PLoS ONE: Overekspression af Lung Cancer-Prognostisk miR-146b MikroRNA’er har en minimal og negativ effekt på maligne fænotype af A549 Lung Cancer Cells

Abstrakt

Introduktion

Expression niveauer af

miR-146b-5 p

-3p

microRNA i human ikke-småcellet lungekræft ( NSCLC) er forbundet med recidiv af sygdommen efter operationen. For at forstå dette, effekten af ​​

miR-146b

overekspression blev undersøgt i A549 human lunge kræftceller.

Metoder

A549 celler, manipuleret med lentivira at overudtrykke mennesket

pre-mIR-146b

precursor microRNA, blev undersøgt for proliferation, kolonidannelse på plastoverfladen og i blød agar, migration og invasivitet i cellekultur og in vivo i mus, kemosensitivitet til cisplatin og doxorubicin, og global genekspression .

miR-146 B med oprindelse

udtryk blev vurderet i mikrodissekeret stroma og epithel af humane NSCLC tumorer. Foreningen af ​​

miR-146b-5 p

-3p

udtryk i tidligt stadium NSCLC med recidiv blev analyseret.

vigtigste resultater

A549

præ-mIR-146 B med oprindelse

-overexpressors havde 3-8 gange højere niveauer af både

mIR-146 B med oprindelse

microRNA end kontrolceller. Overekspression ændrede ikke celleproliferation, kemosensitivitet, migration eller invasionsevne; påvirket kun 0,3% af mRNA transkriptomet; og, reduceret evnen til at danne kolonier in vitro med 25%. I humane NSCLC tumorer, udtryk for både

miR-146 B med oprindelse

microRNA var 7-10 gange højere hos stroma end i kræft epitel, og højere

miR-146b-5p

men lavere

-3

p niveauer var prædiktive for tilbagefald.

konklusioner

Kun en minimal effekt af

pre-miR-146b

overekspression på den maligne fænotype blev set i A549 celler. Dette kan være på grund af modsatrettede effekter af

miR-146b-5 p

-3p

overekspression som foreslået af de modstridende gentagelse-prædiktive værdier af de to microRNA’er, eller fordi

miR- 146 B med oprindelse

udtryk ændringer i ikke-kræft stroma og ikke kræft epitel af tumorer er ansvarlige for den prognostiske værdi af

miR-146b

Henvisning:. Patnaik SK, Kannisto E, Mallick R , Yendamuri S (2011) overekspression af Lung Cancer-Prognostisk

miR-146 B med oprindelse

MikroRNA’er har en minimal og negativ effekt på maligne fænotype af A549 Lung Cancer Cells. PLoS ONE 6 (7): e22379. doi: 10,1371 /journal.pone.0022379

Redaktør: Boris Zhivotovsky, Karolinska Institutet, Sverige

Modtaget: 5. maj 2011; Accepteret: 20 juni 2011; Udgivet: 18 Juli 2011

Copyright: © 2011 Patnaik et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en sommer praktikplads pris fra American Association of Thoracic Surgery til RM, og priser fra Buswell Foundation, Kræft og leukæmi gruppe B, og thorax kirurgisk Foundation for forskning og uddannelse til SY. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MikroRNA’er er ultrakorte ikke-kodende RNA, der regulerer cellulære processer ved deres sekvens-specifik indflydelse på stabiliteten og oversættelse af flere messenger RNA’er (mRNA’er). Undersøgelser i de seneste år har vist vigtigheden af ​​disse epigenetiske regulatoriske molekyler i kræft biologi [1] samt deres anvendelighed som biomarkører for sygdomstilstande [2]. Vi har tidligere kvantificeret udtryk for microRNA i 77 menneskelige trin I ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tumorer til at identificere microRNA hvis niveauer er forbundet med gentagelse af sygdommen efter kirurgisk resektion [3]. Angivelse af

miR-146 B med oprindelse

microRNA’er,

miR-146b-5 p

miR-146b-3p

, i tumorerne afveg betydeligt mellem tilfælde, der havde en gentagelse, og dem, der ikke gjorde, med den gennemsnitlige

miR-146b-5p

højere niveau, men den gennemsnitlige

miR-146b-3p

lavere niveau i den førstnævnte gruppe. Desuden i interne cross-valideringer,

miR-146b-3p

blev identificeret som en hyppig bestanddel af seks-microRNA support vektormaskine klassificører, der kunne forudsige tilbagefald med en betyde nøjagtighed på 69%. Højere udtryk for

miR-146b-5p

i humane tumorer blev også fundet at være forbundet med dårlig samlet overlevelse i stadium I-III NSCLC i en undersøgelse, der fokuserede på den planocellulært variant af sygdommen, men undersøgte ikke

miR-146b-3p

[4]. Udover lungecancer, et højere niveau af

MIR-146b-5p

i tumorer er også forbundet med en mere malign sygdom i human papillær thyreoideakarcinom [5].

Hos mennesker både

miR-146b-5 p

-3p

microRNA’er er produkter af samme

MIR146B

gen, der er placeret på kromosom 10 ved position q24.32. Ligesom de fleste par af 5p og 3P microRNA’er, de to

MIR-146 B med oprindelse

microRNA er genereret ud fra de modsatte strenge (5′- og 3′-arme) af en dobbeltstrenget stilk-regionen af ​​en precursor microRNA,

pre-mIR-146b

, som igen er afledt af den primære

MIR146B

RNA transkript [6]. Ekspressionen af ​​

MIR-146b-5p

synes at være allestedsnærværende i humane væv, selvom højere niveauer ses i lunge, thymus og milt [7]. Lille RNA kloning og dybe sekventering undersøgelser viser, at mængden af ​​

MIR-146b-3p

i celler er meget mindre end den for

MIR-146b-5p

[8], [9]. En sådan forskel er set i mange 5p og 3p microRNA par, der udgør et flertal af microRNA. Denne streng skævhed menes at være et resultat af termodynamiske effekter på microRNA behandling dikteret af microRNA-sekvenser [10], [11] samt niveauet af target mRNA i det cellulære miljø [12], [13]. Selv om en af ​​de 5p og 3P microRNA’er kan være langt mindre rigelige end den anden (og ofte omtalt som “microRNA * ‘arter), kan det have stor indflydelse på den cellulære tilstand [14], [15]. Det skal bemærkes, at karakteren af ​​strengen forspænding kan variere spatiotemporally. For eksempel

miR-202-service /

miR-202 *

udtryk forholdet ændres fra -0,5 til ~0.9 under kvindelig gonadogenesis på kylling embryoner [16], og mus

miR- 194-5p

er til stede på et højere niveau end

miR-194-3p

i nyre og mave, men på et lavere niveau i lunge og uterus [17].

en række undersøgelser har undersøgt den rolle,

miR-146 B med oprindelse

microRNA i kræft ceil-linjer. I en undersøgelse af U373 humane glioblastom celler blev invasionsevne og migration faldt med overekspression af microRNA og forøget med deres knockdown hjælp antisense-oligonukleotider, og målretningen af ​​udskrifter af

MMP16

matrixmetalloproteinase gen af ​​

miR -146b-5p

blev identificeret [18]. In vitro migration og invasion af et andet menneske glioblastoma-cellelinje, U87-MG, har også vist sig at blive reduceret med

MIR-146b-5p

overekspression [19]. Den microRNA blev vist at målrette udskrifter af

EGFR

gen kodende epidermal vækstfaktor receptor.

EGFR

-targeting af

MIR-146b-5p

er også blevet påvist i MDA-MB-231 humane brystcancerceller [20]. Som i glioblastom studier,

pre-miR-146b

overekspression i cellerne reduceret deres migration og invasionsevne [20]. Lignende resultater blev rapporteret i en anden undersøgelse, der også foreslået en rolle for

miR-146b-5p

i negativ regulering af nukleare faktor-kB (NF-kB) vej [21]. Sådanne funktionelle undersøgelser er ikke udført i lunge kræftceller. For at forstå foreningen af ​​

miR-146 B med oprindelse

microRNA med lungekræft prognose, vi søgte at undersøge virkningerne af overekspression

pre-miR-146b

forløber microRNA på den maligne fænotype af A549 lunge adenocarcinom celle-line.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Al forskning præsenteres her blev godkendt af Institutional Review Board i Roswell Park Cancer Institute (RPCI). Alle eksperimenter dyr blev udført efter godkendelse fra RPCI Institut Animal Care og brug Udvalg under protokol nummer 1132M.

Cell kultur

A549 human lunge adenocarcinom og BEAS-2B normale humane bronchieepithelceller cellelinjer var opnået fra ATCC @ (Manassas, VA). TLA-HEK293T ™, en human embryonal nyre cellelinie afledt af 293T-celle-linje, blev opnået fra Open Biosystems® (Huntsville, AL). A549 og TLA-HEK293T ™ -celler blev dyrket ved 37 ° C i 90% fugtighed og 5% CO

2 i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (+ DMEM; Mediatech®, Manassas, VA) med 10% føtalt bovint serum (PAA Laboratories ®, Pasching, Østrig) i en Steri-Cult ™ inkubator (Thermo Fisher Scientific®, Waltham, MA). LHC-9-medium (Invitrogen®, Carlsbad, CA) blev anvendt til BEAS-2B-celler. Cellelinier genereret i denne undersøgelse blev dyrket i nærvær af 2 ug /ml puromycin (Roche®, Indianapolis, IN). Celler blev høstet under anvendelse af 0,05% trypsin med 0,25 mM ethylen-diamin-tetraeddikesyre (Invitrogen®). Celler blev ikke dyrket i mere end seks uger, og samtidigt-dyrkede og tilsvarende-alderen celler blev anvendt ved sammenligning af cellelinjer. Vedligeholdelse kulturer på semi-sammenløb blev brugt til at oprette eksperimenter. Et scepter ™ elektronisk tæller (Millipore®, Billerica, MA) eller engangs hæmacytometer dias (Incyto®, Düsseldorf, Tyskland) blev anvendt til at måle celle-tætheder af resuspenderede celler.

Dannelse af stabilt-transducerede celle -lines

Supplerende, enkeltstrengede DNA-oligonukleotider med mennesket

pre-miR-146b

sekvens (miRBase [22] tiltrædelse nummer MI0003129) og begrænsning enzym-site udhæng blev opnået fra Integrated DNA Technologies® (Coralville, IA). Oligonukleotider blev også opnået for en variant sekvens, hvor segmenterne for

miR-146b-5 p

-3p

microRNA omlagt. Efter udglødning at generere dobbeltstrenget DNA blev oligonukleotider ligeret til

Xho

I- og

Ikke

I (Invitrogen®) -digested pLemiR ™ vektor (Open Biosystems®). TOP10 ™ kompetent

E. coli

(Invitrogen®) var varme-transformeret med ligeringsprodukterne. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra kulturer af udvalgte enkelte kloner anvendelse af et kit leveret af Qiagen® (Valencia, CA). Identitet af plasmider blev bekræftet ved DNA-sekventering ved en kerne facilitet på Roswell Park Cancer Institute i Buffalo, NY (RPCI). Udviklet lentivira fremstilledes ved transfektion plasmider ind i TLA-HEK293T ™ celler ved hjælp af reagenser og protokoller følger med Trans-Lentiviral GIPZ ™ pakkesystem (Open Biosystems®). A549-celler blev transduceret med virus i 48 timer og derefter underkastet selektion mod 2 ug /ml puromycin for omkring to uger at generere cellelinier A549 /vec, A549 /146 B med oprindelse, og A549 /v146b anvendelse vira genereret med en tom pLemiR ™ vektor eller med vektoren bærer den fysiske eller varianten

pre-miR-146b

sekvens, henholdsvis.

Flowcytometri

Flowcytometri af frisk-høstede celler farvet med 1 ug /ml

7

amino-actinomycin D viabilitetsfarvestoffet (Sigma®, St. Louis, MO) blev udført på en FACSCalibur maskine (BD Biosciences®, San Jose, CA). Videre- og side-scatter, og fluorescens i FL2 og FL4 kanaler blev registreret for 10.000 begivenheder og FL2 fluorescens-værdier blev afbildet efter gating ud døde celler med CellQuest ™ Pro software (version 5, BD Biosciences®).

Celleproliferationsassay

celleproliferation assays blev udført ved anvendelse af Cell Counting Kit-8 assay (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies®, Rockville, MD), som anvender bioreduktionen af

2

-(

2

-methoxy-

4

-nitrophenyl)-

3

-(

4

-nitrophenyl)-

5

-(

2

,

4

-disulfophenyl)-2H tetrazolium natrium (WST-8) til orange formazan at måle cellernes levedygtighed. Kort beskrevet blev 100 pi celler ved 2-4×10

4 /ml celler blev udpladet på 96-brønds dyrkningsplader. På forskellige tidspunkter i løbet af de næste fire dage blev dyrkningsmediet i firdobbelte brønde erstattet med frisk medium indeholdende 5% CCK-8 reagens, og efter en time blev absorbans ved 450 nm målt på et Multiskan Plus (MTX Lab Systems® , Vienna, VA) pladelæser. Absorbansværdier blev korrigeret ved at subtrahere de af kontrolbrønde, der ikke har celler.

Drug følsomhed assay

Celler blev dyrket til 50% -60% konfluens i 96-brønds dyrkningsplader i fem eksemplarer, når blev dyrkningsmediet udskiftet med det, der indeholder 0,5-2,0 ug /ml af enten doxorubicinhydrochlorid (Enzo Life Sciences®, Farmingdale, NY) eller cisplatin (Calbiochem®, San Diego, CA) eller ingen af ​​delene. Efter to dages dyrkning blev levedygtigheden af ​​celler målt som beskrevet for celleproliferationsassay.

kolonidannelse assays

I adhærente kolonidannelse assays, 200 celler blev udpladet pr 35 mm-dyrkningsskål i tre eksemplarer og dyrket med ændrer medium hver 4-5 dage. Efter 10-14 dage blev skåle farvet med 0,2% methylenblåt i 40% methanol i 30 minutter. For kolonidannelse i blød agar, blev en skål først belagt med 1,5 ml medium indeholdende 0,7% agar (Sigma®), før celler, i 2 ml medium indeholdende 0,35% agar, tilsat ved 150 celler /skål. Efter polymerisation af agarose i cirka 15 minutter blev 2 ml medium tilsat. Celler blev dyrket i 6-7 uger med medium skifter hver 4-5 dage, og derefter farvet med 2 mg /ml thiazolyl blå tetrazoliumbromid (Sigma®) i 4-8 timer i cellekultur inkubator. Farvede retter blev scannet på en Perfection V700 (Epson®, Long Beach, CA), og et minimum areal på billeder, der svarer til 3778 eller 199 um

2, henholdsvis for de vedhængende og bløde agar koloni analyser blev anvendt til at identificere kolonier til kvantificering ved hjælp ImageJ ™ -software (version 10.2 National Institute of Mental Health, Bethesda, MD).

In vitro sårheling assay

Six-brønds kulturplader blev markeret med en cross-hår mønster på den udvendige overflade af deres bunde. Celler blev derefter udpladet in triplo med stor tæthed til at opnå 100% konfluens en dag senere, når en ca. 2 cm lange og 0,5 mm brede sår blev fremstillet ved at trække en plastik 10 pi pipette-tip langs en lige kant med moderat og konsekvent pres at ridse cellemonolaget. Dyrkningsmediet blev derefter erstattet. Celler blev afbildet med det samme, og efter en dag med kultur ved 50x forstørrelse på de samme steder langs ridser.

Transwell ™ migration og invasion assays

Fireogtyve-såvel Transwell ™ -plader med en polycarbonat membran og en 8 um porestørrelse blev opnået fra Corning (Corning, NY). Semikonfluente celler, der var blevet sultet i 16-20 timer efter dyrkning i serumfrit + DMEM-medium blev høstet fra 10 cm-petriskåle, vasket to gange med phosphatbufret isotonisk saltvand (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na

2HPO

4 og 1,76 mM KH

2PO

4 ved pH 7,4), og re-suspenderet i serum-frit + DMEM-medium på 2-3 × 10

5 celler /ml. Celler blev udpladet i tredobbeltbestemmelse i 0,1 ml + DMEM pr Transwell ™, med bund brønde indeholdende 0,6 ml + DMEM medium med 15% føtalt bovint serum. Det samme volumen af ​​cellesuspensioner blev samtidigt udpladet in triplo i brønde i 24-brønds dyrkningsplader for indirekte vurdering celletæthed ved måling af cellelevedygtighed efter 8-16 timer som beskrevet for celleproliferationsassay. For invasion assays, Transwell ™ membranerne blev præ-coatet med enten Cultrex ™ PathClear ™ basalmembran ekstrakt fremstillet fra murine Engelbreth-Holm-Swarm-tumorceller, eller kollagen I fra glyse (Trevigen®, Gaithersburg, MD). Coating blev udført ved layering 50 pi af proteinerne ved 1,5 mg /ml og 50 pg /ml, i serumfrit + DMEM-medium og tillade lagene at tørre under 90% fugtighed ved 37 ° C i 1 time og 16- 24 timer. Tørrede lag blev skyllet tre gange med serumfrit + DMEM medium inden cellerne blev udpladet. Efter 8 eller 16-20 timer, henholdsvis for migrationen eller invasion assays, øvre overflader af Transwell ™ membraner blev udslettet med vatpinde til at fjerne ikke-migrerede celler. I migration assayet blev cellerne forbliver i membranerne fikseret med 10% neutral bufret-formalin og farvet natten over med 0,2% vægt /volumen krystal violet (Sigma®) i 2% ethanol. Efter grundig vask med vand for at fjerne eventuelt ikke-inkorporeret farvestof blev 300 pi 10% eddikesyre tilsat til hver Transwell ™ at udvinde bundne farvestof ved at ryste brøndene på 100 omdrejninger /minut i 20 minutter. Ekstrakterne blev analyseret for absorbans ved 595 nm ved anvendelse af 10% eddikesyre som reference. I invasionen assays blev rød fluorescens billeder af celler i Transwell ™ membraner erhvervet til 50x forstørrelse i tre forskellige field-visninger. De absorbansaflæsningerne eller det gennemsnitlige antal celler pr blev normaliseret under anvendelse af de cellelevedygtighed målinger af de celler, der var blevet samtidigt udpladet i separate kulturer.

Pulmonal tumordannelse assay

Dette arbejde blev godkendt af forskellige institutionelle udvalg på RPCI. Celler dyrket til ca. 70% konfluens blev høstet ved trypsinisering i tre minutter, vasket med PBS, og resuspenderet i iskold + DMEM ved 5 × 10

6 celler /ml. En ekspert tekniker brugte en 1 ml-sprøjte med en 27 G nål at injicere 0,2 ml af celler i halevenen af ​​immundefekte, kvindelige, 6-10 uger gamle mus af CB-

Igh

–

1

b-service /lcrTac-

Prkdc

scid

/Ros stamme. Mus blev overvåget to gange ugentligt for besværet vejrtrækning samt til generel utilpashed og synlige udseende af en cancerøs læsion eller vækst, og aflivet efter 12 uger, selv om ingen af ​​musene havde nogen af ​​disse symptomer eller tegn. Lunger blev fjernet, vasket med PBS, der er fastsat for en dag med 10% neutral bufferet-formalin, og vejet efter duppe overskydende væske med køkkenrulle.

Laser capture microdissection (LCM)

Dette arbejde blev godkendt af en institutionel gennemgang bord RPCI, og udføres under tilsyn af en patolog i Patologisk Institut for RPCI på væv fra 12 tilfælde af fase i NSCLC, der var blevet behandlet på instituttet. Formalin-fikseret, paraffin-indstøbt blev 6-8 um tykke væv-sektioner med mindst 70% tumorvæv som verificeret af histologisk undersøgelse af en patolog brugt. Tissue-sektioner blev anbragt på objektglas overtrukket med en polyethylennaphthalat membran (Leica®, Wetzlar, Tyskland) og tørret natten over ved stuetemperatur. Efter de-paraffinization med xylen efterfulgt af en gradvis rehydrering natten over under anvendelse graduerede alkoholer blev objektglassene farvet med hematoxylin og eosin, og lufttørret natten over. LCM blev udført på et LMD6000 systemet (Leica®) ved 200x forstørrelse med laser magt, hastighed og prøve-balance indstillingerne for 80, 2 og 11, hhv. Tumor-holdige regioner på sektionerne blev identificeret ved den ændrede cellulære morfologi af cancerøse epitelceller. Stromale og cancerøse epiteliale komponenter til sådanne områder blev mikrodissekeres og opsamlet i separate 0,5 ml rør. For hver komponent, områder af 1-12 × 10

6 um

2 (ca. 0,5-7 × 10

4 celle-sektioner) blev indsamlet. Den stromale-til-epitelial område forholdet varierede fra ca. 0,6 til 1.

Isolering af RNA

Silica kolonner, reagenser og protokoller forsynet med Purelink ™ RNA (Invitrogen®), eller High Pure ™ microRNA (Roche®) og FFPE RNA (Norgen Biotek®, Thorold, Canada) kits henholdsvis blev brugt til at isolere alt fra 2-5 × 10

6 dyrkede celler eller fra proteinase K-behandlede Mikrodissekterede celler. koncentration nukleinsyre i forberedelserne blev anslået ved absorbans spektrofotometri på Ultrospec II (LKB Biochrom®, Cambridge, UK) eller NanoDrop ™ 1000 (Thermo Fisher Scientific®) instrumenter. En fluorometrisk assay ved anvendelse Quant-iT ™ RiboGreen (Invitrogen®) blev anvendt til at kvantificere nukleinsyrer i præparater fra de Mikrodissekterede celler. Total RNA fra MCF-7 human brystcancer og ML-2 human akut myeloid leukæmi celler blev venligst stillet til rådighed af henholdsvis forskergrupper af Drs. Gokul Das og Eunice Wang af RPCI.

Semi-kvantificering af microRNA ved revers transkription-PCR (RT-PCR)

Semi-kvantificering af menneskelige microRNAer

Lad-7a

,

miR-30a-5p

,

miR-146b-5 p

miR-146b-3p

, og den lille nucleolar RNA

RNU6B

var gøres med RT-PCR-baseret TaqMan ™ miRNA tests (Applied Biosystems®, Foster City, CA; assay id’er 377, 417, 1097, 2361 og 1093, henholdsvis). Kort fortalt blev et RNA-specifik oligonucleotid, og reagenser tilvejebragt med TaqMan ™ MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems®), der anvendes til revers transkribere 10 ng totalt RNA fra celler, eller 5 pi 0.5-2000 Fm syntetiske modne microRNA

miR-146b-5 p

-3p

med 5 ‘fosfat og 3’ hydroxyl terminii fås fra Invitrogen®. CDNA’et blev anvendt som template i 40 cyklus-PCR-reaktioner på en 7900HT realtids-PCR-maskine (Applied Biosystems®). For hver reaktion kvantificeringen cyklus (C

q

) værdi, omtrent omvendt proportional med log

2 værdien af ​​koncentrationen af ​​analytten RNA blev opnået med SDS ™ software (Applied Biosystems® ; version 2.3). Gennemsnittet af C

q

værdier af tredobbelte PCR-reaktioner blev anvendt til analyse. Efter behov, C

q

værdier for microRNA blev normaliseret ved at trække værdien for den lille nucleolar

RNU6B

RNA.

Gen-ekspression analyse ved hjælp BeadChip ™ -teknologi

Total RNA, isoleret fra A549 /VEC og A549 /146 B med oprindelse celler i to forsøg til biologisk dobbeltarbejde, blev givet til den delte genekspression facilitet i RPCI for analyser. Absorbans spektrofotometri og elektroforese på NanoDrop ™ 1000 og Bioanalyzer ™ 2100 (Agilent Technologies®, Santa Clara, CA), henholdsvis viste, at RNA-præparationer havde 260 nm /280 nm absorbans-forholdene i 1.9-2.0 området, 260 nm /230 nm absorbans nøgletal 1,8, og RNA integritet tal 7. Illumina® TotalPrep RNA Amplification kit (Ambion®, Autin, TX) blev anvendt til at omdanne 500 ng RNA til cDNA, som derefter blev transkriberet in vitro for at frembringe biotin-mærket RNA. Hybridiseringsbetingelser reagenser blev blandet med 750 ng af mærket RNA, og blandingen blev hybridiseret natten over ved 58 ° C til HumanRef-8 v3.0 Expression BeadChips ™ array (Illumina®, San Diego, CA), der har prober til detektion 24,526 kommenterede humane transkripter . Efter vask og farvning med Cy3 dye-mærket streptavidin, BeadChips ™ blev afbildet under anvendelse af BeadArray Reader (Illumina®). Dataene blev erhvervet med GenomeStudio ™ -software (version 2010,1, Illumina®), og derefter behandles til background-korrektion, varians-stabiliserende transformation, og derefter robuste splines-normalisering mellem arrays ved hjælp af Lumi BioConductor pakken (version 1.14) for R sprog (version 2.11.1) med standardindstillinger. Rå og behandlede data kan findes i NCBI Gene Expression Omnibus repository med tiltrædelsen nummer GSE29496. God kvalitet af dataene blev bekræftet ved at undersøge forskellige aspekter af data som anbefalet af Illumina®. Multi-test med en parret t-test med modererede t statistik og Benjamini-Hochberg korrektion for falsk opdagelse sats blev udført på de behandlede data ved hjælp af limma BioConductor pakken (version 3.4.5).

Andet

en EOS 450D digitalkamera (Canon®, Lake Success, NY) og et Axio ™ Observer mikroskop (Zeiss®, Maple Grove, MN) blev anvendt til Mikrofotografi. Medmindre andet er angivet, blev kemikalier indkøbt fra Sigma eller Thermo Fisher Scientific®. RNA sekundær struktur forudsigelse ved hjælp mfold [23] med standardindstillinger blev udført online på https://mfold.rna.albany.edu. Statistiske analyser og graf plotte blev gjort med Prism ™ -software (version 5.0c, GraphPad Software®, La Jolla, CA). Alle t-tests var to-sidede, antaget ens varianser, og bruges 0,05 som cut-off for at beslutte signifikans.

Resultater

Generering af A549 cellelinier overekspression

miR-146b

microRNA

for at undersøge effekten af ​​

miR-146b

overekspression i lungekræft celler, menneskelig A549 lunge adenocarcinom celler blev manipuleret til at overudtrykke mennesket

pre-miR-146b

forløber microRNA. Den pLemiR ™ lentiviral vektor, som bærer et gen for puromycinresistens, blev modificeret ved at indsætte DNA for præ-microRNA-sekvensen i den 3 ‘utranslaterede region af genet, der koder for TurboRFP rødt fluorescerende protein og drevet af de konstitutivt aktive cytomegalovirus (CMV ) promotoren. Efter transduktion med lentivirus, og puromycinselektion, en stabil population af celler opkaldt A549 /146b blev genereret. Den A549 /VEC celle-line blev genereret ved hjælp pLemiR ™ vektor uden en indsats. A549 /v146b celler blev genereret ved hjælp af vektoren med en variant menneske

pre-miR-146b

sekvens. I varianten, nukleinsyresegmenterne svarende til

miR-146b-5 p

–

3P

microRNA sekvenser blev byttet (figur 1A) med tanken om, at variationen kan resultere i en relativt højere udtryk for

miR-146b-3p

, da blandt menneskelige microRNA, der genereres fra de 5P armene på pre-microRNA’er tendens til at blive udtrykt mere end dem fra 3P arme [11]. Den mfold [23] RNA-folde algoritme forudsiger, at ligesom naturlig

pre-miR-146b

, varianten pre-microRNA har også en hårnåle-formen (figur 1A), med en AG på -31,9 kcal /mol, som er 5,2 kcal /mol mere end den naturlige pre-microRNA.

A

. Mest stabile mfold-forudsagt sekundære strukturer af menneskelig

pre-miR-146b

en variant pre-microRNA undersøgt i dette studie. De 5 ‘og 3’ ender, nukleotidpositioner, og segmenter svarende til modne

miR-146b-5 p

-3p

sekvenser (

5 p

3p

) er angivet.

B

. Histogrammer for rød fluorescens kvantificeret ved flowcytometri af A549 og A549-afledte cellelinjer stabilt transduceret med lentivirus bærende konstruktioner manipuleret til ekspression af human

pre-miR-146b Hotel (

A549 /146b

) eller dens variant vist i

A

(

A549 /v146b

), eller ingen (

A549 /VEC

).

C

. Sammenligning af

miR-146b-5 p

-3p

niveauer (

5 p

3p

), normaliseret til den for

RNU6B

lille nucleolar RNA, i A549-afledte cellelinier som vurderet ved anvendelse af revers transkription efterfulgt af PCR (RT-PCR). Midler og deres standardfejl for målinger fra tre forskellige forsøg er vist.

D

. Standard kurver, der viser forholdet mellem kvantificering cyklus (

C

q

) værdi og koncentrationen af ​​RNA i

miR-146b-5 p

-3p

(

5 p

3p

) RT-PCR-analyser af syntetisk

miR-146b-5 p

-3p

RNA hhv. En log

2 skala anvendes til X-aksen.

E

. Semi-kvantificering af de relative mængder af

miR-146b-5 p

og

-3p

i RNA af 293T, BEAS-2B, MCF-7, og ML-2 (midler, enlige eksperimenter ), og de tre A549-afledte cellelinjer, (midler og deres standardfejl for målinger fra tre forskellige eksperimenter) er vist.

Stærk og stabil ekspression af præ-mikroRNA-bærende TurboRFP genet i 90% af celler af hver cellelinje blev bekræftet ved fluorescens flowcytometri (figur 1B og data ikke vist). Flere cellulære RNA præparater blev analyseret for

miR-146b-5 p

-3p

modne microRNA ved RT-PCR. Overekspression af

miR-146 B med oprindelse

microRNA’er blev observeret i både A549 /146b og A549 /v146b cellelinier (figur 1C). Sammenlignet med A549 /VEC,

miR-146b-5 p

-3p

udtryk, normaliseret til den for 45 basis-lange, husholdning lille nucleolar RNA gen

RNU6B

, var henholdsvis et gennemsnit på 4.9- og 6.6 gange højere i A549 /146 B med oprindelse celler. I A549 /v146b, de var henholdsvis et gennemsnit på 2.6- og 6.5 gange højere, hvilket tyder på varianten pre-microRNA udtrykt af den blev forarbejdet til moden

miR-146b-5 p

-3p

microRNA. Til mere præcist at kvantificere effekten af ​​variationen af ​​forholdet mellem mængder af

miR-146b-5 p

-3p

i cellerne, syntetisk

miR-146b-5p

og

-3p

RNA’er blev anvendt til at generere standardkurver at undersøge forholdet mellem RT-PCR-målinger (C

q

værdier) og RNA beløb. Selvom analyser for begge microRNA havde lignende RT-PCR kinetik, med hver log

2 enhed ændring i RNA input producerer cirka en enhed ændring i C

q

værdi over en fortynding vifte af 12 log

2 enheder, følsomheden af ​​

miR-146b-5p

assay var højere med ca. 3,6 C

q

enheder (figur 1D). Derfor

miR-146b-3p

C

q

værdier blev justeret ved at trække 3,6 for at sammenligne mængden af ​​

miR-146b-5 p

-3p

RNA. I alle de tre A549-afledte cellelinjer,

miR-146b-5p

microRNA var til stede ved et beløb, der var omkring 4-6 gange højere end den

-3p

microRNA (figur 1E). Variationen i den præ-microRNA sekvens blev fundet at have nogen signifikant virkning på forholdet mellem mængder af

miR-146b-5 p

-3p

i A549 /v146b celler i forhold til den A549 /146 B med oprindelse celler. Undersøgelse af RNA fra det humane 293T embryoniske nyre, BEAS-2B normal bronchial, MCF-7 brystkræft, og ML-2 akutte myeloide leukæmiceller, indikerede, at i disse cellelinier også,

MIR-146b-5p

er til stede i et 4-22 gange højere molært overskud end

-3

p (figur 1E). Således er den modne microRNA dannet fra 5p streng af

pre-MIR-146b

synes at være meget mere udbredt end den fra 3p-strengen, som foreslået af andre undersøgelser [8], [9]. Ekspression af miR-146b-5p i 293T, BEAS-2B, MCF-7 og ML-2-celler var 23.8-, 0,7-, 0.6- og 2.8-fold af, at der i A549 /VEC.

Overekspression af

miR-146b

microRNA har kun en mindre effekt på A549-fænotype

A549-afledte cellelinier blev undersøgt for at identificere en effekt af

miR-146b

overekspression på A549-celler. Celle levedygtighed målinger over tid foreslået at sammenlignet med A549-vec, både A549 /146b og A549 /v146b prolifererede ligeledes i celle-kultur (figur 2A). Steget

MIR-146 B med oprindelse

niveauer synes ikke at påvirke følsomheden af ​​cellerne for enten cisplatin eller doxorubicin ved lægemiddelkoncentrationer varierende fra 0,5 til 2 pg /ml, selv om lægemidlerne var klart cytotoksisk for cellerne ved den højeste koncentration (figur 2B). Begge er anticancerlægemidler, der anvendes til behandling af NSCLC. Men med overekspression af microRNA, både A549 /146b og A549 /v146b celler dannet kun 80% og 65% af henholdsvis så mange kolonier som A549 /vec gjorde fra individuelle celler i adhærerende cellekultur på plastoverfladen af ​​væv kultur plader (t test P-værdier på 0,04 og 0,01, henholdsvis).