PLoS ONE: Dual aktion af miR-125b Som tumorsuppressor og OncomiR-22 Fremmer Prostata Cancer tumorigenese

Abstrakt

MikroRNA’er (Mirs) er en ny klasse af små RNA-molekyler, kan dysregulering af hvilket bidrager til kræft. En kombinatorisk fremgangsmåde blev anvendt til at identificere Mirs der fremmer prostatakræft progression i et unikt sæt af prostatakræft-cellelinier, som stammer fra den parentale P69 cellelinie og strækker sig til en yderst tumorigen /metastatisk M12 sublinje. Tilsammen er disse cellelinjer menes at efterligne prostatakræft progression

in vivo

. Forrige netværksanalyse og MIR arrays antydede, at tabet af HSA-MIR-125b sammen med overekspression af HSA-MIR-22 kunne bidrage til prostata tumorigenese. Den dysregulering af disse to Mirs blev bekræftet i humane prostata tumor prøver i forhold til tilstødende godartet kirtelepitel indsamlet via laser capture mikrodissektion fra radikale prostatektomi. Faktisk ændringer i HSA-MIR-125b-ekspression viste sig at være en tidlig begivenhed i tumorgenese. Omvendt fase microarray proteomisk analyse afslørede ErbB2 /3 og nedstrøms medlemmer af PI3K /AKT og MAPK /ERK veje samt PTEN at være proteinmål differentielt udtrykt i M12 tumorcelle sammenlignet med dens parentale P69 celle. Relevante luciferase + 3′-UTR udtryk undersøgelser bekræftede en direkte interaktion mellem HSA-miR-125b og ErbB2 og mellem HSA-miR-22 og PTEN. Restaurering af HSA-miR-125b eller hæmning af HSA-miR-22 udtryk via en antagomiR resulterede i en ændring af M12 tumor celle adfærd

in vitro

. Således den dobbelte virkning af HSA-MIR-125b som en tumorsuppressor og HSA-MIR-22 som et oncomiR bidraget til prostata tumorigenese ved modulationer i PI3K /AKT og MAPK /ERK signalveje, centrale veje vides at påvirke prostatakræft progression.

Henvisning: Budd WT, Seashols-Williams SJ, Clark GC, Weaver D, Calvert V, Petricoin E, et al. (2015) Dual Action af miR-125b Som tumorsuppressor og OncomiR-22 Fremmer Prostata Cancer tumorigenese. PLoS ONE 10 (11): e0142373. doi: 10,1371 /journal.pone.0142373

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: Juli 9, 2015; Accepteret: 21 oktober 2015; Udgivet: November 6, 2015

Copyright: © 2015 Budd et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Data fra fuld microRNA vifte skærm af disse prostata cellelinjer er blevet indsendt af SJS-W som en ph.d.-afhandling til Virginia Commonwealth University bibliotek (VCU10886). De data er tilgængelige fra NCBI s Gene Expression Omnibus og tilgængelige via GEO som tiltrædelsen nummer GSE49520

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Cancer Institute, Grant nummer R21CA152349 til Zez. Den bidragyder ydet støtte i form af løn til KOH, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling data og analyse, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet. De specifikke roller denne forfatter artikuleres i afsnittet “forfatter bidrag”

Konkurrerende interesser:. Finansieringen støtte ændrede ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer

Indledning

Transformation, vækst og ekstravasation af cancerceller resultater fra en række genetiske og epigenetiske ændringer. I det seneste årti har der været en voksende mængde litteratur rapporterer, at afvigende ekspression af microRNA (Mirs) bidrager til udviklingen af ​​flere humane kræftformer [1-8]. Mirs er en vigtig klasse af ikke-kodende RNA’er, der påvirker post-transkriptionelle proteinniveauer og i nærvær af eksterne signaler og miljømæssige stressfaktorer, har evnen til at inducere hurtige ændringer i proteom tillader cellen at reagere på en mere præcis og energi effektiv måde [2-5]. Talrige cellulære processer påvirkes af Mirs, herunder differentiering, vækst /hypertrofi, cellecykluskontrol og apoptose [5,6].

dysreguleret Mirs har vist sig at bidrage til onkogenese ved tabet af tumor undertrykke Mirs eller øget ekspression af oncomiRs [1,9,10]. Enten tab af tumor undertrykkere eller øget ekspression af oncomiRs sidste ende resulterer i øget cellevækst, proliferation, invasiv, eller metastaser. Afvigende udtryk for en eneste miR har potentiale til at påvirke et stort antal cellulære processer, som hver miR kan påvirke hundredvis af downstream proteiner, som fortrinsvis regulerer vigtig nøgle cellesignalering noder og transkriptionsfaktorer [11]. Netværk analyse viser, at mål for Mirs har en væsentlig højere node grad end tilfældigt udvalgte gener [11,12]. Forstyrrelse af disse meget forbundne molekyler konsekvenser celle sundhed fører til sygdom.

, forekommer det derfor nødvendigt at integrere flere kilder til biologisk information til at forstå de forstyrrelser bag en given patologi fra et system niveau. Høje throughput teknologier såsom DNA microarray, genom sekventering, omvendt fase proteomics, og QRT-PCR profilering tillader samtidig erhvervelse af tusinder af datapunkter. Skæringspunktet mellem flere datakilder øger sandsynligheden for at identificere de vigtigste veje er involveret i kræft initiering, progression og metastase. Dette arbejde beskriver en unik kombinatorisk tilgang til at forstå konsekvenserne af miR dysregulering ved prostatakræft progression. Selv om der er observeret Mirs at være forbundet med prostatakræft, der ikke er en klar enighed om specifikke Mirs, der bidrager til onkogenese [7,8].

En roman isogene prostatakræft cellelinje progression model blev brugt som det menes at nøje efterligner tumor progression som det forekommer

in vivo

[13,14,15]. Integration af MIR kvantificering profiler og proteomiske data har potentiale til at øge succesraten for at identificere nye Mirs påvirker tumorigenese. Derfor er de data, der genereres fra MIR arrays, Reverse Phase Microarray (RPPA) proteomics, sammen med oplysninger fra en tidligere netværk analyse blev brugt til at rangere dysregulerede Mirs i vores prostatakræft progression model [12,16-18]. Formodede dysreguleret Mirs blev yderligere bekræftet i RNA isoleret fra patienters radikale prostatektomi tumorprøver bruger laser capture mikrodissektion [LCM] [19,20]. Adskillige dysreguleret Mirs der potentielt driver prostatakræft progression blev identificeret [18,21]. Af disse Mirs blev betydningen af ​​HSA-miR-125b (miR-125b) og HSA-miR-22 (miR-22) til tumorigenese yderligere bekræftet af

in vitro

eksperimenter. miR-125b og miR-22 kan være nyttige som relevante biomarkører til at identificere og fase prostatacancer.

Materialer og metoder

Afledning af Prostata cellelinjer og Cell Culture

P69 , M2182, og M12 celler en gave fra Dr. Joy Ware, Virginia Commonwealth University, Richmond VA, og autentificeret ved hjælp af STR-analyse [13,14]. Disse cellelinier blev afledt ved immortalisering af en ikke-neoplastisk prostata epitel med SV40 stort T-antigen [13]. Den parentale (P69) cellelinie er dårligt tumorigen, og ikke-metastatiske med et lavere kromosomtal end de fleste andre prostatacancer-cellelinier typisk isoleret fra metastatiske steder (LNCaP, DU145, og PC3). En

in vivo

udvælgelsesprocessen blev brugt til at skabe celler med forøget tumorigenicitet og metastatisk potentiale. Efter tre runder af subkutane injektioner i mandlige athymiske nøgne mus, en stærkt tumorigen og metastatisk variant (M12) blev isoleret, hvilket rutinemæssigt metastaserer ved intra-prostata injektion [14]. Den M2182 cellelinjen blev afledt efter to runder af

in vivo

udvælgelse og repræsenterer derfor en mellemliggende fænotype, som er mindre tumordannende end M12 celler og er ikke-metastatisk. Celler blev holdt i kultur ved 37 ° C i mindre end to måneder i RPMI1640 medium med L-glutamin (Gibco), suppleret med 5% føtalt bovint serum, 0,05 mg /ml gentamycin, 5 ug /ml insulin, 5 pg /ml transferrin, og 5 ug /ml selen (ITS fra Collaborative Research Bedford, MA) [13,14,19]. M12-celler stabilt transformeret med en pSIREN plasmidvektor (Clontech), der udtrykker MIR-125b (M12 + MIR-125b) blev opretholdt med puromycin (100 ng /ml) [19,22]. M12-celler stabilt transformeret med en miARREST

™ miR22-3p inhibitor (M12 + MIR-22i) ekspressionsplasmidet (pEZX-AM03) fra GeneCopoeia (HmiR-AN0332-AM03) blev opretholdt med hygromycin (200 ug /ml). Efter trypsinisering (0,25% i EDTA) blev celler pelleteret, vasket med PBS, lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse.

cellepellet RNA-ekstraktion

I alt RNA blev ekstraheret fra frosne cellepellets ved anvendelse af Mirvana

™ miR isoleringsmetode (Ambion-Life Technologies) ifølge producentens anvisninger. Efter isolering blev RNA koncentration estimeres ved en Biorad

® Smart Spec

™ 3000 spektrofotometer, fortyndet til en koncentration på 100 ng /ml og opbevaret ved -80 ° C.

Cell Pellet DNA Extraction

DNA blev ekstraheret fra frosne cellepellets ved anvendelse af QIAamp DNA mini kit fra Qiagen (katalog nr. 51.304) efter producentens instruktioner. Efter ekstraktion DNA-koncentration blev målt som ovenfor.

Onco Bibliotek og Sequencing metode

DNA-biblioteker blev genereret fra cellelinjer ved hjælp af Ion AmpliSeq

™ Bibliotek Kit 2.0 og Ion AmpliSeq

™ Kræft Hotspot Panel v2 (kat. nr 4.480.441 og 4.475.346). Den Cancer Hotspot Panel er en enkelt amplikon pulje, der forstærker 207 amplikoner dækker over 2.800 COSMIC mutationer fra 50 kendte onkogener og tumorsuppressorgener. Hver prøve blev fremstillet under anvendelse 10 ng input DNA henhold til Ion AmpliSeq

™ Bibliotek Forberedelse protokol (Offentliggørelse varenummer MAN0006735 Revision A.0). Ion Xpress

™ Barcode adaptere 1-16 Kit (kat. Nr 4.471.250) blev anvendt til individuel prøve stregkodesystem og adapter ligation. Agencourt AMPure XP magnetiske perler (kat. Nr A63882, Beckman) blev anvendt som angivet i Ion AmpliSeq

™ Bibliotek Forberedelse brugervejledning. Sample biblioteker blev kvantificeret under anvendelse qubit’en 2.0 Fluorometer og høj følsomhed dsDNA Assay Kit (kat. Nr Q32851) og normaliseret til en koncentration på 100 pM. Emulsion PCR blev udført på Ion OneTouch

™ 2 Instrument (katalog nr. 4.474.778) som angivet i Ion PGM

™ Skabelon OT2 200 Kit (publikation nummer MAN0007220. Revision 5.0) under anvendelse af Ion PGM

™ skabelon OT2 200 Kit (kat. nr 4.480.974). Normaliserede 100 pM prøve biblioteker blev samlet og kombineret med OT2 kitreagenser og Ion Sphere Partikler (ISP). Reaktionen blev kørt på OT2 hjælp af 200 bp-protokollen. Prøverne blev derefter bearbejdet til berigelse Ion OneTouch

™ ES. Berigelse af internetudbydere blev opnået ved anvendelse af Ion PGM

™ Skabelon OT2 200 Kit (kat. Nr 4.480.974) og DynaBeads MyOne streptavidin C1 perler (kat. Nr 65001 Life Technologies) ifølge producentens protokoller (Ion PGM

™ Skabelon OT2 200 Kit Brugervejledning). De streptavidin C1 perler binder specifikt til berigede internetudbydere, således at alle andre skal vaskes bort, efterfulgt af eluering med en natriumhydroxid og tween smelte opløsning. Den Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) blev initialiseret ved hjælp af Ion PGM

™ Sekventering 200 Kit v2 henhold til producentens anbefalinger (Ion PGM

™ Sekventering 200 Kit v2: Offentliggørelse nummer MAN0007273 Revision 3.0). Kontrol- kugler blev tilsat til den berigede perleprøve blev sekventeringsprimere annealet til internetudbydere og polymerase tilsat. Internetudbydere blev sekventeret under anvendelse af en ion Torrent Ion 318

™ Chip. Den Ion Torrent PGM blev kørt ifølge Ion Torrent 200 Kit v2 specifikationer udnytte 500 nukleotid strømme, efterfulgt af tilpasning til HG19 reference og analyseret af Ion Torrent Variant Caller plugin.

TaqMan

® baserede miR assay

Verifikation af modent miR udtryk blev bekræftet ved hjælp af TaqMan

® miR metode (Life Technologies, Grand Island, NY). cDNA blev syntetiseret i en 25 pi reaktionsvolumen fra totalt RNA (20 ng) under anvendelse af TaqMan

® MicroRNA Reverse Transcription kit. Reaktioner blev inkuberet ved 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 minutter, og inaktiveres ved 85 ° C i 5 min. Hver cDNA blev analyseret i tre eksemplarer ved kvantitativ PCR (QRT-PCR) under anvendelse af sekvensspecifikke primere HSA-MIR-125b-1 (ID 000.449), HSA-MIR-22-3p (ID 000.398) eller RNU48 (ID 001.006) i en Applied Biosystems 7300 real-time PCR instrument (Life Technologies). Hver enkelt assay blev udført i et 20 pi reaktionsvolumen med 1,33 ul cDNA, 1,0 pi specifikke miR assay 10 pi TaqMan

™ Universal PCR Master Mix II uden AmpErase UNG og 7,67 pi nuclease frit vand. Reaktioner blev inkuberet ved 50 ° C i 2 minutter, efterfulgt af 10 minutter ved 95 ° C og 40 cykler med denaturering i 15 sekunder ved 98 ° C, og annealing /forlængelse i 60 sekunder ved 60 ° C. Dataene blev analyseret under anvendelse af SDS software v1.3.1 (Life Technologies). Threshold og baseline indstillinger blev sat i henhold til protokol anbefalinger, med baseline korrektion mellem cyklusser 3 og 12 og en automatisk tærskel.

Statistisk Analyse af QRT-PCR data

Relative mængder af MIR-niveauer blev bestemt ved hjælp af 2

-ΔΔCT metode Livak et al efter normalisering med RNU48 som en standard reference [23]. Alle prøver blev udført tredobbelt og tærsklen gennemsnitlige cyklus (C

T) værdi blev bestemt ud fra C

T-værdier i området fra 25 til 35. Den gennemsnitlige C

T blev normaliseret ved at subtrahere den gennemsnitlige C

T i RNU48 (ΔC

T). Alle prøver blev sammenlignet med den parentale P69 cellelinie ved at subtrahere den eksperimentelle ΔC

T fra ΔC

T værdien for P69-cellelinien som kalibratoren. Data er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse for 3 uafhængige eksperimenter. Statistiske analyser blev udført i Microsoft

® Excel software platform, ved hjælp af en uafhængig t-test, antager lige varians mellem de to grupper. Statistisk signifikans blev defineret som p ≦ 0,05.

Laser Capture mikrodissektion (LCM)

Tumor og godartet prostata væv blev opnået fra radikal prostatektomi prøver, efter godkendelse fra Virginia Commonwealth University (VCU), Kontor af forskning og innovation, Institutional Review Board (IRB), Panel A. Fire prøver blev frosset væv fra VCU væv og dataopsamling og analyse Core (TDAAC på https://www.pathology.vcu.edu/research/TDAAC) og en arkiverede FFPE prøve var fra VCU s Patologisk Institut [19,22]. Humane væv, patientens samtykke og kliniske data blev leveret af den VCU TDAAC core facilitet og Institut for Patologi med patientens samtykke. Alle patientprøver blev de-identificeret til at beskytte patientens fortrolighed. Slides (10-20) blev genereret og revideret af en bestyrelse certificeret patolog (ED) med ekspertise i prostatakræft diagnose for at identificere prostata adenocarcinom foci versus normal kirtelepitel samt hyperplastiske kirtelepitel (BPH), prostata intraepitelialneoplasi (PIN) og stroma fra en unik patientprøve. Prostata adenocarcinom blev karakter efter Gleason klassificeringssystem [24]. Kort fortalt blev 8 um vævssnit anbringes på uladede objektglas, dehydreret med progressivt stigende koncentrationer af ethanol og farvet med hematoxylin og eosin (H Dako Cytomation Carpinteria, CA) koblet med den katalyserede signalamplifikationssystemet (CSA; Dako Cytomation Carpinteria, CA), et kommercielt tilgængeligt tyramid-baserede avidin /biotin-amplifikation kit, blev anvendt til at amplificere påvisning af signalet. Fluorescerende detektion blev opnået ved anvendelse IRDye 680RD Streptavidin (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger. Antistof og SYPRO Ruby farvede objektglas blev scannet på en Tecan laserscanner (TECAN, Mönnedorf, Schweiz) ved hjælp af 620 nm og 580 nm vægt længde kanal hhv. Billeder blev analyseret med MicroVigene Software Version 5.1.0.0 (Vigenetech, Carlisle, MA) som tidligere beskrevet [16]. Samlet set blev det cellulære lysat spottet på 111 dias og hver inkuberes med et unikt antistof. Returneret data på en Microsoft Excel regneark, der indeholder hver celletype analyseret med hvert antistof af interesse.

Statistisk analyse af RPPA data

Microsoft Excel blev anvendt til at udføre en to-stikprøve lige varians T -test til at sammenligne protein udtryk data mellem M12 og P69 cellelinjer. I alt 45 værdier blev midlet for hvert antistof probet proteinprøve. En streng sandsynlighed værdien af ​​p = 0,001 blev anvendt til at korrigere for variation blandt flere prøver og identificere virkelig væsentlige ændringer. De rapporterede signifikante ændringer blev omdannet til fold ændringer ved at dividere den gennemsnitlige ekspression af proteinet i M12-cellelinien med den gennemsnitlige ekspression af proteinet i den sammenlignende P69 cellelinie.

Resultater Salg

Næste Generation Sequencing for prostatakræft cellelinier

P69, M2182, og M12-cellelinjer repræsenterer en unik samling af genetisk beslægtede prostatakræft-cellelinier foreslået som en progression model overlappe de molekylære begivenheder, der opstår i løbet af prostata tumorgenese

in vivo

[13,14,15]. M12-cellelinien er en meget tumorigen /metastatisk variant afledt fra den parentale P69 cellelinie med M2182-cellelinien udviser et mellemprodukt, men ikke-metastatisk fænotype. I modsætning hertil andre etablerede humane prostata cellelinjer såsom DU145 eller PC3 repræsenterer cellulære slutpunkter afledt af sekundære tumorer og dermed kan ikke betragtes som en progression model.

Næste generation sequencing (NGS) analyse blev foretaget for at identificere potentielle nucleotidvariationer i gener, der vides at være forbundet med cancer progression, der kunne forklare de fænotypiske forskelle, der vises af disse cellelinier. Over 200.000 opnåedes læser for hvert delområde med en gennemsnitlig læse længde på ~ 110 nts i længden (tabel 1). Kataloget af somatiske mutationer i Cancer (COSMIC) beskriver over to millioner kodende sekvens punktmutationer identificeret i forskellige kræftformer. Der var dog kun tre COSMIC genmutationer identificeret i alle underlinjer (STK11-COSM29005, PGFRA- COSM22413 og APC-COSM19099) (Tabel 2). Interessant, alle af den kosmiske mutationer plus yderligere 11 nye mutationer var konsistente på tværs af alle medlemmer (P69, M2182 og M12) af prostatakræft celle progression model. Der var en enkelt overgang fra en thymidin til en cytosin i STK11 * gen, som ikke var til stede i M12-cellelinien, men da dette er ikke en mutation vides at korrelere med risiko kræft, er det usandsynligt, at det alene er ansvarlig for de unikke egenskaber af dette delområde. Således viste NGS analyse, at der ikke tidligere var kendt kræft genmutationer, der kunne tegne sig for de store forskelle i tumorigenicitet og metastase vises af disse relaterede cellelinjer.

Analyse af miR Expression i Prostata Cancer Cell Lines

for at identificere gener, der kan bidrage til de forskellige tumorgene /metastatisk egenskaber af disse celler, en miR vifte skærmen ved hjælp af miRCURY LNA

™ Universal RT microRNA PCR-system (Exiqon, Danmark) var udført i to eksemplarer [18,21]. Selv blev fundet flere Mirs skal dysreguleret, mest bemærkelsesværdige var den differentielle ekspression af miR-125b og miR-22 [18,21]. Som prostata cellelinier blev mere tumorgene forløber fra forældrenes P69 til M2182 og i sidste ende M12 celle, niveauet af MIR-125b faldt betydeligt, ≈ en 6-fold fald i ekspression (figur 1). I modsætning hertil MIR-22 sandsynligvis fungerede som en oncomiR med niveauet af MIR-22 forøge 3,5 gange, når cellerne blev mere tumorgene og i sidste ende metastatisk. Interessant, i begge tilfælde forekom hovedparten stigning i de tidlige faser af tumorigenese fra P69 til M2182 med kun små yderligere ændringer i overgangen fra M2182 til M12 celler.

Sammenligning af miR-125b (grå) og miR -22 (sort) niveauer i RNA ekstraheret fra P69, M2182 og M12 cellelinier ved SYBR baseret QRT-PCR som beskrevet i Materialer og Metoder. Fold forskel blev beregnet som gennemsnittet af tre uafhængige forsøg analyseret i tre eksemplarer og normaliseret til RNU48 (ΔC

T) som en intern kontrol og udtrykt i forhold til den parentale P69 cellelinje ved hjælp af sammenlignende C

metode T [23] . ANOVA test viser en signifikant forskel med en P-værdi 0.05.

MiR Expression i tumorvæv RNA udvindes ved LCM

For at bekræfte disse resultater observeret med prostatakræft-cellelinier blev miR dysregulering vurderet i humane tumorer opnået efter radikal prostatektomi. Bestemmelse af molekylære ændringer, der bidrager til patogenese i prostata kompliceres af heterogenitet af vævet. Ofte er tumor med varierende Gleason scorer omgivet af normale kirtelvæv alle indlejret i stroma som bemærket (Fig 2). Rene cellepopulationer kan kun opnås ved en sådan en heterogen væv med teknikker som LCM [19,20,25-29], hvilket giver mulighed for direkte visualisering og indsamling af udvalgte celler, hvilket gav en ren kilde af RNA for downstream analyser. 0,05.