PLoS ONE: 90Y-mærket anti-ROBO1 monoklonalt antistof Exhibits antitumoraktivitet mod småcellet lungekræft Xenografter

Abstrakt

Introduktion

ROBO1 er et membranprotein, der bidrager til tumormetastaser og angiogenese. Vi har tidligere rapporteret, at

90Y-mærket anti-ROBO1 monoklonalt antistof (

90Y-anti-ROBO1 IgG) viste en antitumorvirkning mod ROBO1-positive tumorer. I denne undersøgelse, vi udført en biodistribution undersøgelse og radioimmunterapi (RIT) mod ROBO1-positive småcellet lungecancer (SCLC) modeller.

Metoder

For biofordelingen undersøgelsen,

111In- mærket anti-ROBO1 monoklonalt antistof (

111In-anti-ROBO1 IgG) blev indsprøjtet i ROBO1-positive SCLC xenograft mus via halevenen. For at evaluere antitumorvirkninger, blev en RIT undersøgelse udført, og SCLC-xenograft mus blev behandlet med

90Y-anti-ROBO1 IgG. Tumorvolumen og kropsvægt blev periodisk målt gennem eksperimenterne. Tumorerne og organer af mus blev derefter opsamlet, og en patologisk analyse blev foretaget.

Resultater Salg

Som et resultat af biofordelingen undersøgelse observerede vi tumoroptagelse af

111In-anti -ROBO1 IgG. Lever, nyre, milt og lunge viste sammenligneligt akkumulering af

111In-mærket anti-ROBO1. I RIT undersøgelsen,

90Y-anti-ROBO1 IgG signifikant reduceret tumorvolumen i forhold til baseline. Patologiske analyser af tumorer afslørede koagulationsnekrose og fatal degeneration af tumorceller, signifikant reduktion i antallet af Ki-67-positive celler, og en stigning i antallet af apoptotiske celler. En forbigående reduktion af hæmatopoietiske celler blev observeret i milten, brystbenet, og lårbenet.

Konklusioner

Disse resultater antyder, at RIT med

90Y-anti-ROBO1 IgG er en lovende behandling for ROBO1-positive SCLC

Henvisning:. Fujiwara K, Koyama K, Suga K, Ikemura M, Saito Y, Hino A, et al. (2015)

90Y-mærket anti-ROBO1 monoklonalt antistof Exhibits antitumoraktivitet mod småcellet lungekræft Xenografter. PLoS ONE 10 (5): e0125468. doi: 10,1371 /journal.pone.0125468

Academic Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: Oktober 6, 2014 Accepteret: 24 marts 2015; Udgivet: 27 maj, 2015

Copyright: © 2015 Fujiwara et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af en bevilling fra Japan Society for fremme af Science (JSP’er) gennem “Finansiering Program til verdens førende innovative R men den samlede prognose af SCLC patienter er dårlig. Det 2-årige overlevelsesrate for patienter med begrænset stadie sygdommen er 20-40%, mens 2-årige overlevelsesrate for patienter med fremskreden sygdom er kun 5%, fordi fremskreden sygdom typisk behandles med kemoterapi alene [2]. Derfor er udviklingen af ​​mere effektive SCLC behandlinger for både begrænset stadie sygdom og omfattende-stadie sygdom (primære læsioner og metastase), der kræves.

radioimmunterapi (RIT) er en type af strålebehandling med radioaktivt mærket tumor-specifikt monoklonalt antistof [4-6]. Selvom RIT behandlinger Zevalin og Bexxar succes er blevet anvendt til behandling af recidiverende eller refraktær non-Hodgkins lymfomer, har succes RIT som behandling for solide tumorer været begrænset. Dette skyldes både radioresistance af faste tumorer og den manglende evne til at levere et tilstrækkeligt dosis til voluminøse tumorer uden at forårsage knoglemarvs- toksicitet [4, 7]. For nylig, Yoshida et al. rapporterede, at RIT viser den betydelige terapeutiske virkning for SCLC xenografter [8]. Den kliniske forsøg med anti-CEA radioimmunterapi i SCLC er igangsat [3]. SCLC har høj radiosensitivitet, selv om det er sandsynligt, at blive metastatisk. RIT kan angribe både primær og metastatisk cancer, fordi RIT middel afgives til alle dele af kroppen via blodcirkulationen. Disse tyder på, at RIT har potentialet til at blive en effektiv behandling for SCLC.

Den menneskelige homolog af

Drosophila

Roundabout gen,

ROBO1

, er et membranprotein og en receptor af slit2 [9]. Slit2-ROBO1 interaktioner mægle frastødende stikord i axoner og vækst kegler under neural udvikling [9, 10]. Det er blevet rapporteret, at ROBO1 bidrager til både tumormetastase og angiogenese [11-13]. Vi har tidligere gennemført en RIT studie i hepatocellulært carcinom (HCC) rettet mod ROBO1 antigen [14]. Indgivelse af

90Y-mærket anti-ROBO1 IgG (

90Y-anti-ROBO1 IgG) viste signifikante antitumorvirkninger, såsom tumorvækst undertrykkelse i ROBO1-positive HCC xenotransplantater. Imidlertid blev tumorskrumpning ikke observeret, måske på grund af radioresistance af HCC. Derfor vi konstateret, at en mere radiosensitive tumor end HCC ville være en passende terapeutisk mål for

90Y-anti-ROBO1 IgG. SCLC har høj radiosensitivitet sammenlignet med HCC. Xian et al. rapporterede ekspressionen af ​​ROBO1 i human SCLC cellelinie NCI-H69 [15]. Derfor valgte vi SCLC model ved hjælp af NCI-H69-cellelinjen som en mere effektiv terapeutisk mål til anvendelse i den foreliggende undersøgelse.

I denne undersøgelse undersøgte vi farmakokinetik en

111In-mærket anti- ROBO1 IgG (

111In-anti-ROBO1 IgG) i en biofordeling forsøg med SCLC-xenograft mus. Desuden har vi udført RIT anvendelse af en

90Y-anti-ROBO1 IgG og antitumorvirkningen og organskader blev evalueret ved patologisk analyse.

Materialer og metoder Salg

Cellekultur og dyremodeller

ROBO1-positive SCLC cellelinie NCI-H69 (ATCC HTB-119) blev opnået fra American Type Culture Collection [15]. BALB /c nøgne mus (5 uger gamle) blev erhvervet fra Clea Japan, Inc. (Tokyo, Japan). NCI-H69 celler blev dyrket i RPMI 1640 medium indeholdende 10% (vol /vol) føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2. For NCI-H69 tumorbærende dyremodeller, NCI-H69-celler (2 x 10

6), i et volumen på 200 pi blev inokuleret subkutant i den højre flanker på BALB /c nøgne mus. Mus blev derefter analyseret 4 uger efter inokulering. Mus blev aflivet ved blod fjernelse under isofluran-narkose. Alle dyreforsøg blev godkendt af Animal Care udvalg fra University of Tokyo (godkendt nummer: P10-017).

Antistoffer

monoklonalt antistof mod human ROBO1 blev genereret som beskrevet tidligere [16] . Anti-ROBO1 IgG er en muse IgG2b. Det anerkender menneskets ROBO1 og ikke krydsreagerer med murine ROBO1. For immunhistokemisk (IHC) analyse, vi brugte anti-ROBO1 IgG A7241A (A7241A) [16]. For flowcytometri blev biodistribution undersøgelse og RIT undersøgelsen, anti-ROBO1 IgG B5209B (B5209B), der anvendes [14]. En negativ kontrol, IgG 3423 (Institute of Immunology, Tokyo, Japan), blev anvendt i flowcytometri. Dette monoklonale antistof specifikt reagerer med hepatitis B overflade antigen [17]. Desuden er det ikke reagerer med humane membranproteiner.

Flowcytometri og IHC

Specificiteten af ​​B5209B for ROBO1 antigen blev evalueret ved anvendelse af flowcytometri. NCI-H69 celler blev inkuberet med B5209B eller en negativ kontrol IgG 3423 i 1 time ved en koncentration på 0,3 ug /ml i fortyndingsbuffer (1% BSA, 0,1 mM EDTA i PBS). Samtidig at demonstrere specificiteten af ​​B5209B blev blokerende eksperimenter udført ved at tilsætte opløseligt ROBO1 i en koncentration på 100 pg /ml. Cellerne blev derefter vasket to gange med fortyndingspuffer og omsættes med R-phycoerythrin-konjugeret anti-muse-IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) fortyndet til 1: 200 med fortyndingspuffer. Endelig blev cellerne vasket to gange med fortyndingspuffer og analyseret ved flowcytometri (GUAVA EasyCyteTM Plus System, Millipore, Billerica, MA, USA).

Ekspressionen af ​​ROBO1 i NCI-H69-xenografter blev vurderet ved anvendelse IHC. NCI-H69 tumor vævsprøver blev fikseret i 4% paraformaldehyd natten over ved 4 ° C. De blev indlejret i paraffin, og 3-5 um tykke snit blev opnået. Vævssnit blev afparaffiniseret og rehydreret. Antigen genfinding blev udført i 10 mM Tris-1 mM EDTA-buffer (pH 9,0) i en trykkoger i 20 min. Endogen peroxidase blev standset ved anvendelse af 0,3% hydrogenperoxid-methanol i 30 min, og derefter prøverne blev blokeret med 5% normalt gedeserum i 1 time. Prøverne blev inkuberet med A7241A (10 ug /ml) natten over ved 4 ° C og derefter behandlet med et sekundært antistof (Simpelt plet MAX-PO, Nichirei, Tokyo, Japan) ved stuetemperatur i 30 min. At visualisere peroxidaseaktivitet, 0,2 mg /ml 3,3′-diaminobenzidin (DAB; Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) blev anvendt som substratet i 0,05 M Tris-HCI-buffer (pH 7,6) indeholdende 0,01% H

2O

2. Nuklear farvning blev udført med hematoxylin.

Radiomærkning

Vi købte 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecan-1, 4, 7, 10-tetraeddikesyre (DOTA) fra Macrocyclics (Dallas, TX, USA),

111InCl

3 blev opnået fra Nordion, Inc. (Vancouver, Canada), og

90YCl

3 blev opnået fra Eckert og Ziegler (Braunschweig, Tyskland).

B5209B blev konjugeret med DOTA og radiomærket med

111In og

90Y som tidligere beskrevet [14]. Vi rapporterede, at immunreaktive brøkdel af radioaktivt mærket B5209B ikke forringer konjugering med intakt B5209B [14].

Biofordeling undersøgelse

NCI-H69 xenograft (300,7 ± 125 mm

3) mus tilfældigt opdelt i 5 grupper (n = 3 pr gruppe). Hver mus blev injiceret med 40 uCi

111In-B5209B (80 ug) via halevenen. Musene blev aflivet ved 6, 24, 48, 72 og 144 timer efter injektion. Blod, hjerte, lunge, lever, nyre, milt, mave, blev tarm, muskel, lårbensknogle, brystben, og tumor opsamlet, vejet og målt for radioaktivitet. Procentdelen af ​​injicerede dosis pr gram væv (% ID /g) blev beregnet for hvert organ.

Tumoren absorberede dosis for

90Y-B5209B blev estimeret ud fra biofordelingen data

111In- B5209B. Tumorakkumulering på forskellige Tome punkter blev afsat mod tid, hvorfra arealet under kurven (AUC) blev beregnet. Tumor absorberede dosis blev anslået på basis af en MIRD-stil mus dosimetri model [18]. Den absorberede dosis til organer i en 70-kg henvisning mand blev estimeret fra vores biodistrubution data ved hjælp MIRDOSE3 computerprogram [19].

Terapeutisk undersøgelse

NCI-H69 xenograft-mus blev tilfældigt opdelt i 2 grupper (n = 3 pr gruppe). Mus blev injiceret via halevenen med saltvand eller 200 uCi

90Y-B5209B (70 ug). Tumor mængder for kontrol og

90Y-B5209B grupper var 310,5 ± 128,6 mm

3 og 273,5 ± 153,6 mm

3. Tumorvolumen og kropsvægt blev målt to gange om ugen indtil 4 uger efter injektion. Tumor volumen blev beregnet ved hjælp af følgende formel: 0,5 × (korteste diameter)

2 × (længste diameter). Tumorvækst (%) blev beregnet ved anvendelse af formlen: (tumorvolumen ved hvert tidspunkt) /(tumorvolumen på dag 0) × 100. Mus blev aflivet, når tumorstørrelsen var 1.500 mm

3 eller kropsvægt faldt med 20% fra oprindelige vægt.

Patologisk undersøgelse

NCI-H69 xenograft mus blev tilfældigt opdelt i 5 grupper (n = 3 per gruppe). Mus blev injiceret via halevenen med 200 uCi

90Y-B5209B. Musene blev aflivet på dag 0, 7, 14, 21, og 28 efter injektion, og derefter vævsprøver af NCI-H69 tumor, lever, nyre, lunge, hjerte, tarm, milt, pancreas, brystben, og lårben blev opnået fra musene.

Alle prøver blev fikseret i 4% paraformaldehyd natten over ved 4 ° C. De blev indlejret i paraffin, og 3-5 um tykke snit blev opnået. Brystbenet og lårben blev afkalkes, før indlejring i paraffin. Slide sektioner, undtagen den femorale knogle og brystbenet, blev deparaffineret, dehydreret, og farvet med hematoxylin og eosin. Lårbensknogle og brystbenet snit blev farvet med Giemsa-opløsning.

Terminal deoxynucleotidyltransferase-medieret dUTP nick-endemærkning (TUNEL) og Ki-67-farvning blev udført på NCI-H69 sektioner for at undersøge status for tumor apoptose og celle proliferation, henholdsvis.

Apoptose blev påvist under anvendelse ApopTag Plus Peroxidase In situ Apoptosis Detection Kit (Chemicon International, INC, Billerica, MA), ifølge producentens instruktioner.

Ki-67-farvning blev udført som tidligere beskrevet [14].

Apoptotisk og proliferative celler blev kvantificeret ved at bestemme procentdelen af ​​TUNEL- og Ki-67-positive celler, henholdsvis som tidligere beskrevet [14].

Statistiske analyse

data blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse. Midler blev sammenlignet ved hjælp af Students

t

-test. P-værdier for 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Specificiteten af ​​B5209B til ROBO1 antigen

NCI-H69 celler udviste gennemsnitlige fluorescensintensiteter af 35,29 og 7,80 med B5209B og negativ kontrol-IgG 3423, (fig 1a og 1b). Binding af B5209B blev inhiberet ved tilsætning af opløseligt ROBO1.

(a) Flowcytometrisk analyse med B5209B (fyldt histogram) i NCI-H69-cellelinje. Åbne histogrammer angiver de blokerende eksperimenter, der anvendte opløseligt ROBO1. (B) Flowcytometrisk analyse med IgG 3423 (fyldt histogram). Åbne histogrammer angiver de blokerende eksperimenter, der anvendte opløseligt ROBO1. (C) immunhistokemisk analyse af ROBO1 med A7241A i NCI-H69 xenograft. (Skala bar = 100 um).

ROBO1 udtryk i NCI-H69-xenografter

udtryk for ROBO1 i NCI-H69-xenografter blev bekræftet ved IHC hjælp A7241A. Farvning med A7241A blev observeret på cellemembranerne, som ROBO1 udtrykkes på celleoverfladen (Fig 1c).

Biofordeling undersøgelse

biodistribution forsøg med

111In-B5209B blev udført ved hjælp NCI-H69 xenograft-mus (figur 2). Tumoren optagelse af

111In-B5209B var 3,46 ± 0,3%, 6,42 ± 0,5%, 5,70 ± 2,5%, 9,37 ± 2,0%, og 10,1 ± 1,3% ID /g ved 6, 24, 48, 72 og 144 h efter injektion hhv. Den maksimale tumor optagelse af

111In-B5209B forekom ved 144 timer efter injektion. Høj retention af sporstof i blodet blev observeret med 19,2 ± 2,1% ID /g ved 6 timer, men dette faldt til 6,55 ± 0,5% ID /g ved 144 timer.

111In-B5209B udviste høj optagelse i lever, nyre og milt med 5,78 ± 0,9%, 4,73 ± 0,4%, og 5,13 ± 0,4% ID /g efter 144 t. Salg

Resultater angiver de beregnede procentdele af den injicerede dosis pr gram væv (% ID /g).

dosis absorberes af tumorer behandlet med 200 uCi

90Y-B5209B blev anslået til at være 10,5 Gy. Doserne absorberet af lever, nyre, milt og knoglemarv blev estimeret fra vores biodistributionsdata at være 2,1 mGy /MBq, 3,8 mGy /MBq, 1,3 mGy /MBq, og 0,4 mGy /MBq i henholdsvis en 70-kg mandlig henvisning emne for

90Y-B5209B.

RIT undersøgelse

Den terapeutiske effekt af

90Y-B5209B blev undersøgt i NCI-H69 xenograft mus (figur 3a). Tumorerne i saltvandsgruppen udviste hurtig vækst. En mus i saltvand gruppe blev aflivet på dag 20, fordi tumorvolumenet nåede 1.500 mm

3. I

90Y-B5209B gruppe, nedsat tumor volumen til 19,3 ± 6,1% på dag 13 i forhold til den oprindelige volumen på dag 0. Tumor volumen viste signifikante forskelle mellem grupper fra dag 9 og fremefter (p 0,01), selv om der ikke signifikant forskel blev observeret på dag 0, 2, eller blev observeret 6. tumor genvækst på dag 20.

(a) kurve tumorvækst, (b) Gennemsnitlig legemsvægt af NCI-H69 xenograft-mus (åben firkant, saltvand, sorte trekanter,

90Y-B5209B). ** P 0.01 (t-test).

Animal kropsvægt blev målt efter injektion (figur 3b). Selvom den gennemsnitlige kropsvægt faldt til 89,5 ± 4,7% af den oprindelige værdi i

90Y-B5209B gruppe, denne ændring var forbigående. Musene i saltvand udviste ingen signifikant reduktion i legemsvægt. På dag 6, kropsvægt afveg betydeligt mellem saltvand gruppen og

90Y-B5209B (p 0,01). På dag 9 viste kropsvægt ingen signifikant forskel mellem de to grupper.

Patologisk analyse

Vi vurderede derefter antitumor effekt ved patologisk analyse. På dag 0, viste tumorceller solid vækst er forbundet med hyalinized fibrøst stroma (figur 4a)

(a) NCI-H69 tumor på dag 0, original forstørrelse × 400.; (B) NCI-H69 tumor på dag 7, original forstørrelse × 400; (C) NCI-H69 tumor på dag 0, original forstørrelse × 400; (D) NCI-H69 tumor på dag 0, original forstørrelse × 400; (E) NCI-H69 tumor på dag 0, oprindelig forstørrelse x 400. Scale bar = 100 um.

På dag 7, observerede vi massiv koagulationsnekrose, apoptotiske celler, og celle degeneration, defineret ved cellelegemet hævelse, celle nuklear kvældning og chromatin komprimering (figur 4b).

på dag 14, udover koagulationsnekrose og celle degeneration, vi også observeret histiocyte aggregering og fibrose i nekrotiske regioner (figur 4C).

På dag 21 blev nekrotiske områder ikke overholdes, mens histiocyte sammenlægning og fibrose blev observeret (figur 4d). Selv om antallet af degenererende celler faldet i forhold til dag 14, vi stadig observeret mange degenererende celler.

På dag 28 blev få degenererende celler observeret (figur 4e). Kendetegnene for cellelegemet og nucleus, såsom form og størrelse, blev ikke ændret og syntes at være de samme som dem, der observeres på dag 0.

S1 Fig viser Ki-67-farvning og TUNEL-farvning. Procentdelen af ​​Ki-67-positive celler på dag 7 faldt betydeligt (27,2 ± 3,4%) i forhold til dag 0 (55,0 ± 13,9%, p 0,01, Fig 5). Procentdelen af ​​TUNEL-positive celler på dag 7 steg betydeligt (8,83 ± 1,2%) i forhold til dag 0 (4,46 ± 1,1%; p 0,01, Fig 5)

Ki-67:. Forholdet mellem Ki -67-positive celler; TUNEL: forholdet mellem TUNEL-positive celler. * P 0.01 (elevernes t-test).

Der blev ikke observeret synlige patologiske forandringer i de normale organer, med undtagelse milten, brystbenet, lårbenet, og lever.

På dag 7, milten viste et fald i antallet af både hæmatopoietiske celler i det røde pulp og lymfocytter i den hvide pulp (fig 6a). På dag 14, regenerative øer, der består af en blanding af erythroblast og granulocytiske celler, blev observeret i det røde pulp af milten. I den hvide pulp af milten, celledensiteten af ​​lymfocytter var i samme størrelsesorden som den, der observeres på dag 7. På dag 21, hæmatopoietiske celler, herunder erytroblaster, granulocytter og megakaryocytter blev signifikant forøget i røde pulp af milten . Desuden var der en lille stigning af lymfocytter observeret i den hvide pulp. På dag 28, celledensiteten af ​​hæmatopoietiske celler syntes at være den samme som observeret på dag 0 i det røde pulp af milten, og lymfocytter blev øget væsentligt i den hvide pulp.

(a) Spleen, oprindelige forstørrelse × 400, skala bar = 100 um. (B) Brystbenet, original forstørrelse × 400, skala bar = 100 um. (C) lårben, original forstørrelse × 400, skala bar = 100 um. (D) Lever, original forstørrelse × 400, skala bar = 100 um.

Vi udførte derefter Giemsa farvning af brystbenet og lårbenet (Fig 6b og 6c). På dag 7 udviste brystbenet knoglemarv et bemærkelsesværdigt fald i antallet af hæmatopoietiske celler. Modne granulocytter består størstedelen af ​​de resterende hæmatopoietiske celler. I den femorale knoglemarv, observerede vi et lille fald i antallet af megakaryocytter, mens der ikke var nogen tilsyneladende fald i antallet af erytroblaster og granulocytter. Skaderne på den femorale knoglemarven var mild i forhold til den observeret i brystbenet knoglemarven. På dag 14 blev regenerative øer observeret i brystbenet knoglemarv og få megakaryocytter var til stede. Den femorale knoglemarv udviste en stigning i megakaryocytter, og celledensiteten af ​​hæmatopoietiske celler syntes at være den samme som observeret på dag 0. På dag 21, viste brystbenet knoglemarven en betydelig stigning i antallet af hæmatopoietiske celler. På dag 28, celledensiteten af ​​hæmatopoietiske celler i brystbenet knoglemarven syntes at være den samme som observeret på dag 0.

På dag 7, ballooning af hepatocyt numre blev observeret i leveren (fig 6d) , mens dette ikke blev set på dag 14. Desuden karakteristika hepatocytter viste sig at være de samme som dem, der observeres på dag 0.

diskussion

denne undersøgelse er den første til at påvise, at

111In-B5209B ophobes i NCI-H69-xenografter, og

90Y-B5209B har betydelige antitumor virkninger mod NCI-H69-xenografter.

for at vurdere specificiteten af ​​B5209B for ROBO1, vi udførte et blokerende undersøgelse anvendelse af flowcytometri. Bindingen af ​​B5209B blev inhiberet ved tilsætning af opløseligt ROBO1, selvom den samme behandling ikke inhiberer bindingen af ​​IgG 3423. Derfor B5209B genkender specifikt ROBO1 antigen.

Vi bruges

111In-anti-ROBO1 som en biodistribution surrogat at forudsige in vivo adfærd af

90Y-anti-ROBO1; dette var, fordi det er blevet rapporteret, at

111In og

90Y-mærkede antistoffer, proteiner og peptider er biologisk ækvivalent, med hensyn til deres optagelse i tumorer og andre vigtige organer [20].

Vi bekræftet, at B5209B har specificitet for ROBO1 antigen. Hertil kommer, at optagelsen af ​​

111In-B5209B i NCI-H69 øges gradvist over tid, og den maksimale optagelse af tumorer var 10,1 ± 1,3% ID /g ved 144 t. Optagelse af radiotracer til normale organer, som ikke udtrykker ROBO1, såsom lever, nyre og milt, udviste relativt høj akkumulering. Men optagelsen af ​​hvert organ enten faldt gradvist over tid eller forblev konstant. Disse uptake adfærd afveg fra optagelsen observeret i tumorer. Derfor resultaterne af vores blokering og biodistribution undersøgelse støtte,

111In-B5209B specifikt sigter ROBO1. Det forventes, at

90Y-B5209B ville ophobes i NCI-H69-xenografter, på grund af lignende bindingsaffinitet [14].

Selvom

111In-B5209B viste relativt høj akkumulering i lever, nyre, og milt, bindingsspecificiteten af ​​

111In-B5209B kan ikke forklare dette høje akkumulering, fordi disse organer ikke udtrykker ROBO1 [16]. Dette fænomen kan forklares ved tilstedeværelsen af ​​resterende

111In-B5209B i blodet og Fcy eller FcRn receptor-medieret optagelse af endotelceller i disse organer [21, 22].

Vi injiceret 200 uCi af

90Y-B5209B i NCI-H69 xenograft mus, og tumor volumen af ​​NCI-H69 xenografter faldt signifikant efter behandling med

90Y-B5209B. Efter

90Y-B5209B administration, observerede vi patologiske forandringer i tumoren, herunder celle degeneration, koagulationsnekrose, en stigning i apoptotiske celler og et fald på Ki-67-positive celler. Disse ændringer er almindelige patologiske ændringer i behandlede tumorvæv. Således er disse resultater antyder, at

90Y-B5209B besidder betydelige antitumorvirkninger, når de anvendes i RIT.

Desværre observerede vi tumorgenvækst på dag 20 i

90Y-B5209B gruppe. I den patologiske undersøgelse, nedsat celledegeneration iagttoges fra dag 21 til dag 28. Der var ingen nekrotiske område på dag 21, selv om der blev observeret histiocyte aggregering og fibrose dengang, og disse er immunresponser på nekrotiske celler. Histiocytter indtage nekrotiske celler og fibroblaster reparere denne region. Desuden er de morfologiske karakteristika af cellelegemer og kerner på dag 28 syntes at være de samme som dem, der observeres på dag 0. Disse resultater antyder, at de antitumorvirkninger af RIT aftaget på dag 21. For at opnå fuldstændig remission eller langvarig overlevelse ved hjælp af

90Y-B5209B, forbedring eller udvidelse af disse antitumor virkninger er nødvendig. Kombinationsbehandling med RIT, kemoterapi og poly ADP ribose polymerase inhibitor resulterer i forlænget overlevelse sammenlignet med hver terapi alene [23, 24]; derfor, kombinationsterapi har et potentiale til at levere mere effektiv antitumoraktivitet. Brugen af ​​lange halveringstid nuklid kan opnå en forbedring af terapeutiske virkninger.

90Y er en nyttig terapeutisk β

– emitter, der har høj maksimal energi (2,3 MeV) og en lang række (maksimal væv penetration 11 mm) [25]. Men dens halveringstid er relativt kort (2,7 dage). Sammenlignet med

90Y,

177Lu har lavere maksimal energi (0,5 MeV) og en kortere rækkevidde (maksimal væv penetration 1,6 mm), men det har en længere halveringstid (6,7 dage) [26]. Således kan brug af

177Lu forlænge antitumor virkninger og begrænse organskader på grund af dens korte rækkevidde. Desuden er det blevet rapporteret, at

177Lu RIT er mere effektiv end med

90Y RIT i behandlingen af ​​små læsioner ( 1.000 mm

3) [27, 28].

177Lu RIT kan være mere effektiv for de relativt små tumorer, som vi anvendte i dette studie.

Yoshida et al. rapporteret om effekten af ​​radioimmunterapi ved hjælp af

90Y-anti-c-kit-antistof til SCLC [8]. Den

90Y-anti-c-kit-antistof opnåede komplet terapeutisk respons for SCLC xenografter. De to undersøgelser afveg på flere måder, såsom målrettet protein, den anvendte antistof, og tumorvolumen. Tumoren volumen bruges i vores undersøgelse (273,5 ± 153,6 mm

3) var mere end 50 gange større end den tumor volumen bruges in2 deres undersøgelse (4,4 ± 3,2 mm

3). Forskellen i tumor volumen kan forklare forskellen i terapeutisk effekt observeret mellem de to undersøgelser, fordi tumor volumen er den vigtigste faktor behandlingsresultater i strålebehandling [29]. Desuden tilgængeligheden af ​​RIT behandling afhænger af tilstedeværelsen eller fraværet af mål-proteinekspression. Derfor er en bredere vifte af målproteiner for RIT foretrækkes.

90Y-B5209B har værdi som terapeutisk kandidat til behandling af ROBO1-positive SCLC fordi c-kit ikke altid udtrykkes i SCLC.

Vi har også observeret vægttab, nedsat hæmatopoietiske celler og ballooning af hepatocytter. Disse betingelser var forbigående, hvilket indikerer, at 200 uCi

90Y-B5209B var under den maksimalt tolererede dosis i NCI-H69 xenograft mus. Det er nødvendigt at udføre dosiseskaleringsstudie til bestemmelse af en dødelig dosis og optimal terapeutisk dosis. Behandling af den absorberede dosis til normale organer er vigtig ved bestemmelse af terapeutisk strålingsdosis hos patienter. I denne undersøgelse har vi anslået den absorberede dosis til organer i en 70-kg henvisning mand fra vores biodistributionsdata. Doserne absorberet af lever, nyre, milt og knoglemarv var 2,1 mGy /MBq, 3,8 mGy /MBq, 1,3 mGy /MBq, og 0,4 mGy /MBq hhv. I en klinisk undersøgelse af

90Y-Zevalin, de acceptable absorberede doser til normale organer og den røde marv var under 20 Gy og 3 Gy henholdsvis [30]. De maksimale tolererede doser, beregnet fra doser absorberes af lever, nyre, milt og knoglemarv, var 9,5 GBq, 5,3 GBq, 15,4 GBq, og 7,5 GBq hhv. Derfor er den anslåede maksimale terapeutiske dosis af

90Y-B5209B er 5,3 GBq. Det er imidlertid beskrevet, at biofordeling af denne radiomærkede antistof viser en uoverensstemmelse mellem dyremodeller og patienter [31]. Desuden B5209B reagerer på human ROBO1 men ikke til murint ROBO1. Det er nødvendigt at foretage en biodistribution studie med

111In-B5209B i patienter til at anslå præcis dosimetri.

En forskel i graden af ​​skader mellem brystbenet og lårben blev observeret. Imidlertid ophobning af

111In-B5209B har ingen forskel mellem de to i vores biofordeling undersøgelse. Disse tyder på, at akkumuleringen af ​​

90Y-B5209B til disse organer ikke er en hovedfaktor af forskellen i graden af ​​tab mellem de to. Vi har tidligere forklaret, at denne forskel kan skyldes intervallet forskel fra blod pool og høj akkumuleringsområder såsom tumor, lever og milt [14]. Dette tyder på, at graden af ​​bivirkninger i RIT har potentiale til at ændre sig afhængigt af en metastatisk position. Derfor er det nødvendigt at identificere fokale positioner før injektion af

90Y-mærket RIT agent for estimeringen af ​​bivirkning.

I milten, vi observerede regenerative øer bestående af erythroblast og granulocytiske celler på dag 14 og 21, sammen med en betydelig stigning i antallet af hæmatopoietiske celler, herunder megakaryocytter. Disse resultater tydede på, at regenerering af hæmatopoietiske væv begyndte på dag 14-20, og skaderne på bloddannende væv var forbigående med denne behandling. Stigningen af ​​megakaryocytter blev observeret efter stigningen i erytroblaster og granulocytter. Derudover observerede vi et fald i megakaryocytter, uden Erytroblaster og granulocytter, i lårbenet. Kashiwakura et al. rapporterede, at kolonidannende unit megakaryocytter er mere radiosensitive end andre myeloide progenitorceller [32]. Derfor kan den høje radiosensitivitet kolonidannende unit megakaryocytter forklare disse fænomener.

På dag 7, observerede vi en oppustning af hepatocyt i leveren.