PLoS ONE: Aktivering af mesenchymale stamceller fra makrofager Prompts Menneskelig Gastric Cancer Vækst gennem NF-KB-Pathway

Abstrakte

Akkumulerende beviser indikerer, at makrofager aktiverer mesenkymale stamceller (MSC) til at erhverve pro-inflammatoriske fænotype. Imidlertid rolle MSC’er aktiveres af makrofager i gastrisk cancer forbliver stort set ukendt. I denne undersøgelse fandt vi, at MSC’er blev aktiveret ved makrofager til at producere forøgede niveauer af inflammatoriske cytokiner. Cell kolonidannelse og Transwell migration analyser afslørede, at supernatanter fra de aktiverede MSC’erne kunne fremme både gastrisk epitelcelle og mavekræft celleproliferation og migration. Endvidere blev ekspressionen af ​​epitel-mesenkymale overgang (EMT), angiogenese, og stemness gener forøget i aktiverede MSC’er. Det phosphorylerede former af NF-KB, ERK og STAT3 i gastriske celler blev forøget med aktive MSC. Inhibering af NF-KB-aktivering af PDTC blokeret effekten af ​​aktiverede MSC’er på gastriske cancerceller. Co-injektion af aktiverede MSC’er med gastriske kræftceller kan fremskynde gastrisk kræft vækst. Desuden humane perifere blodmonocytter afledte makrofager også aktiveret MSC at bede mavekræft proliferation og migration. Tilsammen vores resultater tyder på, at MSC’er aktiveres af makrofag erhverve pro-inflammatoriske fænotype og hurtig mavekræft vækst i et NF-KB-afhængig måde, som giver nye beviser for modulering af MSC ved tumor mikromiljø og yderligere indsigt til rollen som stromale celler i gastrisk carcinogenese og kræft progression

Henvisning:. Yang T, Zhang X, Wang M, Zhang J, Huang F, Cai J, et al. (2014) Aktivering af mesenkymstamceller af makrofager Prompts Menneskelig Gastric Cancer Vækst gennem NF-KB Pathway. PLoS ONE 9 (5): e97569. doi: 10,1371 /journal.pone.0097569

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan

Modtaget: Februar 18, 2014 Accepteret: April 21, 2014; Udgivet: 13. maj 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Major Research Plan for National Natural Science Foundation of China (Grant nr 91.129.718), National Natural Science Foundation of China (Grant nr. 81.302.119, 81.201.660, 81.071.421), Jiangsu-provinsen for fremragende Sci-tech Innovation Team i Gymnasier og universiteter (Grant nr. SJK2013-10), Jiangsu-provinsen Project of videnskabeligt og teknologisk innovation og præstationer Transformation (Grant no.BL2012055), Jiangsu-provinsen udestående Medical Academic Leader og Sci-tech Innovation Team Program (Grant no.LJ201117), Natural Science Foundation i Jiangsu-provinsen (Grant no.BK2012709, BK20130540), ph.d.-program Foundation of State undervisningsministerium (Grant nr. 20113227110011), Jiangsu-provinsen for Natural Scicence forskning i Læreanstalter og universiteter (13KJB320001). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er en af ​​de hyppigst forekommende maligniteter og holder en væsentlig årsag til dødelighed kræft i hele verden [1], [2]. I Kina er der omkring 360.000 personer dør af mavekræft hvert år [3]. Selvom forekomsten er faldet i de seneste år i Vesten, overlevelse er endnu værre [4]. I de sidste årtier, er blevet udøvet stor indsats for at belyse patogenesen af ​​mavekræft. Men den komplekse mekanisme af gastrisk carcinogenese stadig afdækket. Akkumulere beviser indikerer, at langvarig kronisk inflammation er en af ​​de førende årsager til tumorigenese. Frigivelse af pro-inflammatoriske mediatorer og øget lokalt plan af oxygen og nitrogen arter kan bidrage til carcinogenese [5]. Den dysreguleret produktion af cytokiner i inflammatorisk mikromiljø stimulerer ekspressionen af ​​gener, der er forbundet med udvikling af kræft og ændrer strukturelle træk af mikromiljø at accelerere kræft initiering og progression [6] – [9].

Tumor mikromiljø består af forskellige stromale celler , herunder infiltrerende immunceller, carcinom-associerede fibroblaster (cafeer), mesenchymale stamceller (MSC’er), og blod og lymfe vaskulære netværk. Disse celler interagerer med hinanden og udgør inflammatorisk mikromiljø og bidrage til tumorgenese [10], [11]. Blandt de stromale celler, makrofager, som vigtige immune regulatoriske celler, spiller en dominerende rolle i forvaltningen af ​​betændelse i tumor mikromiljø. For eksempel, makrofager isoleret fra tumor mikromiljø brystkræftpatienter hemmelige kemotaktiske cytokiner at forøge metastase af carcinomaceller [12]. Makrofager har også vist sig at fremme inflammatorisk respons og tumorigenese gennem påvirker ekspression af inflammatoriske cytokiner og ændring af de molekylære onkogene programmer inden epitelceller [13]. Salg

Mesenchymstamceller (MSC’er) er en anden væsentlig komponent af tumoren mikromiljø og betragtes som de precursorceller af cancer associeret mesenchymale celler og endotelceller [14]. De tidligere undersøgelser har indikeret, at MSC hemmelige opløselige faktorer til fremme af cancercelleproliferation og metastase [10]. I en inflammationsforbundet gastrisk cancer model, kan MSC’er aktiveres i retning CAF at øge kronisk inflammation og cancer progression [15]. Endvidere er MSC’er blevet rapporteret at rekruttere monocytter /makrofager til at fremme tumorvækst i en CCR2-depedent måde [16]. Interaktioner mellem makrofager og MSC’er producere en aktiveret, pro-inflammatorisk fænotype med høj CXCL10 og IL-6-udskillelse, som kan påvirke den inflammatoriske mikromiljø [17].

mavekræft er en klassisk model for kronisk inflammation til kræft. Imidlertid rolle MSC’er aktiveres af makrofag i gastrisk cancer og den underliggende mekanisme er stadig ukendte. I denne undersøgelse fandt vi, at MSC’er kraftigt blev aktiveret ved makrofager under inflammatorisk tilstand, til at producere inflammatoriske cytokiner og tumorfremmende faktorer, der fører til forøgelse af gastrisk epitelcelle og cancercelleproliferation og migrering gennem aktivering af NF-KB-vejen. Vores resultater viser, at makrofager-aktiverede MSC fremmer gastrisk kræft vækst og progression under inflammatorisk tilstand.

Materialer og metoder

Cell Culture

Menneskelig mavekræft cellelinje HGC-27, human gastrisk epitelcelle linje GES-1, og human akut monocytiske leukæmi cellelinje THP-1 blev købt fra Institut for Biokemi og Cellebiologi ved Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). GES-1 og THP-1-celler blev dyrket i RPMI-1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) med 10% føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen), og HGC-27 celler blev holdt i høj glucose DMEM (H -DMEM, Invitrogen) med 10% FBS. MSC’er blev afledt fra navlestrengen og dyrket i lav-glucose DMEM (L-DMEM, Invitrogen) med 10% FBS. Celler blev alle inkuberet ved 37 ° C i befugtet cellekultur inkubator med 5% CO

2. De friske navlestrengen væv blev indsamlet fra raske barselspatienter mødre efter skriftligt informeret samtykke blev opnået. MSC’er blev isoleret og karakteriseret som tidligere beskrevet [18]. Alle eksperiment protokoller blev godkendt af den etiske komité i Jiangsu Universitet. MSC på passage 3 blev udvalgt til eksperimenterne.

Supernatant Forberedelse

Til fremstilling af makrofag associeret MSC supernatant, MSC (3 × 10

5) blev podet til at klæbe. THP-1-celler (01:01 forhold) blev tilsat frisk medium i nærvær eller fravær af LPS (1 ug /ml). Efter co-dyrkning i 48 timer blev mediet bortkastet, og cellerne blev forsigtigt vasket med PBS for at fjerne THP-1-celler. Supernatanterne fra aktiverede MSC’er blev opsamlet 24 timer senere, filtreret med et 0,22-um filter og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Ved anvendelse til cellefunktion analyser blev supernatanterne fra aktiverede MSC’er blandet med tilsvarende volumen af ​​10% FBS-holdigt H-DMEM eller RPMI-1640 medium. For signalvejen analyser blev celler behandlet med supernatanterne fra aktiverede MSC’er i 1 time

Luminex assay

Humant cytokin kemokin magnetiske perler panel kit (# HCYTOMAG-60K) (Millipore, Billerica, MA, USA) blev designet til at detektere granulocytkolonistimulerende faktor (G-CSF), blodpladeafledt vækstfaktor-BB (PDGF-BB), monocyt-kemoattraktant protein- 1 (MCP-1), tumornekrosefaktor-α (TNF-α), vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF), IL-10, IL-1β, IL-4, IL-6 og IL-8 i supernatanten fra aktiverede MSC. Alle procedurer blev bearbejdet i overensstemmelse med producentens anvisninger. Signalerne blev påvist og analyseret ved hjælp Luminex200 System (Millipore).

Transwell Migration Assay

Efter behandling med supernatanterne fra aktiverede MSC’er i 48 timer, GES-1 og HGC-27-celler ( 1 × 10

5 /brønd) blev anbragt i det øvre kammer (8 um) (Corning, NY, USA) i serum-frit medium. Det komplette medium blev anbragt i det nedre kammer. Efter inkubation i 12 timer blev celler tilbage ved bunden af ​​polycarbonatmembran aftørres med vatpinde. Cellerne migrerer til den nedre overflade af membranen blev derefter fikseret med methanol i 30 minutter. De migrerede celler blev farvet med krystalviolet i 15 minutter og talt i seks tilfældige felter under mikroskop (100 x).

Cell kolonidannelse Assay Salg

Celler blev opsamlet efter behandlingen med supernatanterne fra MSC’er i 48 timer og podet i plader med 6 brønde (1000 celler /brønd) og dyrket i 10 dage. Mediet blev skiftet hver tredje dag. Ved slutningen af ​​vækstperioden blev celler fikseret med methanol i 30 minutter og farves med krystalviolet i 15 minutter. De cellekolonier blev fotograferet, og antallet af kolonier blev talt til statistisk analyse.

RNA-ekstraktion og Real-time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner . Fem mikrogram RNA blev anvendt til kvantitativ realtids-PCR-analyse. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. Sekvenserne af specifikke primere blev alle anført i tabel S1.

Western Blot

Celler blev lyseret og homogeniseret i RIPA-buffer suppleret med komplette proteasehæmmere. Lige så stor mængde af proteiner (200 ug) blev løst i 12% SDS-PAGE. Proteinerne blev herefter overført til PVDF-membraner efter elektroforese. Efter blokeret i 5% (vægt /volumen) fedtfri mælk i 1 time ved stuetemperatur blev membranerne derefter inkuberet ved deres respektive passende fortyndinger af specifikke primære antistoffer natten over ved 4 ° C. Kilderne til primære antistoffer var: anti-Oct4, anti-Sox2, anti-vimentin og anti-phospho-STAT3 (Signalway Antibody, USA), anti-GAPDH (Kangcheng, Shanghai, Kina), anti-E-cadherin, anti- ERK1 /2, anti phospho-ERK1 /2 og anti-N-cadherin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-PCNA, anti-STAT3, anti-NF-KB, anti-phospho-NF- KB, anti-CyclinD1, anti-VEGF og anti-C-jun (Bioworld Technology, Louis Park, MN, USA), anti-c-myc (Proteintech Gruppen, Chicago, IL, USA).

Animal Model

Tre til fem uger gamle BALB /c nøgne mus blev købt fra SLAC Laboratory Animal center (Shanghai, Kina). Dyrene blev vedligeholdes i overensstemmelse med de institutionelle politikker, og alle undersøgelser blev udført med godkendelse fra universitetet Udvalget om brug og pasning af dyr af Jiangsu Universitet. HGC-27-celler (1 x 10

6) og MSC’er (5 x 10

5) blev trypsinbehandlet, vasket og resuspenderet i 200 pi PBS, hhv. Derefter blev cellerne blandet og co-injiceret i venstre flanke af nøgne mus. Tumorer blev fjernet kirurgisk 20 dage efter injektion, fotograferet og vægtet. Tumor størrelse blev vurderet ved caliper måling og beregnet på grundlag af den modificerede ellipsoide formel (L × B × W /2), hvor L er længden, og W repræsenterer bredden.

Immunhistokemi

formalinfikserede paraffinindlejret musetumor vævssnit blev først afparaffiniseret i xylen, rehydreret gennem gradueret ethanol. Snittene blev kogt i 10 minutter i citratpuffer (pH 6,0, 10 mM) for antigen-genvinding. Den endogene peroxidase aktivitet blev inhiberet med udsættelse for 3% hydrogenperoxid i 10 min. Derefter blev snittene blokeret med 5% BSA (Boster Bioengineering, Wuhan, Kina) og inkuberet med korrekt fortyndet PCNA eller VEGF primært antistof ved 37 ° C i 1 time. Efter vasket med PBS blev snittene derefter inkuberet med fortyndet sekundært antistof i 20 min. Endelig blev sektioner visualiseret med 3,3′-diaminobenzidin (DAB) og derefter kontrastfarvet med hæmatoxylin til undersøgelse ved lysmikroskopi (200 ×).

Primær humane monocytter Isolation

Humane monocytter blev opnået fra fibrinlag af perifere blodprøver doneret af rask donor anvendelse af Ficoll (Histopaque-1077) (Sigma, USA). Frisk RPMI 1640 suppleret med 10% FBS blev skiftet hver 2. dag, og ikke-adhærente celler blev fjernet og renset. Monocytter blev inkuberet i 7 dage og 50 ng /ml M-CSF blev tilsat til opnåelse af makrofager (M). Derefter 24 timer supernatant udskilles af makrofager blev opsamlet og filtreret. Adhærerende MSC’er blev behandlet med den makrofag supernatant i fravær eller nærvær af LPS (1 ug /ml) i 48 timer og vaskes. Supernatanterne fra aktiverede MSC’er blev opsamlet 24 timer senere og anvendt til følgende forsøg.

Statistical Analysis

Statistisk analyse blev udført med SPSS Statistics software 16.0. Data blev præsenteret som gennemsnit ± SD. Forskelle i forskellige grupper blev analyseret under anvendelse envejs ANOVA. Forskelle mellem PDTC behandlinger blev testet af

t

test. Statistisk

P

værdi 0,05 blev anset for at være betydelige

Resultater

Co-kultur med makrofager Under betændelsestilstand Up-reguleret ekspression af inflammatoriske cytokin og Stemness Gener i. MSC’er

for at undersøge effekten af ​​makrofager på MSC’er under inflammatorisk tilstand, vi co-dyrkede MSC’er med THP-1-celler i fravær eller nærvær af LPS (1 ug /ml) i 48 timer. THP-1-celler blev fjernet ved PBS vask og de adhærente MSC’er dyrkedes i frisk medium i yderligere 24 timer (Figur S1). Luminex-assay blev udført for at bestemme niveauerne for adskillige inflammatoriske faktorer i supernatanterne fra MSC’er. Resultaterne viste, at produktionen af ​​IL-6, IL-8, TNF-α, MCP-1, VEGF og G-CSF blev signifikant forøget i supernatanten fra MSC’er samdyrket med THP-1-celler i nærvær af LPS. Lave eller udetekterbare niveauer af disse cytokiner blev observeret i MSC’er, der ikke var samdyrket med THP-1-celler (figur 1A). For at bekræfte den forøgede ekspression af disse inflammatoriske cytokiner, vi preformed realtids-PCR til påvisning af mRNA niveauer af disse cytokiner. Vi fandt, at i overensstemmelse med Luminex analyseresultaterne (figur 1B), co-kultur med THP-1-celler opreguleret mRNA niveauer af IL-6, IL-8 og TNF-α i MSC’er. For at bestemme om co-kultur med THP-1-celler påvirker stemness af MSC’er, detekteret vi ekspressionen af ​​Oct4 og Sox2 i MSC’er ved anvendelse af Western-blot. Resultaterne viste, at både Oct4 og Sox2 proteinniveauer blev forøget i MSC’er, der var samdyrket med THP-1-celler (figur 1C). For yderligere at bekræfte dette fænomen, vi undersøgte også mRNA niveauerne af Oct4 og Sox2 i MSC. Resultaterne af realtids-PCR viste, at sam-kultur med THP-1-celler opreguleret ekspression af Oct4 og Sox2 gener i MSC’er (Figur 1D). Generelt er disse resultater antyder, at MSC’er blev væsentligt aktiveret til at producere højere niveauer af inflammatoriske cytokiner ved co-dyrket THP-1-celler under inflammatorisk tilstand.

(A) Luminex assay for IL-6, IL-8, TNFa, MCP-1, VEGF og G-CSF-niveauer i supernatanter fra MSC’er. (B) Real-time PCR-analyser af IL-6, IL-8, TNFa, MCP-1, VEGF og TGF-β-mRNA-ekspression i MSC’er. ***

P

0,001, **

P

0,01, *

P

0,05. (C) Western blot-analyser af Oct4 og Sox2 proteinniveauer i MSC’er. (D) Real-time PCR-analyser af Oct4 og Sox2 mRNA-ekspression i MSC’er. ***

P

0,001, **

P

0,01, *

P

. 0,05

Macrophages- aktiverede MSC’er Forbedret spredning og Migration af Gastric epitelceller

makrofager og MSC er vigtige komponenter i tumor mikromiljø. For at demonstrere de funktionelle roller makrofager-aktiverede MSC’er, vi samlet de supernatanter fra aktiverede MSC’er og inkuberet med gastrisk epitelcellelinie GES-1 i 48 timer. Vi udførte derefter celle kolonidannelse assay til evaluering af proliferationen af ​​GES-1-celler. Som vist i figur 2A, cellerne blev inkuberet med supernatanten fra aktiverede MSC’er voksede hurtigere og dannede flere og større kolonier end de i andre grupper. Desuden inkubering med supernatanten fra aktiverede MSC’er også øget protein niveauer af PCNA og VEGF i GES-1-celler (figur 2B). Resultaterne af transwell migration assay viste, at antallet af migrerede GES-1-celler i aktiverede MSC’er plus LPS-gruppen var mere end det i andre grupper (Figur 2C). Resultaterne af Western blot-analyser viste, at makrofager-aktiverede MSC’er forøgede ekspressionen af ​​mesenchymale cellemarkører (N-cadherin og vimentin) og faldt ekspressionen af ​​epitelcelle markør (E-cadherin) i GES-1-celler (figur 2D). Derefter bestemte vi ekspressionen af ​​VEGF, MMP9 og TGF-β ved anvendelse af real-time PCR. Som vist i figur 2E, inkubering med supernatanten fra Activate MSC’er plus LPS gruppe opreguleret ekspression af VEGF, MMP9 og TGF-β i GES-1-celler. Således MSC’er aktiveres af makrofager i inflammatorisk miljø væsentligt fremmet gastrisk epitel celle proliferation og migration.

(A) Repræsentative billeder af celle kolonidannelse assay og histogram af koloni nummer. Data blev opført som middelværdi ± SD af tre brønde. **

P

0,01, *

P

0,05. (B) Western blot assays for PCNA og VEGF proteinniveauer. (C) Repræsentative billeder af transwell migration assay og histogram af antallet af migrerede GES-1-celler. Forstørrelse, × 100, skala bar = 50 um. ***

P

0,001, **

P

0,01, *

P

0,05. (D) Western blot assays for E-cadherin, N-cadherin og vimentin proteinniveauer. (E) Real-time PCR-analyser af VEGF, MMP9 og TGF-β-mRNA-ekspression. **

P

0,01, *

P

. 0,05

makrofager-aktiverede MSC fremmet vækst og Migration af mavekræft Cells

Da makrofager-aktiverede MSC påvirker gastrisk epitelcelleproliferation og migration, vi næste bestemmes effekten af ​​makrofager-aktiverede MSC’er på menneskers mavekræft HGC-27 celler. Resultaterne af celle kolonidannelse assay viste, at HGC-27-celler inkuberet med supernatanten fra makrofager-aktiverede MSC’er voksede hurtigere og dannede større kloner end de andre grupper (figur 3A). Western bolt analyser viste, at proteinet niveauer af PCNA og VEGF i HGC-27-celler var signifikant opreguleret af supernatanten fra makrofager-aktiverede MSC’er (Figur 3B). Transwell migration assay viste, at antallet af migrerede HGC-27 celler påfaldende blev forhøjet med supernatanten fra makrofager-aktiverede MSC’er (Figur 3C). Western blot-analyser viste, at makrofager-aktiverede MSC’er inducerede ekspressionen af ​​mesenchymale cellemarkører (N-cadherin og vimentin) og inhiberede ekspression af epitelcelle markør (E-cadherin) i HGC-27 celler (figur 3D). MRNA-niveauerne af VEGF, MMP9 og TGF-β blev også forøget i HGC-27-celler efter behandling med supernatanten fra makrofager-aktiverede MSC’er (Figur 3E). I betragtning af at kræftcellen stemness stærkt knyttet til deres migration, opdaget vi udtryk for stemness gener i HGC-27 celler. Udtrykket af Oct4 og Sox2 var især opreguleret af supernatanten fra makrofager-aktiverede MSC’er (Figur 3F). I overensstemmelse med det realtids-PCR resultater blev proteinniveauer af Oct4 og Sox2 også steget i HGC-27 celler ved supernatanten fra makrofager-aktiverede MSC’er (Figur 3G). Kort fortalt antyder disse resultater, at makrofager-aktiverede MSC’er også fremmet gastrisk cancer cellevækst, migrering gennem induktionen af ​​EMT og celle stemness under inflammatorisk tilstand.

(A) Repræsentative billeder af celle kolonidannelse assayet og histogram af koloni nummer. Data blev opført som middelværdi ± SD af tre brønde. *

P

0,05. (B) Western blot assays for PCNA og VEGF proteinniveauer. (C) Repræsentative billeder af transwell migration assay og histogram af antallet af migrerede HGC-27-celler. Forstørrelse, × 100; skala bar = 50 um. ***

P

0,001, **

P

0,01. (D) Western blot assays for E-cadherin, N-cadherin og vimentin proteinniveauer. (E) Real-time PCR-analyser af VEGF, MMP9 og TGF-β-mRNA-ekspression. ***

P

0,001, *

P

0,05. (F) Western blot-assay for Oct4 og Sox2 proteinniveauer i HGC-27-celler. (G) Real-time PCR-analyser af Oct4 og Sox2 mRNA-ekspression. **

P

0,01, *

P

. 0,05

makrofager-aktiverede MSC’er Fremmes Gastric Cell Proliferation og migration Gennem NF-KB Pathway

for at udforske den mekanisme er ansvarlig for at fremme rolle makrofager-aktiverede MSC’er i celledeling og migration, vi bestemt udtryk for flere vigtige signalsystemer transducere til betændelse og kræft, herunder STAT3, ERK og NF-KB, i gastriske epitelceller og gastriske cancerceller. Resultaterne af Western blot analyserne viste, at niveauerne af p-STAT3, p-ERK og p-NF-KB var signifikant højere i GES-1 celler behandlet med supernatanterne fra aktiverede MSC’er end i andre grupper. Proteinet niveau af NF-KB havde ingen ændring medens den af ​​ERK og STAT3 faldt lidt (figur 4A). Stigningerne i p-STAT3, p-ERK og p-NF-KB proteinniveauer blev også observeret i HGC-27-celler efter behandling med supernatanterne fra de aktiverede MSC’er (Figur 4B). Vi bekræftede opreguleringen af ​​p-STAT3, p-ERK og p-NF-KB-proteinniveauer ved supernatanterne fra de aktiverede MSC’er i en anden gastrisk cancercellelinie SGC7901 (figur S2). For at bestemme om de nedstrøms målgener også aktiveredes i HGC-27 celler undersøgte vi ekspressionen af ​​cyclin D1, C-myc og c-Jun-proteiner. Som vist i figur 4C, blev protein-niveauer af cyclin D1 og c-Jun forhøjet efter behandling med supernatanterne fra de aktiverede MSC’er.

(A) GES-1 og (B) HGC-27-celler behandlet med supernatanterne til aktiverede MSC’er. Ekspressionen af ​​p-STAT3, STAT3, p-ERK, ERK, p-NF-KB, og NF-KB-proteiner blev bestemt ved hjælp af Western-blot. (C) Western blot assays for cyclin D1, C-myc, og c-Jun-proteinniveauer i HGC-27-celler. (D) Western blot assays for p-NF-KB og NF-KB-proteinniveauer i HGC-27 celler, som var behandlet med supernatanterne fra de aktiverede MSC’er i nærvær eller fravær af PDTC (100 nM). Antallet af cellekolonier (E) og migrerede celler (F) for HGC-27 celler behandlet med forskellige MSC supernatanter i nærvær eller fravær af PDTC (100 nM). (G) Real-time PCR-analyser af VEGF, MMP9, og TGF-β-mRNA-ekspression i HGC-27 celler behandlet med forskellige MSC supernatanter i nærvær eller fravær af PDTC (100 nM). **

P

0,01, *

P

. 0,05

For at fremtiden bestemme, om NF-KB spiller en stor rolle i de funktioner, aktiveres MSC’er, HGC-27-celler blev forbehandlet med PDTC at inhibere NF-KB-phosphorylering og derefter inkuberet med supernatanterne fra de aktiverede MSC’er. Vi fandt, at induktionen af ​​NF-KB-phosphorylering af aktiverede MSC’er i HGC-27-celler blev markant inhiberet af PDTC (figur 4D). Resultaterne af celle kolonidannelse og transwell migration assays viste, at den forbedrede proliferation og migrering af HGC-27 celler ved de aktiverede MSC’er blev væsentligt reduceret i PDTC-behandlede grupper (figur 4E og 4F). Endvidere PDTC behandling inhiberede også opregulering af VEGF, MMP9 og TGF-β af aktiverede MSC’er i HGC-27 celler (figur 4G). Tilsammen indikerer disse resultater, at de aktiverede MSC prompt gastrisk epitel celle og mavekræft celleproliferation og migration gennem NF-KB.

makrofager-aktiverede MSC’er Fremmes Gastric Cancer Growth in vivo

I betragtning af den dokumentation for, at makrofager-aktiverede MSC’er kunne øge gastrisk celledeling

in vitro

, vi spekulerede på, om disse MSC’erne udøvede fremme rolle i gastrisk kræft vækst

in vivo

. Således samarbejder vi injicerede HGC-27 celler med de aktiverede MSC i nøgne mus. Tyve dage senere blev tumorvæv fjernet, målt og vejet. Som vist i figur 5A og 5B, de xenotransplantattumorer i aktiverede MSC’er co-injicerede gruppe var større end i andre grupper. Immunohistokemiske analyser blev udført for at bestemme ekspressionen af ​​vækstrelaterede proteiner og pro-angiogene faktorer i tumorvæv. Den stærkere positiv farvning af PCNA og VEGF blev observeret i aktiveret MSC’er co-injicerede gruppe (figur 5C). Real-time PCR-analyser blev udført for at detektere ekspressionen af ​​VEGF, MMP9 og TGF-β i tumorvæv. Vi fandt, at ekspressionen af ​​alle disse gener i co-injicerede grupper var højere end i HGC-27-celler alene gruppen (figur 5D). Resultaterne af real-time PCR analyser viste, at mRNA-niveauer af Oct4, Sox2 og Sall4 var den højeste i aktiveret MSC’er co-injicerede gruppe (figur 5E). Sammenfattende disse data indikerer, at makrofager-aktiverede MSC prompt vækst mavekræft

in vivo

.

(A) Repræsentative billeder af xenograft tumorvæv og (B) mængden og vægten af ​​tumor væv udtages fra mus injiceret med HGC-27-celler alene eller sammen med MSC’er. (C) immunhistokemisk analyse af PCNA og VEGF proteinniveauer i tumorvæv. Forstørrelse, × 200; skala bar = 50 um. (D) Real-time PCR-analyser af VEGF, MMP9, og TGF-β-mRNA-ekspression i tumorvæv. ***

P

0,001, **

P

0,01, *

P

0,05. (E) Real-time PCR-analyser af Oct4, Sox2, og Sall4 mRNA-ekspression i tumorvæv. ***

P Salg 0,001, **

P

0,01, *

P

. 0,05

Primære Monocytter Aktiverede MSC’er til Spørg gastric cancer Cell proliferation og migration Gennem NF-KB

for yderligere at bekræfte aktiveringen af ​​MSC’er af makrofager til at bede mavekræft proliferation og migration, vi isolerede monocytter fra humant perifert blod og indsamlet supernatanten fra monocytter opdelte makrofager. Efter inkubering med supernatanten fra monocytter opdelte makrofager blev MSC’er høstet, og totalt RNA blev ekstraheret for real-time PCR-analyser. Som vist i figur 6B, behandling med supernatanten fra monocytter opdelte makrofager opreguleres mRNA-niveauer af IL-6, IL-8, MCP-1 og VEGF i MSC’er. Vi derefter inkuberet gastriske cancerceller med supernatanten fra de aktiverede MSC’er. Resultaterne af celle kolonidannelse og transwell migration assays viste, at supernatanten fra de aktiverede MSC’er forøge proliferation og migrering af HGC-27-celler (figur 6C og 6D). Vi demonstrerede yderligere, at inkubation med supernatanter fra de aktiverede MSC’er forøgede ekspressionen af ​​p-STAT3, p-ERK og p-NF-KB i HGC-27 celler (figur 6E). Tilsammen tyder disse data, at humane primære makrofager i overensstemmelse med THP-1 celler, aktiveres også MSC for at bede mavekræft proliferation og migration gennem NF-KB.

(A) Real-time PCR-analyser af IL-6, IL-8, MCP-1, og VEGF-mRNA-ekspression i MSC’er. ***

P

0,001, **

P

0,01, *

P

0,05. (B) Repræsentative billeder af cellekolonier og histogram af koloni nummer. Data blev opført som middelværdi ± SD af tre brønde. **

P

0,01, *

P

0,05. (C) Repræsentative billeder af transwell migration assay og histogram af antallet af migrerede HGC-27-celler. Forstørrelse, × 100; skala bar = 50 um. **

P

0,01. (D) Western blot analyser for p-STAT3, STAT3, p-ERK, ERK, p-NF-KB, og NF-KB-protein niveauer i HGC-27 celler.

Diskussion

i løbet af de seneste årtier, har linket til betændelse til kræft tiltrukket en masse opmærksomhed [5], [6]. Langvarig eksponering af epitelceller til inflammatorisk mikromiljø fører til malign transformation [9], [19]. Stromacellerne er blevet vist at være kritisk involveret i progressionen fra betændelse til kræft ved at modulere den inflammatoriske mikromiljø [7], [8]. Makrofager og MSC’er er to vigtigste bestanddele af tumor stroma og deltage i regulering af omfanget af inflammatorisk reaktion under carcinogenese [16]. Men samspillet mellem makrofager og MSC i mavekræft er ikke godt karakteriseret.

mavekræft er udviklet sig fra langvarig kronisk gastritis og er en klassisk model af inflammation-relaterede kræft. Vi har tidligere isoleret hjemmehørende MSC fra humane mavekræft væv og viste, at gastrisk kræft væv MSC’er udskilles masser af inflammatoriske cytokiner og fremmes mavekræft progression. Under processen med inflammation, monocytter /makrofager kunne blive ansat til at udstyre MSC med tumorfremmende funktioner [16]. Desuden

Helicobacter pylori

fremkalde kronisk inflammation i mavens epitelceller gennem frigivelse af LPS i sin cellevægge. I denne undersøgelse vi pre-behandlede MSC’er med makrofager i nærvær af LPS for at efterligne mavekræft mikromiljø og at afgøre, om makrofager-aktiverede MSC’er bidrager til gastrisk cancer progression. Vi påviste, at MSC’er inkuberet med makrofager og LPS udskilte højere niveauer af inflammatoriske cytokiner. En nylig undersøgelse rapporteret, at kontinuerlig stimulering med makrofag Konditioneret medium inducerede MSC’er til at erhverve en pro-inflammatorisk fænotype [17]. I overensstemmelse med deres undersøgelse, fandt vi, at kort tid inkubation med makrofager aktiveres også MSC til at producere højere niveau af inflammatoriske cytokiner.

Epithelial-mesenchymale-overgang (EMT) er en væsentlig proces i løbet af kræft metastaser [20]. I årenes løb har omprogrammering egenskaber relateret til EMT blevet tilskrevet fremme cellulær plasticitet i cancerceller. Cancer stamceller er blevet introduceret og vist sig at bidrage til tumorigenese og tumormetastase [21] – [24]. Nylige undersøgelser tyder på, at en underpopulation af stilk-lignende og mesenchymal-lignende celler viste en større tumorgenicitet i gastriske epitelceller

in vitro og in vivo

[25]. I denne undersøgelse fandt vi, at aktiverede MSC’er, der var samdyrket med makrofager i nærvær af LPS, bemærkelsesværdigt kunne øge migrationen af ​​gastriske epitelceller samt gastriske cancerceller.