefter dyrket i DMEM + 0,1% FBS i 24 timer for celle synkronisering. Celler blev derefter dyrket i DMEM + 10% FBS sammen med forskellige koncentrationer af FH535 i 24 timer. Cellerne blev høstet og farvet med propidiumiodid (PI) og analyseret ved flowcytometri ifølge genscript protokollen (Piscataway, NJ, USA). Behandling med FH535 steg procentdelen af ​​celler i G1 og faldt procentdelen af ​​celler i S-fase. Eksperimentet blev udført to gange med lignende resultater. B. LCSC celler blev dyrket i CelProgen komplet LCSC dyrkningsmedium i 24 timer. Celler blev derefter vasket med serumfrit CelProgen medium 3 gange og dyrket i CelProgen Medium + 0,1% FBS i 24 timer til synkronisering af cellerne. Cellerne blev derefter returneret til CelProgen komplet medium + 10% FBS med forskellige koncentrationer af FH535 i 24 timer. Cell cyklus blev analyseret som pr Huh7 beskrevet ovenfor.

3.5 Angivelse af β-catenin målgener cyclin D1 og Survivin hæmmes af FH535

P-catenin kontrol celle spredning og overlevelse af regulering af ekspressionen af ​​talrige mål gener. To veletablerede mål er de gener, der koder Survivin (Birc5) og cyclin D1 (CCND1). Survivin er et anti-apoptotisk protein, der også regulerer progression gennem mitose [34]; Cyclin D1 kontrollerer proliferation ved at aktivere G1 kinaserne cdk4 og CDK6 [35]. Survivin og cyclin D1 transkription reguleres gennem TCF elementer i deres promotorregioner [36]. For at teste om FH535 inhiberer ekspression af disse to β-catenin målgener, blev real-time RT-PCR udført med LCSC og HCC-celler, som blev behandlet med stigende mængder af FH535. Cyclin D1 og Survivin mRNA-niveauer blev reduceret med FH535 i alle tre cellepopulationer i en dosisafhængig måde (fig. 5). For at bekræfte, at denne reduktion i mRNA-niveauer også ført til lavere protein niveauer, blev western analyse udført ved anvendelse af hele celleekstrakter fra Huh7 celler. Både cyklin D1 og survivin proteinniveauer blev reduceret i en dosisafhængig måde, med den største reduktion set i nærvær af 10 uM FH535 (fig. 6.). Densitometrisk analyse viste, at FH535 ved 5 og 10 uM inhiberede cyclin D1 28% og 64%; FH535 ved 5 og 10 uM inhiberede overlevende 24% og 48% (fig. 6).

LCSCs blev Huh7 og Hep3B celler behandlet med DMSO alene eller stigende koncentrationer af FH535 for 38-time PCR for ekspression af cyclin D1 (panel A) eller Survivin (Panel B). I begge tilfælde blev mRNA-niveauer afbildet i forhold til p

2-mikroglobulin. Eksperimentet blev udført to gange med lignende resultater.

Huh7 celler blev behandlet med DMSO alene eller stigende mængder af FH535 for 38-PAGE og overført til Western-analyse med antistoffer mod cyklin D1, Survivin, og β actin. Toppen af ​​shows Western blot billedet; den nederste graf viser densitometrisk analyse af de vestlige data. Denne densitometrisk analyse viste, at FH535 ved 5 og 10 uM hæmmede cyclin D1 protein niveauer 28% og 64% henholdsvis; FH535 på 5 og 10 uM hæmmede survivin protein niveauer 24% og 48% henholdsvis. Eksperimentet blev udført to gange med lignende resultater.

Diskussion

I de senere år har der fundet talrige signalveje blevet impliceret i hepatisk carcinogenese. Den β-catenin pathway er nødvendig stamceller til selvfornyelse og vedligeholdelse af stamcelle egenskaber. Forstyrrelse af denne balance resulterer i både genetiske og epigenetiske ændringer, der findes i mange kræftformer, herunder tyktarmskræft og HCC [4]. I denne undersøgelse anvendte vi FH535 som en inhibitor af β-catenin pathway. Denne forbindelse har tidligere været anvendt til at inhibere β-catenin-ekspression i celler fra colon og lunge samt i celler fra hepatoblastoma og HCC [15]. I denne rapport, forfatterne konkluderede, at FH535 var giftigt for en række cellelinjer, herunder Huh7.