PLoS ONE: Kvantificering af Cell-Free mSHOX2 Plasma DNA for Terapi Overvågning Advanced Stage ikke-småcellet (NSCLC) og småcellet lungekræft (SCLC) Patients

Abstrakt

Formål

De fleste patienter med fremskreden lungekræft dør inden for få måneder. For at udnytte nye terapi regimer, vi har brug for bedre metoder til vurdering af en terapi respons.

Materiale og metoder

I en pilotundersøgelse vi fremadrettet indskrevet 36 patienter med fremskreden NSCLC og SCLC (34 trin IV , 2 trin IIIB), hvoraf 34 modtog standard platinbaseret kemoterapi /strålebehandling og to blev behandlet med en tyrosinkinasehæmmer. Vi målte niveauer af ekstracellulært methylerede

SHOX2

DNA (

mSHOX2

) i plasma før og under behandling, indtil re-iscenesættelse.

mSHOX2

analyse blev blindet med hensyn til de kliniske data gør det til et observationsstudie.

Resultater

Ifølge re-iscenesættelse af 31 first-line patienter, 19 patienter blev klassificeret som ikke-responderende, mens 12 patienter var i respondergruppen. Vi observerede en stram sammenhæng mellem radiologiske data og ændringen af ​​plasma

mSHOX2

niveau som svarer til en terapi svar. En ROC analyse viste en høj diskriminerende effekt for begge patientgrupper allerede en uge efter terapi start (AUC 0,844). Derudover en Kaplan-Meier og Cox proportionel risiko analyser afslørede en stærk sammenhæng mellem overlevelse og plasma

mSHOX2 Drømmeholdet værdi p≤0.001 (hazard ratio 11.08) giver nogle beviser for

mSHOX2

også være en prædiktiv markør.

Konklusion

den langsgående måling af ekstracellulær plasma

mSHOX2

DNA giver information om respons på cytotoksisk behandling og tillader en tidlig vurdering af behandlingsrespons for patienter med lungecancer. Hvis bekræftet i en større undersøgelse ville det være et værdifuldt redskab til at udvælge og lede et cytotoksisk behandling

Henvisning:. Schmidt B, Beyer J, Dietrich D, Bork I, Liebenberg V, Fleischhacker M (2015) Kvantificering af Cell-Free

mSHOX2

Plasma DNA for Terapi Overvågning Advanced Stage ikke-småcellet (NSCLC) og småcellet lungekræft (SCLC) Patienter. PLoS ONE 10 (2): e0118195. doi: 10,1371 /journal.pone.0118195

Academic Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES

Modtaget: September 16, 2014 Accepteret: 6 jan 2015; Udgivet: 12 Februar 2015

Copyright: © 2015 Schmidt et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Kirstin Diehl Stiftung. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Metanomics Health GmbH ydet støtte i form af løn til forfattere [Volker Liebenberg], men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« sektion

Konkurrerende interesser:. Volker Liebenberg har været ansat i Metanomics Health GmbH fra 2010 til juli 2012. Metanomics Health GmbH er et 100% datterselskab af BASF , kemisk virksomhed og har ikke været aktiv i forskning eller udvikling af DNA-relateret lungekræft biomarkører før eller i den tid af Volker Liebenberg beskæftigelse. Volker Liebenberg og Dimo ​​Dietrich har været medarbejdere og er aktionærer Epigenomics AG, et selskab, der har til formål at kommercialisere DNA methylering markør SHOX2. Volker Liebenberg og Dimo ​​Dietrich er coinventors og egne patenter på methylering biomarkører og relaterede teknologier. Patenter: “En metode til Amplification af nukleinsyrer” (WO2006113770), “En metode til Carry-over Beskyttelse i DNA Amplification Systems Målretning Methylering Analysis Opnået af en Modified Forbehandling af nukleinsyrer” (WO2006040187). Disse patenter er kommercielt udnyttet af Epigenomics AG. Volker Liebenberg og Dimo ​​Dietrich modtager opfinderens kompensation fra Epigenomics AG. Michael Fleischhacker, Bernd Schmidt og Dimo ​​Dietrich er coinventors af et patent. Patent: “Metoder til vurdering af behandlingsrespons af kræftpatienter og til behandling af kræftpatienter ved at analysere CpG methylering” (Application nummer: 62.076.674, patentanmeldt). Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Lungekræft er stadig et sundhedsproblem og i 2012 var der mere end 409 tusind nye lunge kræfttilfælde i Europa [1]. De femårige overlevelsesrater for lungekræft på alle stadier er 16%, og kun en smule bedre end det var for 30 år siden [2]. I de senere år blev der indført flere nye terapi regimer, herunder en række forskellige multimodale behandlinger til patienter med lokalt fremskreden, sent tidspunkt og metastatisk sygdom [3]. Fremskridt i de systemiske behandlinger ikke blot føre til en forbedret overlevelse, men også til en reduktion af kræftrelaterede symptomer og en højere livskvalitet [4]. Alligevel er det terapeutiske vindue stadig er lille, og det er vigtigt at have en fremgangsmåde til en tidlig reaktion evaluering at vælge den optimale terapi. Den foretrukne metode til vurdering af behandlingsrespons er en re-mellemstation efter to til fire cykler af systemisk terapi (dvs. efter 6 til 12 uger) ved hjælp af et billeddannende teknik som CT, MRI eller PET. Bortset fra de høje omkostninger, er disse teknikker ikke særlig følsom [5] [6]. Et alternativ kunne være brugen af ​​biomarkører som

CYFRA-21

,

SCCA

,

CEA

og

CA-125

for NSCLC patienter og

ProGRP

NSE

for SCLC patienter at korrelere dem med terapi svar [7]. Desværre er der ingen universel markør, nyttige for alle de forskellige lungekræft histologier og der er ikke nok beviser for nogen af ​​dem at blive rutinemæssigt anvendes i klinikken.

Mandel og metais var de første til at beskrive deres observation af tilstedeværelse af ekstracellulære nukleinsyrer i mennesker [8]. Tumorassocierede genetiske ændringer kan findes i cellefrie nukleinsyrer isoleret fra alle de forskellige kropsvæsker [9,10] [11]. Ifølge vores nuværende viden kan også påvises alle tumorassocierede ændringer findes i tumorceller i ekstracellulære nukleinsyrer, herunder epigenetiske ændringer forbundet med udvikling af ondartede tumorer. DNA methylering og cytosin methylering er kendetegnende for pattedyr kromatin, spiller en rolle i reguleringen af ​​udvikling og er vigtige i grundlæggende biologiske processer som embryogenese og celledifferentiering [12] [13]. Som sådan DNA methylering regulerer gen transskription og epigenetiske ændringer i onkogener og tumorsuppressorgener og er af afgørende betydning for udviklingen af ​​kræft [14]. For nylig, methylering af

SHOX2

gen (

mSHOX2

) er blevet beskrevet som en ny og kraftfuld markør for en tidlig påvisning af patienter med lungekræft baseret på en analyse af bronchiale udsugninger og plasma [15] [16] [17], evaluering af paramalignant og maligne pleuraekssudat [18], en undersøgelse af nålen aspirater for lungekræft iscenesættelse [19], og som en indikator for udfaldet i NSCLC patienter [20]. Denne undersøgelse blev udført for at vurdere i) om kvantitativ analyse af

mSHOX2

plasma DNA korrelerer med behandling hos patienter med lungecancer og ii) at bestemme den bedste tid til at udføre en analyse af denne biomarkør.

Materiale og metoder

patienter

Vi fremadrettet indskrevet 36 patienter, der efter hinanden blev henvist til vores ambulatorium for diagnosticering og behandling af lungekræft. Vi inkluderede patienter med et sent tidspunkt /avanceret histologisk påvist lunge tumor (uafhængig af typ af lungekræft), som var berettiget til en kemo /radio-kemoterapi og havde underskrevet en skriftlig tilladelse til at deltage i denne undersøgelse. Når de kliniske data wase kombineret med

mSHOX2

målinger vi indså, at fem patienter havde modtaget en behandling inden indskrivning i vores undersøgelse. Alle andre 31 patienter fik en første-line behandling. Detaljerne i de kliniske data for alle patienter er opsummeret i tabel 1-3. De prøver til den histopatologiske diagnose blev opnået ved bronchoskopi og /eller computertomografi (CT). Alle undtagen én patient fik en standard platinbaseret kombination kemoterapi og om nødvendigt en ekstra strålebehandling i henhold til eksisterende retningslinjer. [21]. Som en del af den diagnostiske oparbejdning alle lungekræftpatienter screenes for EGFR-mutationer. Patienter UKH10 og UKH 031 demonstrerede en aktiverende EGFR-mutation og blev behandlet med erlotinib. Efter tre terapi cyklusser patienterne blev re-iscenesat af læger i den lokale tumor board baseret på repeat-CT. Svaret evaluering og tildeling af patienten som respondere og non-respondere, henholdsvis blev udført i henhold til RECIST v1.1 kriterier. Undersøgelsen er godkendt af Institutional Review Board (IRB) på University Hospital i Halle /Saale. Informeret samtykke (skriftlig) blev opnået fra alle donorer. Vejviser

Forberedelse af plasmaprøver

Vi opnåede 2 x 8,5 ml EDTA-blod fra alle patienter på det tidspunkt diagnosetidspunktet (præ-terapi = baseline), og hver gang patienterne blev kontrolleret for deres blodtal eller når de modtog en behandling med kemoterapi (normalt med intervaller på 7 til 10 dage). Patienterne blev fulgt indtil udgangen af ​​tre terapiprogrammer, dvs. den tid af re-iscenesættelse. Plasmaet blev fremstillet ved at spinde blodprøverne (inden for 1 til 2 timer efter blodtapning) i 15 minutter ved 500x g. Efter omhyggelig overførsel af plasmaet supernatanten til et nyt rør blev prøven centrifugeret i en anden gang i 15 minutter ved 2500x g. Alle prøver blev opbevaret i 3-4 ml prøver ved -80 ° C indtil anvendelse.

Real-time kvantificering af

mSHOX2

plasma DNA

Fri-kredsløbs-DNA fra 3,5 ml plasmaprøver blev isoleret og bisulfit omregnet ved hjælp af Epi proColon Plasma Quick Kit (Epigenomics AG, Berlin, Tyskland). DNA isolation og bisulfit konvertering blev udført efter instruktion med mindre modifikationer. DNA’et blev endeligt elueret fra perlerne med 68 pi elueringspuffer. Sammen med patientprøver målte vi en kalibrator prøve (dvs. 5 ng kunstigt methyleret bisulfit omdannet DNA). Den følsomme og kvantitativ qPCR analyse af

mSHOX2

blev udført som tidligere beskrevet [16]) [18]. Hver prøve blev målt i seks PCR replikerer og en relativ methylering værdi (= PMR, procent methylering reference) for

mSHOX2

blev beregnet under anvendelse af tilpasset ΔΔCT metoden [16]. De

mSHOX2

DNA kvantificering blev udført efter alle prospektivt indsamlede plasmaprøver var fuldstændige, nemlig at gøre denne analyse en observationsstudie.

Statistik

Forskelle af methylering niveauer (PMR) i blodplasma af reponders og ikke responderede på basislinien og opfølgning tidspunkter 1-8 blev testet ved hjælp af uparrede to-sample Wilcox tests (Mann Whitney) Da PMR data ikke var normalt fordelt. P-værdierne blev Bonferroni korrigeret. Andre beskrivende data egenskaber bruges var median og median absolutte afvigelse (MAD). Responder Operator Karakteristik (ROC) kurver blev anvendt til at visualisere evne til

SHOX2

markør til at skelne mellem respondere og non-respondere på forskellige tidspunkter. Samlet overlevelse blev beregnet ved hjælp af Kaplan-Meier og univariate Cox proportionel risiko regressions modeller. Analyserne blev udført med SPSS 21 softwarepakke (IBM, Armonk, NY) og R henholdsvis [22].

Resultater

Tildelingen af ​​de 36 prospektivt inkluderede patienter i responders og non-respondere, henholdsvis var fuldstændig uafhængig af

mSHOX2

analyse. Tredive én patienter fik en første-linje-behandling (tabel 1 og 2), mens fem patienter var blevet behandlet inden indskrivning i undersøgelsen (tabel 3). Alle undtagen to patienter viste en vildtype

EGFR

gen og modtog en standard platinbaseret kemoterapi, mens de to patienter med en aktiverende

EGFR

mutation blev behandlet med TKI. Syv af disse 31 patienter viste en baseline PMR værdi ≤ 1%, hvilket antages at være det niveau af teknisk /biologisk varians. De kliniske data fra de 31 patienter er opsummeret i tabel 1 og 2. Alle patienter, der klinisk responderede på behandlingen viste et fald i deres

mSHOX2

plasma-DNA (fig. 1). I denne gruppe af respondenter et fald på

mSHOX2

DNA blev set i de fleste af de patienter, der allerede på tidspunktet for den første blodprøve (dvs. dag 7-10 efter terapi start). De mediane PMR værdier af de patienter, der responderede på behandlingen var 4,06% ved baseline og faldt til 0,62%, 0,12%, 0,05% ved blod trækker 1, 2 og 3 efter terapi start. I modsætning hertil 8/19 af de ikke-responderende patienter viste en reduktion af

mSHOX2

efter behandlingsstart, men

mSHOX2

niveauer ændrede sig ikke så meget som i de responderende patienter (Fig. 1). Faktisk medianen

mSHOX2

værdier i denne gruppe af ikke-respondenter var 26,45% ved baseline og faldt til 6,86%, 7,78%, 7,96% ved blod trækker 1, 2 og 3 efter terapi start. Ingen af ​​de ikke-responderende patienter, som demonstrerede en

mSHOX2

værdi på ≥ 1% pre-terapi (fra 1,1% til 362%) viste en vedvarende reduktion under 1% PMR. (Fig. 1) .Dette observation gælder også for patient UKH 010, der demonstrerede en aktiverende EGFR-mutation, men svarede ikke til TKI-behandling (tabel 3).

De patienter inkluderet i dette tal er begrænset til dem med en baseline mSHOX2 værdi på mindst 1% PMR. Den første blodprøve (x = 0) er pointen med diagnose, dvs. før behandling og definerer baseline methylering af SHOX2. For første otte blod trækker Bonferroni korrigeret p-værdier fra uparrede to prøve Wilcox tests er givet i bunden.

PMR værdier beregnes som relative mængder af

mSHOX2

gen sammenlignet med ß-actin henvisning gen (

ACTB

).

SHOX2

locus ofte forstærket i lungetumorer (Schneider et al BMC Cancer 2011) og denne kopi nummer ændring medfører

mSHOX2

PMRS over 100% i patienter med meget høje niveauer af frit cirkulerende tumor-DNA.

Den mediane PMR for

mSHOX2

ved baseline var 4,06% for de 12 respondenter og 26,45% for de 19 ikke responderede men denne forskel er ikke signifikant. Interessant, ROC-kurven analyser for de 24 patienter med en PMR ≥ 1% viste, at de grundlæggende værdier

mSHOX2

ikke diskriminere mellem respondenter og ikke-respondenter (areal under kurven 0,593), mens en diskrimination af disse to patientpopulationer baseret på værdier opnået efter start af terapien viste en høj sensitivitet og specificitet allerede starter ved blod tegne en med en AUC på 0,844 som steg til 1,000 ved blod uafgjort 7 (fig. 2). Klassificeringen af ​​patienterne som respondenter og ikke-respondenter er baseret på CT-scanninger som guldstandarden, som blev udført af den lokale tumor bord og var fuldstændig uafhængig af de

mSHOX2

målinger.

Kun patienter med et baseline PMR ≥ 1% blev inkluderet. Den første blodprøve (tid 0) er det punkt før behandling (= baseline methylering). Blood trækker 1 til 8 blev taget under behandling med intervaller på 7 til 10 dage.

En Kaplan-Meier analyse, herunder de 31 patienter (dvs. 24 patienter med en PMR ≥ 1% plus 7 patienter med PMR ≤ 1%) viste en stærk sammenhæng mellem overlevelsestiden og en CT-baseret tildeling af patienter til responder og ikke-responder. Den hazard ratio i denne beregning er 18 og P-værdi ≤ 0,00003 (data ikke vist). Interessant, er der en tilsvarende stærk sammenhæng mellem overlevelsestid og PMR af

mSHOX2

. Når PMR værdier fra alle 36 patienter blev anvendt til en Kaplan-Meier analyse kunne vi vise, at selv plasma

mSHOX2

baseline niveauer viste en tendens til signifikans (fig. 3). Ved blod tegne én denne forskel nået statistisk signifikans, der kunne tolkes som tegn på, at denne markør har også en prædiktiv værdi.

Den mediane plasma

mSHOX2 Drømmeholdet værdi ved baseline var 2,88% PMR, mens median en uge efter behandlingen starten var 2,16% PMR.

diskussion

på grund af mere kraftfulde medicin [23] og indførelsen af ​​en målrettet terapi for molekylært udvalgte patientgrupper undergrupper som patienter med en

EGFR

aktivering mutation, imponerende forbedringer i behandlingen af ​​lungekræft patienter blev opnået [24]. Derudover har mere effektive vedligeholdelse regimer vist gavnlige virkninger for patienter med fremskreden NSCLC. Der er også en overlevelse fordel for patienter, der er i behandling med anden kemoterapi sammenlignet med den bedste understøttende behandling og kliniske forsøg afprøver nye kombinationer i anden indstilling linje for refraktær sygdom blev indledt [25] [26]. For at udvælge de bedste behandlingsmuligheder, en hurtig, specifik og følsom metode til vurdering af en terapi reaktion er af afgørende betydning. Den normale procedure for avancerede fase lungekræftpatienter efter induktion terapi er en CT-scanning for at vurdere tumor respons [21]. Bortset fra omkostningerne, følsomheden af ​​denne billeddannelse teknik er ikke meget høj, og inter-observatør variation i målingen af ​​tumorstørrelse er tilbøjelig til fejlfortolkning af tumor respons [27].

I de sidste par år flere biomarkører er blevet testet for deres anvendelighed som en indikator for overvågning terapi. Blandt dem var otte immunhistokemiske biomarkører, hvoraf ingen kunne forudsige kemoterapi respons og overlevelse, og der var kun en svag sammenhæng mellem markør niveau og behandlingsrespons [28]. Neuron specifik enolase (

NSE

) blev anvendt til overvågning af SCLC-patienter og viste sig at være kun nyttig i patienter med øget forbehandling plan [29]. Niveauerne af laktatdehydrogenase og chromogranin A korrelerede ikke med behandlingsrespons [30]. En langsgående måling af opløselig interleukin 2 receptoren viste en reduktion i serumkoncentration i løbet af en behandling, men var ikke et tegn for sygdom remission [31] og thymidinkinase var ude af stand til at skelne mellem de forskellige respons grupper af patienter med lungecancer [32]. Der er nogle ekstra biomarkører for overvågning terapi i lungekræftpatienter som

CYFRA 21-1

nucleosomstørrelse niveauer, som kunne være bedre egnet, men ingen af ​​dem anvendes rutinemæssigt i klinikken [33] [34] [35] [36]. Derudover er der et stigende antal gener, som konstateres at være hyper- eller hypomethylated i patienter med lungecancer, som kunne være nyttige som biomarkører [37]. De hyppigst analyserede gener som

p16

,

DAPK

,

APC

,

RASSF1A

,

MGMT

,

FHIT

,

RARß og ​​GSTP1

blev anvendt som et middel til at opdage lungekræft eller som prognostisk faktor, men ingen af ​​dem var blevet brugt til overvågning terapi. Interstingly, alle disse methylering markører kunne ikke kun påvises i væv, men blev også fundet i ekstracellulære nukleinsyrer isoleret fra bronkial lavage supernatanter, spyt, plasma eller serum [37]. Formålet med denne analyse var at besvare spørgsmålet om, hvorvidt en kvantitativ måling af

mSHOX2

plasma-DNA ved hjælp af en real-time PCR er et nyttigt værktøj til at følge avancerede stadie lungekræft patienter, der får kemo /radio-kemoterapi. Derfor indskrevet vi alle egnede patienter, der var fortløbende optaget til vores ambulante afdeling. Vi overvejede denne tilgang en proof-of-principle studie og derfor var vi mere interesseret i at medtage så mange patienter som muligt i stedet for etablering af en ensartet patient kohorte. Som en konsekvens af histologisk fordeling af patienterne inkluderet i denne analyse ikke passer nøjagtigt tallene i litteraturen [38].

Vores resultater viser, at en kvantitativ bestemmelse af plasma

mSHOX2

DNA synes at være nyttige til monitorering af behandlingseffekten for avanceret stadie lungekræftpatienter. Turn-over hastigheden af ​​cellefrit DNA er temmelig høj som halveringstiden af ​​ekstracellulære nukleinsyrer blev bestemt til at være mindre end seks timer i en dyremodel [39]. Dette hænger godt sammen med vores observation af en hurtig og stærk nedgang i plasma

mSHOX2

DNA i patienter, der responderede på behandlingen, der gælder for overvågning af NSCLC og SCLC-patienter ens. En yderligere fordel ved denne metode er dens anvendelighed til patienter med et meget lavt præ-terapeutisk

mSHOX2 Drømmeholdet værdi. Vi viste, at en

mSHOX2

måling foretaget en uge efter påbegyndelsen af ​​en behandling, som kan opdele mellem respondere og non-respondere med en meget høj specificitet. Hvis dette resultat kan verificeres i en stor undersøgelse, læger har mulighed for at skifte behandlinger eller reservedele patienter fra en ugyldig terapi. Derudover brugte vi data fra alle 36 patienter, dvs. inklusive patienter med

mSHOX2

baseline værdi på nul og anden linje patienter til en Kaplan-Meier overlevelse kurve analyse. Interessant, viste vi, at patienter med en baseline plasma

mSHOX2

niveau under medianen havde en lidt længere overlevelsestid. Når denne analyse blev udført ved blod drage én efter terapi starte denne forskel mellem patienterne responderede på behandlingen og ikke-responderende var statistisk signifikant med en p ≤ 0,001. Spørgsmålet om, hvorvidt patienter med en meget lav

mSHOX2

baseline værdi opfører sig anderledes end patienter med en høj (ere)

mSHOX2

niveau, og om det kunne være muligt at definere en præ-terapeutisk cut-off værdi, som har en prædiktiv betydning skal besvares i en stor undersøgelse, som vil blive gennemført i et polycentrisk tilgang.

fra vores resultater, vi konkludere, at målingerne af plasma

mSHOX2

niveau er en afspejling af det kliniske forløb af sene fase lungekræft patienter, der får en systemisk behandling. En sådan analyse giver mulighed for en hurtigere og mere følsom bestemmelse af tumor respons og overvågning terapi end en CT-scanning. Hvorvidt måling af ekstracellulære

mSHOX2

DNA i plasma kan også have en prædiktiv værdi skal demonstreres i fremtidige forsøg.

Tak

Vi sætter stor anerkende deltagelse af patienterne i denne undersøgelse, og hjælp fra Dana Reinicke og Ute Völker. De Epi proLung BL Reflex Analyser blev venligst stillet til rådighed af Epigenomics.