PLoS ONE: Karakterisering af Small RNA Transcriptomes af androgenafhængige og uafhængig prostatakræft Cell Linje af Deep sekventering

Abstrakt

I betragtning af de vigtige roller i miRNA i post-transkriptionel regulering og dens konsekvenser for kræft, karakterisering af miRNA letter os til at afdække molekylære mekanismer bag udviklingen af ​​androgen-uafhængig prostatacancer (PSA). Fremkomsten af ​​næste generation sekventering teknologier har dramatisk ændret hastigheden af ​​alle aspekter af sekventering i en hurtig og omkostningseffektiv måde, som kan tillade en uvildig, kvantitativ og dybdegående undersøgelse af små RNA transkriptom. I denne undersøgelse anvendte vi high-throughput Illumina sekventering til omfattende repræsenterer den fulde komplement af individuelle små RNA og til at karakterisere miRNA udtryk profiler i både androgenafhængige og uafhængig Pca cellelinie. Mindst 83 miRNA er væsentligt forskelligt udtryk, hvoraf 41 er opreguleret og 42 nedreguleres, hvilket indikerer disse miRNA kan være involveret i overgangen fra LNCaP til en androgen-uafhængig fænotype. Derudover har vi identificeret 43 nye miRNA fra androgenafhængige og uafhængig PCa bibliotek og 3 af dem er specifikke for androgen-uafhængige PSA. Funktion annotation af målgener indikerede, at de fleste af disse differentielt udtrykte miRNA tendens til at målrette gener involveret i signaltransduktion og celle kommunikation, epically MAPK signalvejen. De små RNA transcriptomes opnået i denne undersøgelse giver betydelige indsigt i en bedre forståelse af udtryk og funktion af små RNA i udviklingen af ​​androgen-uafhængig prostatacancer

Henvisning:. Xu G, Wu J, Zhou L, Chen B, Sun Z, Zhao F, et al. (2010) Karakterisering af den lille RNA Transcriptomes af androgenafhængige og uafhængig prostatakræft Cell Linje af Deep sekventering. PLoS ONE 5 (11): e15519. doi: 10,1371 /journal.pone.0015519

Redaktør: Patrick Ling, Queensland University of Technology, Australien

Modtaget: August 1, 2010; Accepteret: 6 OKTOBER 2010; Udgivet: November 30, 2010

Copyright: © 2010 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (nr Y2100902), Wenzhou Videnskab og Teknologi Project (Y20100011), Zhejiang Provincial Videnskab og Teknologi Platform analyse og undersøgelse Teknologi projekter (2009F82G2090045) og National High Technology Research and Development Program Kina (2006AA02A304). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatacancer (PCA) er den mest almindelige malignitet af den mandlige urogenitale kanal og den tredje hyppigste årsag til kræft dødsfald [1], [2]. Som PCa vækst oprindeligt afhængig af androgener for overlevelse, har androgen deprivation terapi (ADT) været grundpillen i behandling for PSA. Men disse tumorer vinder videre til en androgen-uafhængig fænotype og ikke reagerer på ADT behandling, bliver den største hindring af klinisk terapi. Forståelse af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for udviklingen af ​​androgen-uafhængig PCa vil kaste betydelige lys på mulige strategier til PCA behandling. miRNA (microRNA) er små, ikke-kodende RNA (~20-22 nukleotider), der negativt regulerer genekspression på post-transkriptionelle [3] niveau. Akkumulerende beviser tyder på, at miRNA kan fungere som tumor undertrykkere og onkogener [4], [5]. I betragtning af de vigtige roller miRNA i post-transkriptionel regulering, vil identifikation af disse differentielt udtrykte og nye miRNA lette os til at afdække de molekylære mekanismer bag udviklingen af ​​androgen-uafhængig prostatacancer.

For at karakterisere den lille RNA transkriptomet den nye ‘deep-sekventering’ teknologier, såsom Roche 454 og Illumina Solexa, har været ansat som har betydelige fordele i forhold til tidligere hybridisering-baserede metoder, såsom microarray og PCR-assays [6], [7]. For det første giver det en mere integreret billede af miRNA transkriptomet. High-throughput sekventering har evnen til at identificere beskeden eller endda lave rigelige miRNA udviser ekspressionssystemer forskelle mellem forskellige prøver, i et omfang, der tidligere ikke kunne effektivt detekteret. For det andet er direkte sekventering tilbyder også potentialet til at detektere længden variation af modne miRNA og mulige enzymatiske modifikationer. For det tredje, high-throughput sekventering tillader vellykket opdagelsen af ​​hidtil ukendte miRNA, der ikke behøver at stole på at forespørge kandidat områder af genomet, men snarere kan opnås ved direkte observation og validering af foldningen potentiale flankerende genomisk sekvens. Tilsammen næste generation sekventering teknologier giver en meget robust, nøjagtig og skalerbar system, der sætter en ny standard for hurtig, produktiv og omkostningseffektiv efterforskning af miRNA transkriptom.

Indtil nu er der seks genom-dækkende miRNA udtryk studier i prostatakræft, som revideret ved Gandellini et al. [8]. Den første miRNA udtryk profilering af prostatakræft blev udført af Lu og kolleger [5], hvori de brugte en perle-baserede flowcytometrisk teknik til at vurdere miRNA profilering i forskellige tumortyper. De resterende fem undersøgelser anvendt microarray eller perle-baserede hybridisering metode til at undersøge miRNA udtryk underskrifter i prostatakræft sammenlignet med normalt væv, og identificeret en række afvigende udtrykte miRNA i tumorceller. Men disse undersøgelser kun fokuseret på sammenligning af miRNA udtryk profiler mellem PCA prøver og de omkringliggende ikke-tumorvæv, mens ikke afsløre, hvad slags miRNA kan være korreleret med overgangen fra androgen-følsomme over for androgen-uafhængig i prostatakræft. Senest har Sun et al. fandt, at flere miRNA, især MIR-221 og MIR-222, var signifikant overudtrykt i androgen-uafhængige prostatacancerceller sammenlignet med dem i androgen-afhængige cellelinie, og underforstået inddragelse af begge miRNA i udviklingen og progressionen af androgenuafhængighed af prostatacancer [9]. DeVere White et al. (2009) identificerede et lille sæt af miRNA blev udtrykkes afvigende i androgen-uafhængige PCA cellelinjer under anvendelse microarray teknologi [10]. En detaljeret sammenligning af miRNA udtryk profiler mellem androgenafhængige og androgen-uafhængige cancere kan afdække hvordan miRNA-vejen er involveret i progressionen af ​​prostatacancer til androgenuafhængighed. Brug af den næste generation sekventering, har vi fået miRNA ekspressions signaturer i androgen-uafhængig prostatacancer og identificeret 83 miRNA differentielt udtrykt i LNCaP-AI-cellelinier, såvel som formodede mål for disse miRNA. Så vidt vi ved, er dette studie er det første eksempel på små RNA transkriptom af high-throughput sekventering i prostatacancer og har vist, at dyb sekventering kan tjene som en ideel, hurtig og omkostningseffektiv platform til karakterisering af små RNA-ekspression profiler.

Materialer og metoder Salg

Cell Culture

androgen-afhængige LNCaP-cellelinje blev opnået fra American Type Culture Collection (Rockville, MD) og blev rutinemæssigt opretholdt i en regelmæssig medium: phenolrødt-positive F-12-medium (Gibco) med 10% FBS (Biowest) ved 37 ° C i 5% CO

2. Celler blev fodret to gange om ugen og opdele en gang om ugen med trypsinisering (defineret som en passage). At etablere en androgen-uafhængig cellelinie, blev LNCaP først opretholdt i phenolrødt-frit DMEM /F-12 medium (Gibco) med 10% trækul /dextran-behandlet FBS (Biowest). Efter dyrket i 5 uger blev celler overført til ovennævnte medium med 1,0 x 10

-7 mol /L flutamid (Schering Plough) og dyrket i yderligere 105 passager.

celleproliferationsassay

celler blev podet ved en densitet på 3 x 10

3 celler /brønd i en 96-brønds kulturplade i 90 pi regelmæssig medier. Efter 24 timers inkubation ved 37 ° C i 5% CO

2, blev dyrkningsmediet skiftet med halvdelen af ​​brøndene regelmæssigt modtager medium og halvdelen modtog androgen frit medium (phenolrødt-frit medium med 5,0 × 10

-6 mol /l flutamid). Cellerne blev inkuberet i 5% CO

2 ved 37 ° C i 72 timer, 10 pi CCK-8-opløsning (Dojindo) blev tilsat til hver brønd, efterfulgt af inkubation i 3 timer ved 37 ° C, og absorbansen blev endeligt bestemt ved 450 nm under anvendelse mikropladelæser (Bio-Rad).

Western blotting blev udført ved fremgangsmåderne, der tidligere [11] beskrevne. Følgende antistoffer blev anvendt: kanin anti-Bcl-2 (1:200, Cell Signaling), kanin-anti-Bax (1:100, Cell Signaling) og muse-anti-β-actin (1:1000, Cell Signaling)

Cell Cycle Assay

celler blev suspenderet i hormon-frit og regelmæssig medium henholdsvis og blev derefter plantet i tre 24-brønds plader med en række 3,3 × 10

5 celler pr godt. Efter inkubation i 5% CO

2 ved 37 ° C i 24 timer blev flutamid tilsat i hullerne. Cellerne blev høstet efter inkubering i 5% CO

2 ved 37 ° C i 72 timer. Proceduren for forbehandling af cellecyklus analyse blev efter manualen af ​​Cycle Test

plusDNA Reagent Kit (Becton Dickinson). Cell cyklus analyse blev udført ved hjælp af et FACScan flowcytometer (BD Company)

Real-time RT-PCR

Små RNA ( 200 nt). Blev isoleret med

Mirvana

™ PARIS ™ Kit (Ambion) ifølge producentens instruktioner. For RT-reaktioner blev 1 ug af små RNA anvendt til revers transkription med miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen), udført ved 37 ° C i 60 minutter og en endelig inkubering ved 95 ° C i 5 min. MiRNA real-time RT-PCR blev udført ved anvendelse af miScript SYBR Green PCR-kittet (Qiagen) på et Applied Biosystems 7000 real-time PCR-maskine (ABI). PCR-reaktionen blev udført ved 95 ° C i 15 minutter, efterfulgt af 40 cykler med inkubation ved 94 ° C i 15 s, 55 ° C i 30 s, og 70 ° C i 30 s. Hver PCR blev gentaget mindst tre gange. Den relative ekspression for hver miRNA blev normaliseret ved mod U6 snRNA niveauer. Fold-ændring blev beregnet i henhold til 2

-ΔΔCt metode.

Små RNA Bibliotek Byggeri og High-throughput sekventering

Den isolerede totalt RNA størrelse-fraktioneret på en 15% tris -borate-EDTA (TBE) urea polyacrylamidgel at berige for molekyler på 15-30 nt. Den lille RNA blev ligeret med 3 ‘(5′-pUCGUAUGCCGUCUUCUGCUUGidT-3’) og 5 ‘(5′-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3′) adaptere anvendelse af T4-RNA-ligase og blev igen størrelse-fraktioneret på en 15% TBE urea polyacrylamidgel. Den resulterende RNA blev omvendt transkriberet til cDNA med Solexa lille RNA RT-primer (5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3 ‘). CDNA’et blev anvendt som en skabelon til PCR-amplifikation under anvendelse Solexa lille RNA primersæt (5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3 ‘; 5′-AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3’). Endelig ca. 20 ug af små RNA blev anvendt til sekventering under anvendelse Illumina 1 G Genome Analyzer ifølge fabrikantens protokoller.

Læs Filter og små RNA Annotation

I dyb-sekventering læser produceret af Illumina Genome Analyzer, lav kvalitet læsninger blev frafiltreret for at udelukke dem mest sandsynligt at repræsentere sekventeringsfejl og 3/5 ‘adaptorsekvenser blev efterfølgende trimmet til rent fuld længde læser formateret i en ikke-redundant Fasta format. Forekomsterne af hvert unik sekvens læsninger blev talt som sekvensmærker (antallet af læser for hvert tag afspejler relative ekspression niveau) og kun små RNA-sekvenser af 18 til 30 nt blev bibeholdt til yderligere analyse.

All unik sekvens tags, der passerer ovennævnte filtre blev kortlagt på henvisningen humane genom ved hjælp af SOAP 2.0 program med højst to uoverensstemmelser [12]. Efterfølgende blev de unikke sekvens tags justeret mod miRBase14.0, beregningsmæssigt forudsagt human ncRNAer og Rfam 9.1 (https://rfam.sanger.ac.uk/), den RepeatMasker anmærkning fra RepBase 14.09 (http: //www.girinst. org /), at den menneskelige gener UCSC annotation hg18 (https://genome.ucsc.edu/) klassificerer kendt miRNA, nedbrydnings- fragmenter af ikke-kodende RNA, genomiske gentagelser og mRNA hhv. Sekvenser, der ikke overlapper med nogen af ​​disse tal, men kunne afstemmes til referencen genom blev kaldt “uklassificerede”.

Differential Expression Detection og Novel miRNA Prediction

For at sammenligne differentielt udtrykte miRNA mellem LNCaP og LNCaP-AI, læse tællinger af hver identificeret miRNA blev normaliseret til det samlede antal af miRNA læser. Den statistiske signifikans (P-værdi) blev udledt på grundlag af Bayesian metode, som blev udviklet til analyse af digitale genekspressionsprofiler og kunne redegøre for prøvetagning variabilitet af tags med lave tællinger [13]. En specifik miRNA blev anset for at være væsentligt forskelligt udtryk, hvis

P Drømmeholdet værdi givet ved denne metode var ≤0.001 og der var mindst en 2-gange ændring i normaliseret sekvens tæller. De målgener for hver differentielt udtrykte miRNA blev forudsagt ved hjælp Targetscan (https://www.targetscan.org/), Miranda (https://www.microrna.org/), PicTar (http: //pictar.mdc-berlin .de /) og RNAhybrid (https://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/). Eftersom miRNA mål forudsigelse ofte lider af forhøjet niveau af falske positiver, kun målgenet støttes af mindst tre uafhængige værktøjer blev taget i betragtning. Den Gene ontologi (GO) vilkår og Kegg veje for målrettede gener blev kommenteret hjælp af DAVID gen annotation værktøj (https://david.abcc.ncifcrf.gov/UTH).

De fremavlet sekvenser, der kunne kortlægges til det humane genom blev overvejet til detektering kandidat hidtil ukendte miRNA gener. Kort fortalt blev 100 nukleotider af genomisk sekvens flankerende hver side af disse sekvenser ekstraheret og RNA sekundære strukturer blev forudsagt under anvendelse RNAfold (https://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi). Kandidat roman miRNA blev identificeret ved hjælp af MIREAP under standardindstillinger, som er blevet bredt vedtaget i relaterede undersøgelser [14], [15]

Alle sekventering data sammen med annotation resultater kan være til rådighed på http:. //59.79. 168,90 /PCA.

Resultater

Etablering af en androgen-uafhængig LNCaP cellelinje

Baseret på de rapporter, androgen følsomme LNCaP-celler (fig. 1A) kan omdannes til androgen-uafhængige celler [16], [17], vi har forsøgt at generere en androgen-uafhængig cellelinie ved løbende dyrkning af LNCaP celler

in vitro

. Efter tre ugers kultur initiering i hormon-berøvet medium, spredning af cellerne gradvist langsommere og et betydeligt antal celler (ca. 40-50%) undergik apoptose (fig. 1B). De tilbageværende sæt ændret i morfologi for at vise en neuroendokrine-lignende fænotype (Fig. 1B). Med stigende passage nummer, cellerne optrådte med indlysende morfologiske variationer og bliver lille og flad, udvikle evnen til at vokse i en androgen-uafhængig måde (en fænotype, som vi betegnet LNCaP-AI) (Fig. 1C). For at estimere effekten af ​​androgen-frit miljø på LNCaP-AI vækst celler, vi løbende undersøgt celleproliferation hastigheden af ​​cellelinjen ved forskellige passager. Det vises, at celle vækst i LNCaP-AI-celler blev vist en gradvis nedtrend fra passage 1, 2, 5, 10 og 20, men som passagen antallet steget, celleproliferation blev forøget gradvist og næsten nået til 100% ( fig. 1D). Efter 110 passager under 2 års dyrkning blev cellevækst stabiliseret og kan vokse godt i androgen-forarmet miljø.

(A) Morfologien af ​​parentale LNCaP-celler, som blev dyrket i regelmæssig medium i 3 dage. (B) Neuroendokrin fænotype af LNCaP-celler. LNCaP-celler blev opretholdt i androgen-udtømte medium og dyrket i 3 passager. (C) Morfologi af LNCaP-AI-celler. LNCaP-celler blev dyrket med flutamid i androgen-udtømte medium i 110 passager. (D) De celle vækstrater på androgen-udtømte dyrkede LNCaP celler ved forskellige passager, når de dyrkes i androgen deprivation miljø. (E-F) Virkningerne af androgen-depleteret miljø og flutamid på LNCaP-AI (E) og LNCaP-FGC (F) cellecyklus. (AI: androgen-udtømte medium; Flu: 1,0 × 10

-7 mol /l flutamid; norm: regelmæssig medium). (G) bcl-2 og Bax udtryk i LNCaP og LNCaP-AI celler.

For yderligere at bevise, at LNCaP-AI celler har erhvervet evnen til at tilpasse sig det hormon-frit miljø, flere undersøgelser der er behov for indsigt i virkningerne af flutamid eller androgen-frit miljø på cellens cyklus af LNCaP-celler ved flowcytometri, og de androgenafhængige LNCaP-celler blev inkluderet som en kontrol. Som forventet, flutamid eller androgen-frit miljø havde ingen signifikant virkning på cellecyklusfordeling i LNCaP-AI-celler (fig. 1E). I modsætning hertil blev denne behandling i LNCaP-celler inducerede en akkumulering af celler i G0 /G1-fasen og ledsaget med et fald i S-fasen, og inhiberingen effekt var meget stærkere, når de begge blev kombineret (fig. 1F). Tidligere undersøgelse har vist, at Bcl-2 overudtrykkes af progression til androgen-refraktær prostatacancer [1]. Til karakterisering af ekspressionen af ​​både Bcl-2 og Bax (Bcl-2-associeret X protein) proteiner i de to cellelinier (LNCaP og LNCaP-AI), udførtes Western blotting-analyse (fig. 1G). Vi fandt en forøget ekspression af Bcl-2-protein i LNCaP-AI-celler i sammenligning med LNCaP-celler. I mellemtiden, LNCaP celler udtrykte et tilsvarende Bax protein. Disse resultater antyder, LNCaP-AI-celler opnået en forøget anti-apoptotisk aktivitet. På baggrund af ovenstående observationer, har vi med succes etableret en androgen-uafhængig LNCaP cellelinje gennem langsigtet kultur af LNCaP celler.

Små RNA Transcriptomes og Annotation

For at undersøge små RNA transcriptomes, Illumina high-throughput sekventering teknologi blev anvendt til både LNCaP og LNCaP-AI lille RNA-biblioteker. I første omgang lyder blev produceret i alt 9.107.833 og 10.083.251 rå sekvens for LNCaP og LNCaP-AI, hhv. Efter filter og trimning af læser med lav kvalitet og adapter, 3.978.524 og 4.734.866 sekvens læser blev opnået svarende til 302.325 (LNCaP) og 416.924 (LNCaP-AI) unikke tags. Observation længden fordeling af små RNA’er, fandt vi, at størstedelen af ​​dem fra begge biblioteker var 22 nt i størrelse (fig. 2A), hvilket er i overensstemmelse med den typiske størrelse af miRNA fra Dicer fordøjelsesprodukter. I mellemtiden var der en høj procentdel af identisk sekvens tags (88,90%) mellem LNCaP og LNCaP-AI. Disse resultater viste, at miRNA er blevet successivt beriget fra begge biblioteker.

(A) Længde fordeling af sekventeret læser. Begge biblioteker akkumuleret 22-nukleotid små RNA, hvilket er i overensstemmelse med den typiske størrelse på miRNA. B) Andelene af forskellige klasser af små RNA påvist i LNCaP og LNCaP-AI. Det er indiceret, at størstedelen af ​​læser i begge biblioteker tilhører de miRNA familier.

Efterfølgende 18-30 nt sekvenser fra begge biblioteker blev udvalgt til kort til det humane genom, og i alt 3,747,159 (94,18%) og 4,433,423 (93,63%) sekvenser blev påvist at matche genomet med højst to fejlparringer, (fig. 2B). Baseret på humane genom anmærkninger og en række velkarakteriserede RNA databaser (se materialer og metoder), blev disse små RNA-sekvenser annoteret som kendte miRNA, nedbrydnings- fragmenter af ikke-kodende RNA (tRNA, rRNA, snRNA /snoRNA et al.) , genomisk gentagelse, mRNA eller uklassificerede. Som forventet blev den mest udbredte RNA kategori fra begge biblioteker kendte miRNA: 65,22% for LNCaP og 62,33% for LNCaP-AI. De resterende mindre rigelige kategorier var ikke-kodende RNA og genomiske gentagelser. Derudover kunne en lille del af læser kortlægges til kodende sekvenser, som sandsynligvis vil være RNA nedbrydningsprodukter. Akkumulere beviser indikerede, at nogle genomer også kan transkribere korte funktionelle ikke-kodende transkripter, såsom endogene små interfererende RNA’er eller gentag-associerede interfererende RNA’er, som er blevet karakteriseret at regulere af retrotransposition undertrykkelse [18]. For eksempel er det vist, at L1 retrotransposition undertrykkes af endogent kodede små interfererende RNA’er i humane dyrkede celler. Således er det bemærkelsesværdigt, at disse små RNA også kan indeholde vigtig biologisk funktion, der fortjener yderligere opmærksomhed.

differentielt udtrykte miRNA Mellem LNCaP og LNCaP-AI

Baseret på miRBase, 360 miRNA (285 miRNA og 75 miRNA *) og 380 miRNA (282 miRNA og 98 miRNA *) blev påvist i LNCaP og LNCaP-AI (tabel S1). Først fandt vi, at forskellige miRNA udviste markant forskellige ekspressionsniveauer som målt ved frekvensen af ​​læste tæller, der angiver en bemærkelsesværdig funktionel afvigelse af disse miRNA. I LNCaP-AI, for eksempel omkring 8,99% af miRNA og miRNA * s er i høj læste tæller ( 1000), blandt hvilke HSA-let-7 familie (HSA-lad-7c, HSA-lad-7f, HSA-lad-7a, HSA-lad-7d, HSA-lad-7b og HSA-lad-7e) er en af ​​de mest udbredte miRNA i vores datasæt, der bidrager 8,94% af den samlede miRNA læser. miRNA tælle inden for de intervaller af mellemliggende 100-1000 læser var op til 17,4%, og de resterende miRNA tæller ca. 73,7%.

Den relative optælling af sekventering kunne bruges til at kvantificere miRNA udtryk niveauer mellem LNCaP og LNCaP læser -Ai. Baseret på den normaliserede antal læser per prøve (specifkke miRNA /total sekventering tags i biblioteket), at størstedelen af ​​miRNA (256) blev udtrykt tilnærmelsesvis ligeligt mellem de to biblioteker. Men 83 af dem blev identificeret til at være forskelligt udtrykkes med en fold ændringer 2,0 og

P

-værdi 0,001 (. Tabel 1, figur 3A og tabel S1). Blandt dem, 41 var opreguleret og 42 blev nedreguleret. For yderligere at validere disse differentielt udtrykte miRNA blev 29 individuelle miRNA udvalgt til at udføre kvantitativ RT-PCR analyse fra uafhængige biologiske gentagelser. Disse 29 udvalgte miRNA omfattede både højt udtrykte miRNA (MIR-222, miR-30a *, miR-100, miR-10b, miR-148b, miR-1323, miR-221, miR-7, miR-223, miR-374b , miR-486-5p, miR-7a *, miR-125b-2, miR-27a og miR-423-5) og lavere udtrykte miRNA (miR-15b, miR-21, MIR-17, miR-28-5p , miR-532-3p, miR-200C, miR-93, miR-96, miR-200b *, miR-331-3p, miR-200b, miR-106a, miR-301b og miR-301a). Som vist i fig. 3B, en stærk korrelation (Pearsons korrelation = 0,91) blev afsløret mellem Illumina dybe sekventering data og kvantitative RT-PCR-målinger, der angiver robustheden af ​​dyb sekventering baseret ekspressionsanalyse.

(A) Expression niveau af LNCaP og LNCaP-AI miRNA. Optællingen af ​​hver miRNA blev plottet efter normalisering. Rød farve cirkel viser differentielt udtrykt miRNA mellem LNCaP og LNCaP-AI med mindst 2-gange ændring og

s

-værdi under 0,001. (B) Solexa vs. QRT-PCR af miRNA fold-ændringer.

Novel miRNA Gener

En af de vigtigste fordele for high-throughput sekventering af små RNA transkriptom er, at det giver mulighed for at opdagelsen af ​​potentielle nye miRNA. For at identificere kandidat roman miRNA i LNCaP og LNCaP-AI, vi først filtreret ud Illumina sekvens tags, der er blevet klassificeret i kommenterede kategorier, såsom kendte miRNA, ikke-kodende RNA, genomiske gentagelser eller kodende sekvenser. Vi fandt, at 235.058 og 259.454 af de små RNA-sekvens tags i LNCaP og LNCaP-AI henholdsvis blev afledt fra fremavlet regioner af det humane genom. Disse uklassificerede tags sammen med 100-bp flankerende sekvenser blev analyseret ved MIREAP, et avanceret værktøj almindeligvis anvendes til at identificere hidtil ukendte miRNA fra high-throughput sekventering data [14], [15]. På den måde, vi identificeret 43 formodede nye miRNA fra begge biblioteker (tabel 2 og tabel S2): 22 i LNCaP og 31 i LNCaP-AI (tabel 2 og tabel S2), og kun 10 af dem er deles af begge biblioteker

Vi observerede også, at disse 43 miRNA har en størrelse i området på 20-24 nt og længderne af deres forudsagte hårnålestrukturer varierer fra 65-98 nt, som er magen til kendte humane miRNA (tabel S2) . De minimale frie energier af deres forstadier spænder fra -18,20 til -67,40 kcal /mol med den gennemsnitlige værdi af -52,70 kcal /mol. For yderligere at validere disse hidtil ukendte miRNA, udførte vi real-time RT-PCR-analyse på alle 10 nye miRNA kandidater med en normaliseret sekventering frekvens større end 10 (de andre blev udelukket på grund af deres lave ekspressionsniveau og følsomheden af ​​realtid RT-PCR-analyse). Som et resultat, har vi med succes valideret otte af dem (tabel 2), hvilket indikerer, at 80% kunne valideres af en sekventering-uafhængig metode.

I sammenligning med andre miRNA i vores undersøgelse, disse nye miRNA har en meget lavere ekspressionsniveau med en gennemsnitlig normaliseret sekventering frekvens på 45, hvilket viser, at de fleste af dem ikke kan udvise betydningsfulde funktioner i prostatacancer. Blandt dem, tre LNCaP-AI specifikke miRNA udstillet relativ sekvens tæller store end 10 og valideret af real-time RT-PCR, implicerer deres sandsynlige involvering i udviklingen af ​​LNCaP-AI, og dermed fortjener yderligere funktionel evaluering.

Forventede Mål af forskelligt udtrykte miRNA

at udforske den biologiske funktion af de differentielt udtrykte miRNA identificeret i vores analyse, vi udførte beregningsanalyse med fire uafhængige algoritmer, herunder Targetscan, Miranda, RNAhybrid og PicTar, til identifikation af forudsagt messenger RNA-mål for hver miRNA at være væsentligt forskelligt udtrykt. Tabel S3 lister forudsagt mål, der blev støttet af mindst tre af de ovennævnte fire algoritmer, hvor alt 6902 gener var potentielle mål for disse miRNA. Interessant, blandt disse forudsagte mål blev Akt3 involveret i 11 betydeligt ned-udtrykte miRNA. Akt3 koder for et medlem af serin /threoninproteinkinase familie, der er kendt for at være involveret i en lang række biologiske processer, herunder celleproliferation, differentiering, apoptose, og tumorigenese. Den op-ekspression af Akt3 i androgen-uafhængig prostatacancer-cellelinier viser, at den kan bidrage til mere aggressiv fænotype af androgen-uafhængige prostatacarcinomer [19].

At evaluere target genfunktioner, vi kommenteret disse bygger miRNA mål med gen-ontologi (GO) og Kegg ordninger hjælp DAVID. Predicted miRNA mål befolket mange store GO kategorier, og for nogle af dem, blev antallet af gen-mål markant beriget (

P

0,001, med Benjamini korrektion). De tre GO klassifikationer, molekylær funktion, biologisk proces- og cellulære komponent blev evalueret efter niveau, men kun væsentlige vilkår på niveau 5 i biologisk proces er anført i tabel S3. Som forventet blev de fleste af de store GO vilkår relateret til regulering af transskription (f.eks GO: 0.045.449, GO: 0.006.351 og GO: 0.006.357). Der er også en række væsentligt beriget GO kategorier, herunder celle morfogenese (GO: 0.000.902), intracellulær transport (GO: 0.046.907), og apoptose (GO: 0.006.915). For at analysere den rolle, som miRNA spiller i de regulatoriske netværk, vi tildelt formodede miRNA mål ind Kegg veje, og identificeret 14 af dem var signifikant beriget (

P

0,001, med Benjamini korrektion). De fleste af disse miRNA tendens til at målrette gener involveret i signaltransduktion og celle kommunikation (tabel S4). For eksempel fandt vi, at 130 målgener (2,3%), kunne sættes på MAPK-signalvejen, som er involveret i en lang række cellulære responser, herunder genekspression, differentiering, proliferation og apoptose [20]. I prostatakræft, er MAPK signalveje generelt for at fremme tumorvækst og fremkomsten af ​​hormon-refraktær sygdom [21], [22], [23].

Diskussion

I denne undersøgelse vi har identificeret et stort sæt af miRNA, der udtrykkes differentielt ligger til grund for progressionen af ​​androgen-uafhængig prostatacancer, som også blev verificeret ved QRT-PCR. Nogle af disse miRNA er godt understøttet af nyligt offentliggjorte undersøgelser. Et slående eksempel kommer fra overekspression af MIR-221 og MIR-222 i LNCaP-AI prøve ved en 10-20 gange stigning, hvor de begge er blandt de mest rigelige miRNA i LNCaP-AI cellelinie. Overekspression af MIR-221 eller MIR-222 i LNCaP kunne reducere niveauet af dihydrotestosteron induceret opregulering af prostataspecifikt antigen ekspression og øge androgen-uafhængig vækst af LNCaP-celler [9]. Flere linjer af beviser foreslået, at miR-221 og miR-222 kunne nedregulere tumor suppressor p27 i LNCaP celler, og deres overekspression kan være en af ​​de faktorer, der bidrager til udviklingen af ​​prostata karcinom [24]. Desuden forøget ekspression af miR-125b, miR-30c, miR-100, som vi observerede i LNCaP-AI-cellelinjer blev også identificeret at være opreguleret i fem AI CaP cellelinjer [25], og

in vitro

forsøget viste, at mIR-125b kan stimulere AI væksten og nedregulere ekspressionen af ​​BAK1 [25]. Reduktionen af ​​miR-141, miR-19b, miR-22, miR-29a, og miR-29b identificeret her blev også bemærket blandt de 15 miRNA, der blev nedsat i fire hormon-refraktær prostata karcinomer, som beskrevet i Porkka et al. ‘ s microarray-baserede undersøgelse [26].

Vi identificerede også et sæt differentielt udtrykte miRNA, som ikke er blevet dokumenteret i prostata tumorigenese eller AI udvikling. For eksempel MIR-124, MIR-148b, MIR-320a og MIR-423-5p opreguleret med 2 til 14 gange, mens MIR-29a, MIR-93, MIR-200 og MIR-1277 var down- reguleret af 2 til 10 gange, hvilket antyder, at disse miRNA kunne udøve en rolle som tumorsuppressorgener eller onkogener i udvikling af prostatacancer. Det er interessant at bemærke, at alle fem medlemmer af miRNA-200 familie (miR-200a, miR-200 mia, miR-200C, miR-141 og miR-429) var signifikant nedreguleret i LNCaP-AI celler. Alle disse miRNA blev også identificeret til at blive ned-udtrykkes i celler, som havde gennemgået epitelial til mesenkymale overgang [27], der opfattes som et væsentligt første skridt for progression af ikke-invasive tumorceller i metastatiske carcinomer [28]. Mål af disse microRNA’er blev fundet at være E-cadherin transkriptionelle repressorer ZEB1 og SIP1, faktorer der tidligere impliceret i tumormetastaser [27]. En seneste undersøgelse viste, at ZEB1 udtryk kunne øge transendothelial migration i prostata kræftceller [29].