PLoS ONE: en vaccine, Co-Mål tumorceller og cancer associeret fibroblaster Resultater i Enhanced antitumoraktivitet ved at inducere Antigen Spreading

Abstrakt

dendritiske celle (DC) vacciner rettet mod kun kræftceller har produceret begrænset antitumoraktivitet i fleste kliniske undersøgelser. Målretning cancer-associerede fibroblaster (CAFS) i tillæg til kræftceller kan forbedre antitumor virkninger, da CAF, den centrale del af tumor stroma, direkte støtte tumorvækst og bidrage til den immunosuppressive tumor mikromiljø. At co-target CAF og tumorceller vi udviklet et nyt stof DC vaccine, der koder for en A20-specifikke shRNA at styrke DC-funktion, og henvender fibroblast aktivering protein (FAP), udtrykt i CAF og tumor antigen tyrosin-relateret protein (TRP) 2 (DC-shA20-FAP-TRP2). DC-shA20-FAP-TRP2 vaccination induceret robust FAP- og TRP2-specifikke T-celle responser, hvilket resulterer i større antitumorvirkning i B16 melanom-model i forhold til monovalente vacciner eller en vaccine, der koder antigener og en kontrol shRNA. DC-shA20-FAP-TRP2 vaccination forbedrede tumor infiltration af CD8-positive T-celler, og induceret antigen-spredning resulterer i potent antitumoraktivitet. Således co-målretning af tumorceller og CAF resulterer i induktion af bredt baserede tumor-specifikke T-celle responser og har potentiale til at forbedre den nuværende vaccine tilgange til kræft

Henvisning:. Gottschalk S, Yu F , Ji M, Kakarla S, Song XT (2013) en vaccine, Co-Mål tumorceller og cancer associeret fibroblaster Resultater i Enhanced antitumoraktivitet ved at inducere Antigen Spredning. PLoS ONE 8 (12): e82658. doi: 10,1371 /journal.pone.0082658

Redaktør: Nikolas K. Haass, University of Queensland Diamantina Institute, Australien

Modtaget: 31. maj 2013; Accepteret: 25 oktober 2013; Udgivet: 12. december, 2013 |

Copyright: © 2013 Gottschalk et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Støttet af DAMD W81XWH-10-1-0281, NIH tilskud P50 CA126752 og 1R01CA148748-01A1. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

dendritiske celle (DC) vacciner har vist begrænset antitumorvirkning i de fleste kliniske forsøg [1]. Denne manglende effekt er mest sandsynligt på grund af tilstedeværelsen af ​​immunosuppressive celler i tumoren samt tumoren understøttende stroma begrænsende cross præsentation og induktion af bredt baserede tumor antigen-specifikke T-cellereaktioner [2], [3].

cancer associeret fibroblaster (CAFS) er nøglen cellulær komponent i tumorstroma og er til stede i de fleste almindelige epiteliale cancere, såsom lunge-, bryst- og prostata cancer, samt sarcom og melanom [4] – [7]. CAF medierer resistens over for kemo-, radio- og immunterapi, og CAF tumor indhold eller gener udtrykt i CAF korrelerer med resultatet [5], [8] – [10]. CAF udtrykker fibroblaster aktiverende protein (FAP) [11] og målrettet sletning af FAP-positive CAF i transgene musemodeller har potente antitumor effekter fremhæver deres centrale rolle i tumorigenese [12]. Desuden FAP-målrettede vacciner reduceret tumor kollagen indhold og modulerede tumoren immun mikromiljø i prækliniske modeller [13], [14].

Vi har tidligere vist, at silencing A20, en negativ regulator af NF-κb- medieret DC-aktivering, øger DC-funktion [15]. Hensigten med denne undersøgelse var nu at evaluere en vaccine, tavshed A20, og co-mål FAP-positive cafs samt tumorceller. Vores resultater viser, at en sådan forbindelse-vaccine har potent antitumoraktivitet og at co-targeting af CAF og tumorceller er kritisk for induktionen af ​​cytotoksiske T-celler specifikke for tumorantigener ikke kodes af vaccinen.

Materialer og Metoder

DC immunisering og tumormodeller

Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care og Brug udvalg af Baylor College of Medicine (BCM). C57BL /6J blev købt fra Jackson Laboratories og vedligeholdes i et patogen-fri mus facilitet på BCM efter institutionelle retningslinier. DC’er blev vasket i PBS og injiceret i den bageste trædepude af naive C57BL /6 ved 1 x 10

6 celler /mus. Mus blev aflivet på angivne dage; inguinale lymfeknuder og milten blev fjernet til intracellulær farvning og Elispot hhv. For tumormodel, blev C57BL /6-mus injiceret med 5 x 10

5 B16, B16-OVA eller EG7-OVA-tumorceller subkutant. Fem dage senere blev musene tilfældigt inddelt i grupper (n = 5 pr gruppe) og injiceret med 1 x 10

6 lentivirus-transducerede LPS-modnet DC’er. Tumorvolumener blev målt to eller tre gange om ugen med en skydelære.

lentiviral vector konstruktion, produktion og transduktion

HIV selvinaktiverende (SIN) vektor, der anvendes i denne undersøgelse var pSIH1- H1-shRNA vektor fra SBI. Mus A20 lille hårnål interfererende RNA-sekvens blev indsat i pSIH1-H1-shRNA at generere pSIH1-H1-A20-shRNA som indeholder A20 shRNA (5’CTACCTGAGTTCCTTCCCCTTCAAGAGAGGGGAAGGAACTCAGGTAGTTTTT-3 ‘). FAP eller TRP-2-cDNA blev indsat i pSIH1-H1-shRNA under kontrol af CMV-promotor for at generere pSIH1-H1-A20-shRNA-CMV-FAP, pSIH1-H1-A20-shRNA-CMV-TRP2 eller pSIH1-H1 -A20-shRNA-CMV-FAP-TRP2. Rekombinante pseudotype lentivirusvektorer blev genereret som beskrevet tidligere [15] og koncentreret ved PEG-it ™ virus nedbør løsning (System Biosciences, Mountain View, CA).

Dendritisk kultur

Bone marv dendritiske celler (DC’er) blev opnået som beskrevet [16] med følgende modifikationer. Røde blodlegemer blev lyseret ved inkubation ved stuetemperatur i Red Blood Cell lyseringsbuffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og celler blev holdt i HyClone RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (Summit, Fort Collins, CO) , ikke-essentielle aminosyrer, HEPES-buffer, glutamax, β-mercaptoethanol, IL-4 (20 ng /ml), og GM-CSF (20 ng /ml, Peprotech, Rocky Hill, NJ) i 5 dage. DC’er blev derefter transduceret med lentivirus i 8 timer, dernæst dyrket i yderligere 12-16 timer med LPS.

Flowcytometri

Flowcytometrisk analyse af DC’er og T-celler og blev udført som tidligere beskrevet [15], [17]. Inguinale lymfeknuder blev dissocieret og udpladet i komplet RPMI med lentivirus-transducerede DC’er i overnatning stimulering ved 37 ° C efterfulgt af intracellulær farvning. Farvede celler blev analyseret på en FACScalibur instrument (Becton Dickinson (BD), Mountain View, CA) ved hjælp CellQuest software (BD) for alle flow-cytometrisk analyser.

enzymmaerket spotte (Elispot) assay

ELISPOT assays af isolerede T-celler blev udført som beskrevet tidligere beskrevet [15], [17]. Milte blev dissocieret og splenocytter blev oprenset ved hjælp af MACS CD4 (L3T4) eller CD8 (Ly-2) mikroperler (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Celler blev udpladet i tredobbeltbestemmelse med OT-II eller OT-I peptid (10 ug /ml) eller anti-CD3 /CD28 til positiv kontrol. Plader blev inkuberet natten over, derefter IFN-γ-sekretion blev vurderet (antistoffer: Mabtech). Resultaterne blev evalueret i et blindet måde ved ZellNet Consulting, Inc. (New York, NY) med en automatiseret Elispot læser system, ved hjælp KS Elispot 4.3 software.

cytotoksicitet assay

Cytolytisk aktivitet T-celler blev vurderet med et standard chromfrigivelsesassay, der måler evnen af ​​in vitro-restimuleret splenocytter til at lysere målceller (20, 50). Splenocytter puljet fra immuniserede mus blev restimuleret in vitro i RPMI-1640 indeholdende B16-OVA tumor lysat og IL2 i 4-6 dage. B16 og B16-OVA-celler blev mærket med natrium

51Cr-chromat-opløsning i 60 minutter ved 37 ° C under omrystning. Forskellige antal effektorceller blev inkuberet med et konstant antal målceller (5 x 10

4 /brønd) i 96-brønds U-bundede plader (200 pi /brønd) i 4 timer ved 37 ° C. Supernatanterne fra tredobbelte kulturer blev opsamlet. Procent lyse blev beregnet som (forsøgsudsætning – spontan frigivelse) /(maksimal frigivelse – spontan frigivelse) × 100

Statistisk analyse

For statistisk analyse, vi brugte t-test med en 95. % konfidensgrænse, defineret som p 0,05. Resultaterne præsenteres typisk som middelværdi ± SEM. For dyreforsøg blev 5 mus planlagt at påvise en betydelig effekt størrelse på 2, hvilket billede mindst 80% effekt med 5% type-I fejl. For musen eksperimenter, overlevelse, bestemt fra tidspunktet for tumorceller injektion, blev analyseret ved log-rank test.

Resultater

Funktionel karakterisering af lentivirusvektorer koder shA20, FAP og TRP2

Vi bygget 4 lentivirusvektorer koder shA20 og FAP (Lv-shA20-FAP), shA20 og TRP2 (Lv-shA20-TRP2), shA20, FAP og TRP2 (Lv-shA20-FAP-TRP2), eller en kontrol shRNA, FAP, TRP2 (Lv-shCo-FAP-TRP2) (fig. 1A). Transgen ekspression og nedregulering af A20 blev bekræftet ved RT-PCR i knoglemarv afledte DC’er transduceret med VSV-G pseudotype lentivirusvektorer (fig. 1B, C).

(A) Scheme of lentivirale konstruktioner. (B og C) Mouse BM-DC’er blev transduceret med lentivirus og FAP og TRP2 ekspression (B) og A20-ekspression (C) blev påvist ved RT-PCR eller Q-PCR individuelt. (D og E) mus blev immuniseret med 1 × 10

6 lentivirus-transducerede BM-DC’er i 25 pi sterilt PBS eller PBS-kontrol via trædepuden 14 dage efter vaccination splenocytter blev fremstillet og CD8 + (D) og CD4 + (E) T celler valgt. Hyppigheden af ​​FAP- og TRP2-specifikke T-celler blev bestemt ved anvendelse IFN-y ELISPOT-analyser (n = 2; assay udført i triplikater). AF, lentiviral vector co-udtrykke en A20-specifik kort-hårnål RNA (shRNA) og FAP; AT, lentiviral vector coekspression A20-shRNA og TRP2; AFT, lentivirale vektor co-udtrykke A20-shRNA, FAP, og TRP2; CFT, lentiviral vector co-udtrykke GFP-shRNA, FAP, og TRP2; GAPDH, glyceraldehyd 3-phosphat dehydrogenase; PBS, phosphatpufret saltopløsning.

For at vise, at Lv-transducerede DCs inducerer FAP- og TRP2-specifikke T-celle responser blev mus vaccineret med 1 × 10

6 DC-shA20- FAP, DC-shA20-TRP2, DC-shA20-FAP-TRP2 eller DC-shCo-FAP-TRP2. Fjorten dage efter vaccination CD4- og CD8-positive splenocytter blev isoleret og tilstedeværelsen af ​​FAP- og TRP2-specifikke T-celler blev bestemt ved IFN-y ELISPOT-analyser. Mus vaccineret med A20-tavshed DC-vacciner inducerede signifikant højere FAP- og TRP2-specifikke CD4 og CD8-positive T-celle responser (p 0,05) end mus vaccineret med DC-shCo-FAP-TRP2, bekræfter vores tidligere fund, at lukke munden af A20 i DC’er fremmer induktionen af ​​robust CD4- og CD8-positive antigenspecifikke T-cellereaktioner

in vivo

(fig. 1D, E) [15]. Der var ingen signifikant forskel (p 0,05) i induktionen af ​​FAP- eller TRP2-specifikke T-celler responser efter vaccination af mus med DC’er udtrykker individuelle (DC-shA20-FAP eller DC-shA20-TRP2) eller begge antigener (DC-shA20 -FAP-TRP2), hvilket indikerer manglende antigen konkurrence, når begge antigener co-udtrykkes.

DC-shA20-FAP-TRP2 vaccine har potent antitumoraktivitet

B16 melanom model er ideel til vurdere, om målretning FAP-positive tumor stroma øger antitumorvirkninger siden B16-celler udtrykker ikke FAP [18]. Vi bekræftede induktion af FAP ekspression inden for 5 dage efter B16 tumorimplantation ved RT-PCR (fig. 2A). Mus med 5 dage gamle B16 tumorer blev vaccineret med en enkelt dosis af 1 × 10

6 DC-shA20-FAP, DC-shA20-TRP2, DC-shA20-FAP-TRP2 eller DC-shCo-FAP- TRP2 vaccine. Alle A20-tavshed vacciner havde antitumoraktivitet, mens ikke-A20 tavshed DC-vaccine havde ingen (Fig. 2B). Der var ingen forskel i antitumoraktiviteten af ​​DC-shA20-FAP og DC-shA20-Trp2 vacciner, hvilket indikerer, at T-celle-responser mod et stroma antigen alene kan have betydelige antitumorvirkninger (fig. 2B). Målretning FAP og TRP2 samtidig med DC-shA20-FAP-TRP2 vaccine resulterede i den største antitumoraktivitet (DC-shA20-TRP2 vs DC-shA20-FAP-TRP2, s 0,05; DC-shA20-FAP vs DC-shA20- FAP-TRP2, s 0,05). Dette resulterede i en signifikant stigning i overlevelse af mus, der fik DC-shA20-FAP-TRP2 vaccine i sammenligning med de andre vaccine-grupper (2C). Superior antitumoraktiviteten af ​​et tumor- og stroma-målrettet vaccine blev bekræftet under anvendelse af en DC-shA20-FAP-OVA vaccine i B16-OVA og EG7-OVA-modeller (Fig. S1a, B).

(A) RT-PCR for FAP og GAPDH af B16 cellelinje, og dag 5 B16 tumorer. (B, C) blev Mus podet med B16 efterfulgt af immunisering med 1 × 10

6 DC-shA20-FAP (AF), DC-shA20-TRP2 (AT), DC-shA20-FAP-TRP2 (AFT), DC-shCo-FAP-TRP2 (ACT) eller PBS på dag 5 (n = 5 pr gruppe). (B) Cotargeting FAP og TRP2 med AFT resulterede i den største antitumor respons (AF vs AFT, s 0,05; AT vs AFT, s 0,05). (C) Kaplan-Meier overlevelse kurve (AF vs AFT, s 0,05; AT vs AFT, s 0,05).

DC-shA20-FAP-Trp2 vaccine stiger FAP- og TRP2-specifikke CD8-positive T-celler i tumorer

for at undersøge mekanismerne bag en forbedring af de antitumor virkninger, vi først bestemmes hyppigheden af ​​CD4 og CD8-positive T-celler i B16 tumorer 3 uger efter vaccination. Mens der var ingen signifikant forskel i procentdelen af ​​CD4-positive T-celler inden tumorer mellem grupper af vaccinerede mus (data ikke vist), var der en signifikant (p 0,05) 4-fold stigning i procentdelen af ​​CD8-positive T-celler efter DC-shA20-FAP-TRP2 vaccination sammenlignet med kontrolmus (fig. 3A, B). I modsætning hertil har de monovalente vacciner eller FAP /TRP2 DC-vaccine ikke-lyddæmpet ikke øge hyppigheden af ​​intratumorale CD8-positive T-celler i forhold til kontroller. For at undersøge specificiteten af ​​infiltrerende CD8-positive T-celler, blev tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL’er) isoleret 3 uger efter vaccination. Intracellulær cytokin-farvning for IFN-γ blev udført efter stimulering med FAP- eller Trp2-udtrykkende DC’er. DC-shA20-FAP-TRP2 vaccination inducerede den højeste frekvens af FAP- og TRP2-specifikke T-celler i sammenligning med de andre vacciner (fig. 3C), hvilket afspejler den tidligere observerede samlede stigning i antallet af CD8-positive T-celler inden tumorer .

Mus blev podet med B16 tumorer efterfulgt af immunisering med 1 × 10

6 DC-shA20-FAP (aF), DC-shA20-TRP2 (AT), DC-shA20-FAP-TRP2 ( AFT) eller PBS på dag 5. tumorvæv blev dissekeret 3 uger efter vaccination (n = 5). (A) repræsentative FACS-analyse af infiltrerende CD8 + T-celler. (B) Sammendrag data for alle mus viste en signifikant stigning (p 0,05) af CD8 + -T-celler i mus vaccineret med AFT (n = 8 pr gruppe). (C) TIL’er blev restimuleret med DC’er transduceret med FAP (DC-Lv-FAP) eller TRP2 (DC-LV-TRP2) efterfulgt af intracellulær farvning af IFN-γ. En af 2 repræsentative eksperimenter i vist.

DC-shA20-FAP-TRP2 vaccine inducerer antigen breder

I det foregående eksperiment vi bemærkede, at DC-shA20-FAP vaccine induceret TRP2 -specifikke T-celle-responser (fig. 3C), hvilket indikerer epitopspredning og induktion af antigen spredning. For yderligere at undersøge dette fund blev B16 tumor-bærende mus vaccineret på dag 5 med DC-shA20-FAP, DC-shA20-TRP2, DC-shA20-FAP-TRP2 eller PBS. Efter 3 uger hyppigheden af ​​T-celler specifikke for B16-associeret tumor antigener tyrosinase-relateret protein 1 (TRP1), tyrosinase (Tyr), gp100, og melanom-associeret antigen, der genkendes af T-celler (MART1) blandt splenocytter og tumorinfiltrerende lymfocytter blev bestemt. Mens alle vacciner inducerede en signifikant forøgelse af TRP1-, Tyr-, gp100- og MART1-specifikke T-celler i TIL’er i sammenligning med PBS-injicerede mus (fig. 4A), hyppigheden af ​​melanom-specifikke T-celler var højest i DC -shA20-FAP-Trp2 vaccinerede mus (p 0,05). Kun DC-shA20-FAP-TRP2 vaccine fremkaldt systemisk T-celle responser mod TRP1, Tyr, gp100, og MART1 (Fig.4B). Disse resultater indikerer, at målretning af tumor stroma samt tumoren muliggør induktion af antigen spredes. Salg

Mus blev inokuleret med B16 tumorer efterfulgt af immunisering med 1 × 10

6 DC-shA20-FAP ( aF), DC-shA20-TRP2 (AT), DC-shA20-FAP-TRP2 (AFT) eller PBS på dag 5. TIL’er og Splenocytter blev forberedt 3 uger efter vaccination (n = 5). (A) TIL’er blev restimuleret med DC-Lv-TRP2, DC-Lv-TRP1, DC-Lv-TYR, DC-Lv-gp100, DC-Lv-MART1 eller mock transducerede DC’er (PBS) efterfulgt af intracellulær farvning af IFN γ. FACS-analyse og en kumulativ søjlediagram er vist. TIL’er isoleret fra AFT vaccinerede mus havde den højeste frekvens af B16-speciifc T-celler (p 0,05). (B) Splenocytter blev underkastet IFN-y ELISPOT-analyser. DC-Lv-TRP2, DC-Lv-TRP1, DC-Lv-TYR, DC-Lv-gp100, DC-Lv-MART1 eller mock transducerede DC’er (PBS) blev anvendt som APC’er. Der var en signifikant stigning (p 0,05). Af T-celler specifikke for TRP1, TYR, gp100, og MART1 kun i AFT vaccinerede mus

Antigen spredning resulterer i forøget antitumoraktivitet

der vist, at de udviklede sammensatte vacciner inducerede B16 antigen spreder vi ønskede at bestemme, om disse antigenspecifikke T-celler har anti-tumor aktivitet. Mus blev inokuleret med B16-OVA og B16 på deres højre eller venstre flanker, og efter 5 dage vaccineret med DC-shA20-FAP, DC-shA20-OVA, DC-shA20-FAP-OVA eller PBS. DC-shA20-OVA vaccination kun inhiberes væksten af ​​B16-OVA, mens DC-shA20-FAP vaccine inhiberede B16 samt B16-OVA tumorvækst (fig. 5A, B). DC-shA20-FAP-OVA-vaccine havde den største antitumoraktivitet mod både tumorcellelinjer (p 0,05;. Figur 5A, B). Dette er i overensstemmelse med vores observation, at co-targeting tumorantigen og FAP inducerer systemiske T-celler reaktioner mod tumorantigen ikke er til stede i vaccinen (Fig.4B). Mens DC-shA20-OVA vaccination ikke resulterede i en stigning i den samlede overlevelse på grund af de antigen negative B16 tumorer, DC-shA20-FAP eller DC-shA20-FAP-OVA vaccination resulterede i en betydelig stigning i den samlede overlevelse i forhold til DC-shA20-OVA (p 0,05, fig 5.C).

(AC) Mus blev podet med B16-OVA eller B16 tumor på højre eller venstre flanke separat efterfulgt af immunisering med 1 × 10

6 DC-shA20-FAP (AF), DC-shA20-OVA (AO), DC-shA20-FAP-OVA (AFO) eller PBS 5 dage senere (n = 5 pr gruppe). B16-OVA (A) og B16 (B) tumorvækst blev målt. Den AFO og AF-vaccine havde anti-B16 aktivitet med AFO være overlegen (p 0,05). (C) Kaplan-Meier overlevelse kurve (AO vs AF, p 0,05; AO vs AFO, s 0,05). (D, E) Mus blev podet med B16-OVA efterfulgt af immunisering med 1 × 10

6 AF, AO, AFO, og PBS 5 dage senere. 3 uger senere blev splenocytter fremstillet og dyrket in vitro i nærvær af B16-OVA tumor lysat og IL2 i 5 dage og deres cytolytiske aktivitet blev evalueret i standard udsat

51Cr frigivelsesassay mod B16-OVA (D) eller B16 ( E). Splenocytter isoleret fra AF og AFO vaccinerede mus havde signifikant cytolytisk aktivitet B16. * AFO vs AF og AO, s 0,05; ** AF og AO vs PBS, s 0,05; *** AFO og AF vs AO, s. 0,05)

For yderligere at bekræfte den systemiske induktion af T-celler specifikke for antigener ikke i vaccinen blev mus injiceret med B16-OVA og vaccineret efter 5 dage med DC-shA20-FAP, DC-shA20-OVA, DC-shA20-FAP-OVA eller PBS. Efter 3 ugers splenocytter af vaccinerede mus blev isoleret og restimuleret i 5 dage

ex vivo

før du udfører en cytotoksicitet assay med B16-OVA og B16 celler som mål. Splenocytter høstet fra DC-shA20-FAP eller DC-shA20-FAP-OVA vaccinerede mus viste signifikant drab på B16-OVA og B16-celler (fig. 5D, E), hvor som DC-shA20-OVA-vaccine primært induceret OVA-specifikke T-celle responser.

diskussion

Vores resultater viser, at en DC-vaccine, ved hvilken antigenpræsenterende dæmperen A20 inhiberes, og som målretter FAP-positive CAF og tumorantigenet TRP2 har potent antitumor effekter, gør cross-præsentation af tumorantigener ved intratumorale APC’er, der resulterer i den bredt funderede induktion af T-celler specifikke for tumorantigener ikke indgår i vaccinen.

tumoren mikromiljø er en kompleks miljø og spiller en afgørende rolle i tumor initiering, progression og mediere terapeutisk modstand [9], [10]. Målretning ikke-maligne celler til stede i tumorer i tillæg til kræftceller kan derfor øge effektiviteten af ​​kræft-målrettede behandlinger [7], [19], [20]. FAP-positive CAF, den centrale cellulære komponent af tumor stroma, er dukket op som centrale aktører i at fremme ekstracellulære matrix (ECM) remodeling, vaskularisering og immunsuppression [21]. For eksempel i transgene mus, hvori difteritoksin receptoren udtrykkes under kontrol af FAP-promotoren, administration af difteritoksin, som kun dræber tumorassocierede FAP-positive stromaceller, resulterede i fuldstændig ablation af faste tumorer [12] .

FAP er en membran bundet aminopeptidase, som er involveret i ECM remodellering [22]. Inhibering af aminopeptidaseaktiviteten af ​​FAP resulterede i nedsat tumorvækst og var forbundet med en ophobning af kollagen, nedsat antal myofibroblasts og nedsat tumorvaskularisering i prækliniske modeller [21], men ingen objektive kliniske responser blev observeret i kliniske forsøg [23] . Målretning FAP med et humaniseret monoklonalt antistof, sibrotuzumab, viste også ingen objektive kliniske respons; imidlertid viste billeddannende undersøgelser, at antistoffet fortrinsvis lokaliseret til metastatiske tumorsteder efter administration [24].

Adskillige grupper har udført vaccine undersøgelser udelukkende rettet mod FAP, hvilket viser, at S. typhimuirum-, plasmid-, eller DC-baseret FAP-vacciner har antitumoraktivitet i forebyggende eller tidlige terapeutiske indstillinger, modulere tumor mikromiljø ved at fremme Th1 polarisering og forbedre infiltration af CD8-positive T-celler [13], [14], [18], [25]. Mens cotargeting af FAP-positive CAF og tumorceller med en DC-vaccine viste en signifikant forsinkelse i tumorvækst i et præklinisk studie, blev der ikke mekanistiske undersøgelser udført [18].

Vores undersøgelser nu udvide disse resultater og viser, at silencing ubiquitin-ligasen A20, en antigenpræsenterende attenuator i DC’er, resulterer i en signifikant stigning i hyppigheden af ​​FAP-specifikke T-celler i sammenligning med en DC-vaccine med en kontrol shRNA. Dette understreger den vigtige rolle, tavshed negative regulatorer såsom A20 i APC at fremkalde T-celle responser mod selv-antigener, såsom FAP [15]. Vi observerede ingen forskel i antitumoraktiviteten af ​​DC-shA20-FAP og DC-shA20-TRP2, hvilket indikerer, at målretning CAF ved FAP vaccination kan inducere antitumorvirkninger ligner vacciner der er målrettet mod maligne celler. Imidlertid vaccination med DC-shA20-FAP-TRP2 resulterede i den største antitumoraktivitet. Mekanistisk undersøgte afslørede, at cotargeting af CAF og tumorceller resulterede i en øget procentdel af CD8-positive T-celler i tumorer og induktionen af ​​T-celler specifikke for antigener der ikke forekommer i vaccinen med potente antitumoraktivitet. DC-shA20-FAP, DC-shA20-Trp2, og DC-shCo-FAP-Trp2 induceret vaccine sammenlignelige niveauer af CD8-positice TIL’er (fig. 3B), dog kun DC-shA20-FAP og DC-shA20-Trp2 vacciner havde antitumorvirkning (fig. 2B). Vi havde tidligere vist, at A20-siRNA-adjuveret DC vacciner inducerer potent tumor antigen-specifikke cytotoksiske T-celler og T hjælper celler, der er refraktære over for Treg inhibering [15]. Således, mens alle tre vacciner inducerede sammenlignelige TIL reaktioner, DC-shA20-FAP og DC-shA20-TRP2-induceret TIL’er er mest sandsynligt mere effektive til at hæmme tumorvækst.

Vaccine studier i brystkræft, renal karcinom, og melanompatienter tyder på, at cross-præsentation og epitopspredning korrelerer med forbedret samlet overlevelse [26] – [28]. Desuden induktionen af ​​bredt baserede tumorspecifikke T-celle-responser efter adoptiv T-celle overdragelse i en melanompatient resulterede i et fuldstændigt respons [29]. Mens disse undersøgelser fremhæver betydningen af ​​epitopspredning, er de afgørende faktorer for effektivt at fremkalde cross-præsentation og epitopspredning øjeblikket dårligt defineret. Mens alle vacciner inducerede lave niveauer af TIL’er, der var specifikke for antigener der ikke forekommer i vaccinen, kun de tumor- og stroma-målrettet induceret vaccine systemisk T-celle-reaktioner på alle testede ikke-vaccineantigener. Målretning kun tumor stroma med DC-shA20-FAP resulterede i induktion af TRP2-specifik TIL’er og systemiske Trp2-specifik T-celle-responser, der var højere (om end ikke signifikant) i forhold til DC-sh-TRP2 vaccine. Disse resultater antyder, at målrette FAP-positive stroma resulterer i ødelæggelse af B16-celler og tilbageførsel af det immunosuppressive tumormikromiljøet.

Vigtigt de inducerede tumor-specifikke T-celler var cytotoksiske og havde antitumoraktivitet over antigen-tab varianter (overblik kan anbefales ALVS), som allerede er blevet observeret hos patienter indskrevet på vaccine eller T-celle immunterapi studier, der kun er rettet mod tumorantigener [30], [31]. Mens andre grupper har vist i prækliniske modeller, der krydser præsentation af antigener på stromaceller er kritisk for fjernelse af overblik kan anbefales ALVS bruger højt udtrykt model antigen [32], vore resultater indikerer, at målretning stromaceller er nødvendig for at inducere bredt baseret anti-tumor reaktioner, som skal minimere risikoen for overblik kan anbefales ALVS.

sammenfattende forbindelsen vaccine, vi har udviklet inducerer CAF- og tumor-specifikke immunreaktioner og fremkalder bredt baserede T-celle responser mod tumorantigener. Således målrettet CAF foruden maligne cancerceller har potentiale til at forbedre de nuværende vaccine tilgange til kræft.

Støtte Information

Figur S1.

DC-shA20-FAP-OVA-vaccine har potent antitumoraktivitet

doi:. 10,1371 /journal.pone.0082658.s001

(PDF)

Tak

Vi tak Cliona M Rooney og Malcolm K Brenner til nyttige diskussioner og rådgivning.