PLoS ONE: SCD1 Hæmning Årsager Cancer Cell Død ved at nedbryde Mono-umættede fedtsyrer

Abstrakt

Øget stofskifte er et krav for tumorcelleproliferation. For at forstå afhængighed af tumorceller på fedtsyrestofskiftet vurderede vi forskellige knudepunkter af fedtsyren syntesevejen. Brug af RNAi vi har vist, at udtømning af fedtsyrer syntese vej-enzymer SCD1, FASN eller ACC1 i HCT116 colon cancer celler resulterer i cytotoksicitet, der er reversibel ved tilsætning af exogene fedtsyrer. Denne betingede fænotype er mest udtalt, når SCD1 er opbrugt. Vi anvendte denne fedtsyrer redning strategi til at karakterisere adskillige små molekyler inhibitorer af fedtsyresyntese, herunder identifikation af TOFA som en potent inhibitor SCD1, altså en ikke tidligere beskrevet aktivitet for denne forbindelse. Henvisning FASN og ACC-hæmmere viser cytotoksicitet, der er mindre udtalt end TOFA, og fede-syre-rednings-profiler i overensstemmelse med deres foreslåede enzymmål. To henvisning SCD1 hæmmere viser lav nanomolær cytotoksicitet, der modsvares af mindst to størrelsesordener ved eksogen oleat. En af disse inhibitorer forsinker væksten af ​​HCT116 xenotransplantattumorer. Vores data skitsere en effektiv strategi til forhør af on-mekanisme styrke og sti-node-specificitet fedtsyresynteseinhibitorer, etablere en entydig sammenhæng mellem fedtsyre syntese og kræft celle overlevelse, og peger mod SCD1 som et vigtigt target i denne vej.

Henvisning: Mason P, Liang B, Li L, Fremgen T, Murphy E, Quinn A, et al. (2012) SCD1 Hæmning Årsager Kræft celledød ved Depleting Mono-umættede fedtsyrer. PLoS ONE 7 (3): e33823. doi: 10,1371 /journal.pone.0033823

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA

Modtaget: 13. oktober 2011; Accepteret: 17 februar 2012; Udgivet: 22 Mar 2012

Copyright: © 2012 Mason et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. forfatterne er medarbejdere i Genzyme Corporation. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

fedtsyrer indhold af celler i kroppen stammer fra kosten og fra

de novo

syntese. Hurtigt-prolifererende cancerceller ofte har en robust program af fedtsyresyntese ledsaget af høj-niveau ekspression af associerede gener, såsom fedtsyrer syntase [1]. På grund af sin relative forekomst i cancerceller, har fedtsyrer syntase blevet forfulgt som et onkologisk target [2]. Det er dog uklart, om fedtsyrer syntase betegner det hastighedsbegrænsende komponent i fedtsyrer syntesevejen.

Langkædede fedtsyrer er kritiske for hurtig kravet membran syntese i kraftigt voksende celler og leg nøgleroller i forskellige signalsystemer ordninger [3]. Derudover en passende balance af kæde- længder og mætningsgrad er kritisk for opretholdelse af membranfluiditet og krumning [4]. Det er blevet rapporteret, at inhibering af forskellige trin i fedtsyrer syntesevejen forårsager hæmning af cancercellevækst, enten på grund af mangel på downstream fedtsyrer

per se

, eller på grund af ophobning af toksiske pathway såsom malonyl-CoA eller begge [5].

Ved hjælp af en kombination af siRNA og småmolekylære inhibitorer, kombineret med en “fedtsyre komplementering” strategi, har vi identificeret stearoyl-CoA desaturase 1 som et enzym i den fede syre syntesevejen, der er afgørende for kræft cellelevedygtighed. Den “komplementering” strategi tillod karakterisering af både SCD1 samt specificiteten af ​​forskellige fede-syre-syntese-hæmmere, og præciserer den mekanisme, som SCD1 hæmning begrænser kræft celleproliferation. Vores data skitsere en entydig sammenhæng mellem fedtsyre syntese og kræft celle overlevelse.

Resultater

Kræftceller er følsomme over for tab af SCD1 funktion

For at undersøge effekten af ​​afbrydelse af fedtsyresyntese på kræft cellelevedygtighed, vi anvendte siRNA pools at nedbryder tre knudepunkter i reaktionsvejen for syntese af langkædede fedtsyrer (figur 1A). Som vist i figur 1B, udtømning af acetyl-CoA carboxylase (ACC1), fedtsyresyntase (FASN), eller stearoyl-CoA desaturase (SCD1) resulterer i nedsat levedygtighed (eller cellulær metabolisme) (målt ved cellulære ATP-niveauer under anvendelse af celle- titer Glo) i HCT116 kolon kræftceller, med 30%, 30% og 70% henholdsvis versus en ikke-targeting siRNA kontrol, der blev udpeget som 100% levedygtighed i hvert tilfælde blev mRNA knockdown bestemt af real-time RT -PCR til at være ca. 80% (ikke vist). Vi ræsonnerede, at hvis denne cytotoksicitet er virkelig gen-bundet og on target, og hvis afbrydelse af fedtsyresyntese pathway resulterer i reduceret cellelevedygtighed på grund af en mangel i downstream fedtsyrer i modsætning til opbygning af giftige pathway, derefter cytotoksicitet forårsaget ved udtømning af forskellige pathway knudepunkter bør være rescuable eller forebygges ved tilsætning af exogene fedtsyrer nedstrøms for det pågældende knudepunkt. Som vist i figur 1B, ACC1 udtømning og FASN udtømning er rescuable af palmitat, stearat og oleat, som alle er nedstrøms for både ACC1 og FASN. SCD1 udtynding er ikke rescuable af palmitat eller stearat (som er opstrøms for SCD1), men SCD1 udtømning væsentligt reddet af oleat (som er nedstrøms for SCD1). Reduceret cellelevedygtighed forårsaget af udtømning af to essentielle gener af uafhængige mekanisme, er PSMD14 og RNA-polymerase II (Pol II) ikke reddes af nogen af ​​fedtsyren behandlinger. Dette tyder på, at nedsat cellelevedygtighed forårsaget af behandling med disse siRNA’er er virkelig skyldes udtømning af målgenet, og at det er forårsaget af en mangel på syntese af fedtsyrer, i modsætning til en opbygning af toksiske pathway i den normale dyrkningsbetingelser .

En

de novo

syntese af monoumættede fedtsyrer. B HCT116 colon cancerceller (ATCC) dyrket i RPMI-1640 (Cambrex) indeholdende 2% FBS udpladet ved en densitet på 4000 celler per brønd i 100 ul medium i plader med 96 brønde blev transficeret med siRNA pools (Dharmacon, 50 nM) målretning tre fedtsyrer-syntesevejen knudepunkter, eller to ubeslægtede overlevelse gener, ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 16 timer efter transfektion blev celler behandlet med 25 uM fedtsyrer (Sigma, 100 × lagre opløst i 10% MeOH /0,9% BSA /PBS) som angivet, og levedygtighed blev bestemt 72 timer efter transfektion (Cell Titer Glo, Promega). Resultater udtrykkes som procent levedygtighed versus celler transficeret med en ikke-targeting kontrol siRNA (betegnet 100% levedygtighed) behandlet med den samme fedtsyre. C DU145 prostatacancerceller, HCT116 colon cancerceller og MIA PaCa2 bugspytkirtelkræftceller (ATCC) dyrket i RPMI-1640 indeholdende 2% FBS blev behandlet med enkelte siRNA’er målretning SCD1 eller PSMD14 (Dharmacon, 25 nM), efterfulgt 16 timer senere af behandling med oleat som angivet. Levedygtighed blev bestemt 72 timer efter transfektion. Resultater udtrykkes som procent levedygtighed versus celler transficeret med en ikke-targeting kontrol siRNA (betegnet 100% levedygtighed) behandlet med den samme fedtsyre. D HCT116 colon cancerceller udpladet ved en densitet på 1000 celler per brønd i 25 ul medier i 384-brønds plader blev behandlet med små molekyler inhibitorer af ACC1 (CP640186, Pfizer), FASN (# 10v, Merck), eller SCD1 (# 7N, Abbott), i medier indeholdende fedtsyrer som angivet, 72 timer før sundt bestemmelse. Inibitors blev syntetiseret ved Genzyme (Waltham, MA).

For at undersøge omfanget af SCD1 involvering i kræft celle overlevelse blev flere cancer cellelinjer udsat for SCD1 eller PSMD14 RNAi behandling, i begge tilfælde ved hjælp af en enkelt siRNA. Levedygtighed DU145 prostatacancerceller, HCT116 colon cancerceller og MIA PaCa2 bugspytkirtelkræftceller reduceres (i forhold til en ikke-targeting kontrol siRNA) ved udtømning af begge gener som vist i figur 1C. I alle tilfælde, SCD1-udtømning cytotoksicitet er rescuable ved tilskud af medierne med oleat, mens der i alle tilfælde PSMD14 udtynding er ikke. Dette antyder, at en række forskellige cancerceller afhænger

syntese af monoumættede fedtsyrer

for cellelevedygtighed, og at SCD1 er en kritisk node i reaktionsvejen, der kan være en egnet terapeutisk mål.

den fedtsyresyntese pathway er blevet undersøgt i forbindelse med både metabolisk sygdom [6] og cancer [7]. Derfor en række fede-syre-synteseinhibitorer er tilgængelige. Vi satte os for at bruge fedtsyrer redning strategi med flere sådanne forbindelser, som et middel til både at teste den hypotese, at fedtsyresyntese, og SCD1 aktivitet i særdeleshed, er nødvendige for kræft cellelevedygtighed, og også med det mål at bedre forståelse de online- og offline-mekanisme aktiviteter fedtsyrer syntese inhibitorer selv. Som vist i figur 1D, reference- hæmmere til ACC1 (Pfizer # CP640186 [8]), FASN (Merck # 10v [9]), og SCD1 (Abbott # 7n [10]) alle display cytotoksicitet og redning profiler overensstemmelse med vejen position af målet. Toksicitet grund ACC1 og FASN hæmning er reddet af palmitat, stearat, og oleat, mens toksicitet på grund af SCD1 hæmning er reddet kun af oleat. Det er også bemærkelsesværdigt, at styrken af ​​disse inhibitorer afspejler observationen med siRNA. På trods af at reference- inhibitorer er af sammenlignelig styrke i biokemiske assays på deres respektive mål, ACC1 og FASN inhibering give en beskeden reduktion levedygtighed, mens fænotypen med SCD1 inhibering er mere udtalt, hvilket tyder på SCD1 er en særlig værdifuld, måske sats- begrænsende node i denne pathway. Disse observationer tyder også på, at reference- inhibitorer er fri for dominerende (ikke-rescuable) off-mekanisme toksicitet i denne celle system. De mættede langkædede fedtsyrer, der anvendes i redning scenario selv producere en beskeden reduktion levedygtighed ved de anvendte koncentrationer. Det er bemærkelsesværdigt, at disse mættede fedtsyrer er synergistiske med SCD1 inhibitoren (Figur 1D). Dette antyder, at mens størstedelen af ​​levedygtigheden virkning ses ved SCD1 inhibering skyldes nedbrydning af mono-umættede fedtsyrer, SCD1 inhibering reducerer også cellers evne til at afbøde virkningerne af unaturlige, exogene mættede fedtsyrer, antagelig ved “afgiftning” at oleat eller palmitoleat.

inhibitoraktivitet klaring ved komplementering

Vi testede tre kommercielle udbredte historiske inhibitorer af fedtsyrer syntesevejen ved hjælp af “fedtsyre redde” strategi. Cerulenin og C75 er FASN hæmmere [11], [12], og TOFA er en ACC1 hæmmer [13]. Som vist i figur 2A, cerulenin og C75 både inhiberer HCT116 coloncancer cellelevedygtighed som forventet. Men ingen af ​​disse inhibitorer reagerer på palmitat, stearat, eller oleat, hvilket antyder, at begge disse inhibitorer har dominerende, ikke-mekanisme-baserede cytotoksicitet i dette cellesystem, og at reduktion af cellelevedygtighed drevet af disse forbindelser er ikke relateret til hæmning af fedtsyresyntese. Salg

En HCT116 coloncancer-celler blev behandlet med små molekyler FASN inhibitorer C75 og Cerulenin (Sigma), eller ACC inhibitoren TOFA (Sigma), i medier indeholdende fedtsyrer som indikeret, 72 timer før sundt beslutsomhed. B HCT116-celler blev behandlet med oleat på forskellige tidspunkter i forhold til tidspunktet for TOFA tilsætning. Cellelevedygtighed blev bestemt 72 timer efter TOFA behandling. C HCT116-celler blev behandlet med forbindelser i medier, der mangler eller indeholder oleat, efterfulgt af levedygtigheden bestemmelse efter 72 timer. D HCT116 tyktarmskræft celler dyrket ved en densitet på 1 x 10

6 celler pr 1 ml medium per brønd i 12-brønds plader blev forbehandlet med TOFA i en time, efterfulgt af 13C-palmitat eller 13C-stearat eller 13C acetat (Sigma) behandling i fire timer. Mærkede fedtsyrer og estere blev ekstraheret, forsæbes, og analyseret ved LC /MS /MS under anvendelse af enten en API 5000 eller API 4000 tripel kvadrupol massespektrometer (AB Sciex, Forster City, CA) bindestreg med en Agilent 1100 HPLC-system (Agilent, Santa Claire, CA). LC separation blev opnået under anvendelse Xbridge phenyl 2,1 × 100 mm søjle (Waters, Milford, MA). Mobil fase A bestod af 5 mM ammoniumformiat i deioniseret vand. Mobil fase B bestod af 5 mM ammoniumformiat i methanol. Den prøvepåsætningsbuffer bestod af 30% puffer A og 70% puffer B. En lineær gradient blev anvendt til separation (70% til 100% B i 5 min). Prøver blev ioniseret ved ESI i negativ ion-mode og opholdstiden for MRM var 75 ms.

I dette assay TOFA toksicitet reddes effektivt af oleat, men ikke af palmitat eller stearat (figur 2A), i modsætning til forventningen til en specifik hæmmer af ACC1. Dette mønster af fedtsyrer redning er i overensstemmelse med TOFA hæmning af SCD1. Alternativt kunne TOFA-drevet cytotoksicitet være helt off-target (unrescuable af palmitat eller stearat), og TOFA kunne i princippet fysisk interagerer med oleat i dyrkningsmediet, således at oleat blot forhindrer TOFA i at komme ind i cellerne. For at teste denne mulighed, vi tilføjet oleat på forskellige tidspunkter i forhold til tidspunktet for TOFA Desuden, og målte levedygtighed i alle tilfælde ved 72 timer efter TOFA behandling. Som vist i figur 2B, oleat tilsætning op til 8 timer efter TOFA tilsætning giver en grad af “redning”, der ikke kan skelnes fra det tilfælde, hvor der tilsættes oleat før TOFA tilsætning. I dette tilfælde TOFA har timer at gennemtrænge cellen og hæmmer målet, før indføring af oleat. Dette er i modstrid med oleat simpelthen forhindrer TOFA i at komme ind i cellerne. Når oleat tilsættes 24 timer efter TOFA Desuden er fænotypen vending signifikant kompromitteret. Derfor mellem 8 og 24 timer efter TOFA behandling, cellerne går forbi et “point of no return”, og bliver ikke reagerer på oleat når analyseret for levedygtige 72 timer.

Derudover vi mente, at oleat kan være en promiskuøse “cytotoksicitet-rescue-agent.” for at teste denne mulighed, testede vi en bred vifte af cytotoksiske forbindelser i oleat-redning assay. Som vist i figur 2C af en række forskellige inhibitorer af forskellige testede mekanismer (herunder C75 og cerulenin), kun TOFA-drevet cytotoksicitet er rescuable ved oleat. Dette er i modstrid med oleat fungerer som en generel “rednings-agent.”

For at teste hypotesen, at TOFA “fedtsyre redning profil” virkelig afspejler TOFA hæmning af SCD1, vi overvåget konvertering af stabile-isotop-mærket fedtsyrer ved LC /MS /MS for fedtsyrer flux i fravær eller nærvær af TOFA. Vi undersøgte SCD1-medierede desaturering af 13C-palmitat eller 13C-stearat til palmitoleat eller oleat, henholdsvis og forlængelsen af ​​13C-palmitat at stearat efter 1 times TOFA eksponering. Derudover, for at måle ACC1 inhibering, monitorerede vi 13C-acetat inkorporering i palmitat. Som vist i figur 2D, TOFA inhiberer både SCD1-medieret desaturation begivenheder på en styrke sammenlignelig med dets celle-levedygtighed EC50, og sammenlignes med dets styrke på ACC1. Omvendt er væsentligt højere niveauer af TOFA forpligtet til at bevirke (ikke-SCD1-drevet) forlængelse af palmitat at stearat. Derfor, baseret på fedtsyrer redning profil og direkte måling af SCD1 inhibering i levende celler, TOFA inhiberer SCD1, som er et ikke tidligere beskrevet aktivitet for TOFA.

I tilfælde af både TOFA og SCD1 inhibitor # 7N (figurerne 1D og 2A), exogent palmitat forøger virkningen af ​​SCD1 inhibering. Ud over det faktum, at i dette assay indstilling palmitat viser nogle iboende cellelevedygtighed inhibering, palmitat også venstre-skift EC50 for TOFA og # 7n, hvilket antyder, at kombinationen af ​​unaturligt forhøjet palmitat, og den manglende evne til at bearbejde den i oleat, forøger levedygtigheden inhibering af kræftceller.

Kræft cellelevedygtighed hæmning spor med inhibitor potens og SCD1 repræsenterer det eneste afgørende desaturering rute

for at teste troskab og korrelation af vores fedtsyrer-redning levedygtighed undersøgelser og den cellulære SCD1-hæmning LC /MS /MS-analysen, vi undersøgte tre SCD1 inhibitor molekyler: TOFA, Abbott # 7N, og Abbott # 28c [14]. Som vist i figur 3A, # 7n er flere gange mere potent end TOFA, og mere oleat-rescuable, i celle- levedygtighed assay og tilsvarende er mere potent end TOFA i direkte cellulære SCD1 inhiberingsassay. Tilsvarende # 28c er væsentligt mere potent end # 7n i direkte cellulære SCD1 inhiberingsassay, og også i celleviabilitetstest, mens fuldstændig bevarer oleat-rescuability.

A HCT116-celler blev behandlet og analyseret for celleviabilitet eller cellulær SCD1 inhibering (LC /MS /MS) som beskrevet ovenfor. B HCT116 blev behandlet med DMSO eller SCD1 inhibitor # 28c i nærvær af forskellige fedtsyrer (25 uM) (Biomol, # 2803) i 72 timer, og analyseret for celleviabilitet. Data er vist som et zonekort kontinuum fra grønne (levende celler) til rød (døde celler). C HCT116-celler blev behandlet i 36 timer med forskellige doser af SCD1 inhibitorer som angivet. Celler blev lyseret i LDS loading dye (Invitrogen) og analyseret ved western blotting for PARP-spaltning (Cell Signaling). Staurosporin, et bredspektret kinase inhibitor, blev inkluderet som en positiv kontrol for PARP-spaltning. D HCT116-celler blev behandlet som i C, i nærvær eller fravær af exogent oleat, efterfulgt af analyse af PARP-spaltning.

Vi fandt, at andre umættethed begivenheder kan være til rådighed til at understøtte levedygtigheden cancercelle, via desaturaser andet end SCD1, hvis celler er givet tilstrækkelig forsyning af mættet substrat. For at udforske denne mulighed, og til yderligere at karakterisere specificiteten af ​​# 28c SCD1 inhibitor undersøgte vi et panel af fedtsyrer af varierende kædelængder og mætning tilstande for deres evne til at “komplementere” (forhindrer virkningen af) SCD1-inhibitor- medieret reduktion levedygtighed. Som vist i figur 3B, mens ikke alle umættede fedtsyrer suppleret, havde alle “supplerer” fedtsyrer indeholder mindst en umættet binding. På den anden side, alle mættede fedtsyrer undladt at supplere, hvilket antyder, at umættethed absolut er nødvendig for komplementering, og at alternative desaturase aktiviteter ikke kan anvendes.

Vi undersøgte TOFA, # 7n, og # 28c til induktion af apoptose kaskade. HCT116-celler blev behandlet med forbindelse doser svarende til eller ti-fold ovenfor, deres cytotoxocity IC50. Som vist i figur 3C, alle tre fedt-syre synteseinhibitorer inducere PARP-spaltning på en dosis-afhængig måde, hvilket antyder, at afbrydelse af fedtsyrer syntese i disse celler forårsager apoptose. Induktionen af ​​PARP-spaltning korrelerer med celledød ved, at den er reversibel med eksogent oleat (figur 3D). PARP spaltning er en markør for apoptose [15].

SCD1 hæmning forsinker tumorvækst og er ikke universelt giftigt

Virkningen af ​​SCD1 udtømning på flere kræftceller rejser muligheden for, at SCD1 hæmning vil være universelt toksisk. Vi testede ovariecancer cellelinien SKOV3 for følsomhed for en reference SCD1 inhibitor. Som vist i figur 4A, har SCD1 inhibitor begrænset indvirkning på SKOV3 cellelevedygtighed, versus HCT116, trods sammenlignelig inhibitorisk virkning på cellulær omdannelse af stearat til oleat (SCD1 aktivitet). Vi mente, at SKOV3 kan være generelt ufølsomme over for forskellige giftige stoffer. Som vist i figur 4B, SKOV3 og HCT116 er sammenligneligt følsomme over for en bred vifte af mekanisk-distinkte toksiske forbindelser, såsom dimethylsphingosine og daunorubicin, hvorimod i tilfældet med SCD1 inhibitorer, SKOV3 er ganske ufølsom forhold til HCT116. Dette antyder, at SKOV3 har nogle specifikke ufølsomhed over for fedtsyrer-syntese hæmning, og at SCD1 inhibering vil ikke være universelt toksisk.

A HCT116 eller SKOV3-celler blev behandlet og analyseret for levedygtighed celle eller cellulær SCD1 inhibering (LC /MS /MS) som beskrevet ovenfor. B HCT116 eller SKOV3-celler blev behandlet og analyseret for celleviabilitet. Tabel udtrykker forholdet mellem SKOV3 EC50 versus HCT116 EC50. C, D Nøgne mus, der huser passage fem 200 mm3 HCT116 tumorer (passeret som trokar-fragmenter) (n = 10 pr gruppe) blev doseret ved oral sondeernæring to gange dagligt med 160 mg /kg # 28c i 20 dage eller med intravenøs CPT11 på tre på hinanden følgende dage starter, når tumorer nåede 200 mm3. Tumorvækst (C) og kropsvægt (D) blev overvåget og afbildet som gennemsnit +/- standardafvigelse.

SCD1 inhibitor # 28c blev for nylig beskrevet af Abbott [14] som en potent, orally- tilgængelig SCD1 hæmmer med favorable farmakokinetiske egenskaber. Derfor er dette molekyle giver et værktøj til

in vivo

SCD1 målvalidering for kræft. Vi behandlede mus med 200 mm3 HCT116 tumorer to gange dagligt med # 28c ved oral sondeernæring (versus IV CPT11 på en optimeret doseringsregime) i 20 dage og overvåges tumorvækst og legemsvægt. Som i figur 4C, viste # 28c moderat vækst forsinkelse på HCT116 tumorer. Mens SCD1 inhibitoren gjorde reducere oleat indhold af udskårne tumorer (ikke vist), væsentlig oleat forblev i tumorvævet, øge muligheden at kosten oleat kan være begrænsende for virkningsfuldhed af SCD1 inhibitor. Behandling med SCD1 inhibitoren blev ledsaget af vægttab nærmer 20%, eller reduktion fra 20 g til ca. 16 g, ved dosering dag 10 (undersøgelsesdag 26) (figur 4D), der blev udvundet efter ophør af dosering (undersøgelsesdag 36). Det er uklart, om dette vægttab er på mekanisme til denne inhibitor (som man kunne forvente fra en inhibitor af lipid syntese), eller relateret til SCD1 hæmning.

Diskussion

Kræftceller er forskellige fra ikke-maligne celler baseret dels på deres unikke metaboliske status, et element som er en usædvanlig krav for fedtsyre syntese [16]. fedtsyren syntesevejen har således været et attraktivt cancer-target i nogen tid, og primær opmærksomhed er fokuseret på fedtsyresyntase, som markerer det punkt i produktionen af ​​langkædede fedtsyrer [17]. Vore eksperimenter og andre [18] antyder imidlertid, at det hastighedsbestemmende trin i syntesen af ​​monoumættede fedtsyrer er ved punktet for de-mætning (ved SCD1), og at SCD1 repræsenterer en særlig sårbar knude i denne pathway. Brug både siRNA og reference- hæmmere, har vi vist, at tabet af SCD1 aktivitet udbytter udtalt levedygtighed hæmning af forskellige kræftceller

in vitro

. At dette levedygtighed inhibering er reversibel, når oleat tilsættes til cellekulturmediet hævder, at fænotypen er on-mekanisme, og henføres til en SCD1-inhibering-medieret oleat-mangel, i modsætning til opbygningen af ​​intracellulær palmitat eller anden opstrøms pathway komponenter. Vi foreslår, at dette fedtsyrer redning strategi er en enkel, bredt anvendelig mekanisme til karakterisering af fedtsyresyntese inhibitor specificitet, som det fremgår af vores karakterisering af SCD1 inhiberende aktivitet af TOFA.

HCT116 tumorvækst forsinkes ved behandling med en potent, oral-tilgængelig SCD1 henvisning inhibitor. Men forsinkelse tumorvækst er moderat, falder betydeligt mindre, der ses med CPT11, der tjente som en positiv kontrol. Det er bemærkelsesværdigt, dog, at en optimeret doseringsregime ikke blev etableret for SCD1 hæmmer. tumorvækstforhaling blev ledsaget af vægttab og nedsat legemsvægt blev opretholdt gennem hele forløbet af dosering. SCD1 blev oprindeligt undersøgt som et mål for stofskiftesygdomme, og det ville ikke være overraskende, hvis en del af den observerede vægttab skyldtes bred hæmning af

mono-umættede

fedtsyre syntese. Og mens SCD1 knockout mus er levedygtige [19], mus har flere SCD-isoformer, som kan være overflødig. Hvis toksicitet (vægttab) set i den aktuelle undersøgelse skyldes fedtsyresyntese inhibering, kan dette tilskrives den SCD1 inhibitor målretning multiple murine SCD isoformer. Dette blev ikke testet. Ikke desto mindre, i princippet ville differentiere inhibitor-drevne toksicitet profil fra genetiske SCD1 knockout. Alternativt kunne vægttab set være nettoeffekten af ​​SCD1-hæmning drevet reduceret fedme og øget energi udgifter, der kan sammenlignes med den, der ses i SCD1 knockout [19], [20].

Mono-umættede fedtsyrer syre modning og behandling, efter produktion af SCD1, er et komplekst netværk, der fører til et væld af forskellige kædelængder, mætning stater og subcellulære distributions- skæbner. Det kan være, at mens SCD1 betegner en endelig hastighedsbegrænsende “point-of-sammensnøring” i forløbet, en nedstrøms enzym target, langs en af ​​en række forskellige mono-umættede fedt-syre forarbejdning sub-pathways, kan repræsentere en node der er strengt nødvendigt for cancer cellelevedygtighed, og undværlige for normal cellefunktion. Det kan også være tilfældet, at SCD1 hæmning kunne være produktiv i en co-behandling scenario ved lave doser i forbindelse med en traditionel middel.

Materialer og metoder

Cell Culture

HCT116, DU145, og MIA PaCa2 cancerceller blev opnået fra ATCC og opretholdt i RPMI1640 (Cambrex) suppleret med Penn-strep (ATCC) og 5% FBS (Hyclone). For assays blev celler udpladet i RPMI1640 mangler Penn-strep og indeholdende 2% FBS ved en densitet på 4000 celler /100 ul /brønd i 96 brønds plader til siRNA behandling og levedygtighed, eller ved en densitet på 1000 celler /25 ul /brønd i plader med 384 brønde for forbindelse behandling og levedygtighed, eller en densitet på 1 x 10

6 celler /1 ml /brønd i 12-brønds plader til forbindelse behandling og LC /MS /MS-analyse af mærkede fedtsyrer flux . Alle celler blev dyrket som et monolag i 95% luft /5% CO

2, og en enkelt masse ikke-delipiderede FBS blev anvendt til alle eksperimenter

fedtsyrepræparatet

Fatty syrer (Sigma) blev opløst i methanol til en koncentration på 25 mM. 25 mM stamopløsninger blev derefter fortyndet ti gange i PBS (Cambrex) indeholdende 0,9% BSA (A9576, Sigma). Disse 2,5 mM (100X) lagerbeholdninger blev grundigt blandet og inkuberet i en 37 graders vandbad i en time før udportionering og frysning ved -20 grader. Fedtsyren panel fra Biomol (# 2803) blev opløst i DMSO.

LC /MS /MS Analysis

Alle eksperimenter blev udført ved anvendelse af en API 5000 eller API 4000 tripel kvadrupol massespektrometer ( AB /MDS Sciex, Concord, Canada) og en Agilent 1100 HPLC-pumpe (Agilent, Andover, MA). Søjler blev Xbridge phenyl 2,1 × 100 mm (Waters, Milford, MA). Buffer A var vand med 5 mM ammoniumformiat; buffer B var methanol 5 mM ammoniumformiat; og påsætningsbuffer var 30% puffer A plus 70% puffer B). En 5-minutters gradient (70% til 100% buffer B, lineær) blev anvendt med erhvervelse MRM cirka 75 msek ved hjælp negativ modus. Fedtsyresyntese bestemmelser blev udtrykt enten som produkt /(produkt + substrat) (i tilfælde af stearat, palmitoleat, og oleat syntese), eller som rå produkt normaliseret til umærket linolsyre (i tilfælde af palmitat syntese).

siRNA transfektion

on target-PLUS eller siGENOME lager siRNA’er (gen-specifik eller ikke-målretning af kontrollen) blev købt fra Dharmacon, og transficeret (50 nM (12,5 nM for hver af fire siRNAs) i sagen siRNA pools (Smartpools), eller 25 nM i tilfældet med enkelt siRNA’er anvendelse af Lipofectamine 2000. SCD1 enkelt siRNA sekvens var:. 5′-GAACAGUGCUGCCCACCUC-3 ‘The PSMD14 enkelt siRNA sekvens var: 5’-GGCAUUAAUUCAUGGACUA-3 ‘. Seksten timer efter transfektion 1/100

th volumen på 100 × BSA-kompleksbundet fedtsyre (palmitat, stearat, eller oleat) (100X = 2,5 mM) eller vehikel alene blev tilsat. Tooghalvfjerds timer efter transfektion, 25 ul Cell-titer Glo blev tilsat, og pladerne blev analyseret for cellelevedygtighed ifølge producenten (Promega) anbefaling. Alle analyser blev udført i to eller tre eksemplarer ved flere lejligheder med lignende resultater, og afbildes som middelværdi ± SD af en enkelt repræsentativt forsøg.

Små-molekyle-hæmmer behandling

C75, cerulenin og TOFA blev indkøbt fra Sigma. ACC-inhibitoren CP640186 (Pfizer), FASN inhibitor # 10v (Merck), og SCD1 inhibitorer # 7n og # 28c (Abbott) blev syntetiseret ved Genzyme (Waltham, MA). Forbindelser blev opløst i DMSO og opbevaret ved -20 grader. I tilfælde af både BSA-kompleksbundet fedtsyre (eller bærestof) og små molekyler inhibitorer (eller DMSO), midler blev for-fortyndet i assay dyrkningsmedium til 7 × slutkoncentration. 5 ul stykket af 7 × bestande af to passende midler blev sat til 25 ul medium, for 35 ul slutvolumen. 72 til 96 timer senere blev 7,3 ul Cell-titer Glo tilsat, og plader blev analyseret for celleviabilitet. Alle analyser blev udført i to eller tre eksemplarer ved flere lejligheder med lignende resultater, og afbildes som middelværdien ± SEM af et enkelt repræsentativt forsøg.

HCT116 xenotransplantat

Dyreforsøg (# GENZ100507- 20) blev udført efter godkendelsen af ​​Genzyme Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC). HCT116 tumorer blev passeret som trokar fragmenter i

nu /nu

mus. Dyr med passage fem tumorer blev behandlet med # 28c (160 mg /kg to gange daglig oral dosering i 20 dage) eller CPT11 (én gang daglig intravenøs dosering i tre på hinanden følgende dage), når tumorerne nåede 200 mm3.