PLoS ONE: Wnt5a udtrykkes kraftigt på forkant i ikke-melanom hudkræft, Danner Aktive Gradienter, mens Canonical Wnt Signalering er undertrykt

Abstrakte

Wnt5a er en af ​​de såkaldte ikke-kanoniske Wnt-ligander, som ikke virker gennem β-catenin. I normal udvikling, er Wnt5a udskilles og dirigerer migreringen af ​​target-celler langs koncentrationsgradienter. Virkningen af ​​Wnt5a på målceller reguleres af mange faktorer, herunder ekspressionsniveauet af inhibitorer og receptorer. Fejlreguleret Wnt5a signalering letter invasion af flere tumortyper i tilstødende væv. Imidlertid har ekspression og distribution af Wnt5a i kutant pladecellecarcinom (SCC) og basalcellecarcinom (BCC), samt virkningen af ​​Wnt5a på keratinocyt migration ikke undersøgt i detaljer til dato. Vi her anføre, at Wnt5a er opreguleret i SCC og BCC og lokaliseret til forkanten af ​​tumorer, samt tumorassocierede fibroblaster. Den Wnt5a-udløst bundtning af dets receptor Fzd3 dokumenterer Wnt5a koncentrationsgradienter rager ind i tumoren. In vitro migration assays viser, at Wnt5a koncentrationsgradienter bestemme dets virkning på keratinoctye migration: Mens kemotaktisk migration inhiberes af Wnt5a stede i homogene koncentrationer, er det forøget i nærvær af en Wnt5a gradient. Ekspression profilering af Wnt-vejen viser, at opregulering af Wnt5a i SCC er koblet til undertrykkelse af kanonisk Wnt signalering. Dette bekræftes af immunhistokemi viser mangel på nuklear β-catenin, samt fraværende akkumulering af Axin2. Da begge typer af Wnt signalering handle indbyrdes antogonistically på flere niveauer, samtidig undertrykkelse af kanoniske Wnt signalering antyder hyper-aktive Wnt5a signaltransduktion. Betydeligt, er denne kombination af gen dysregulering ikke observeret i den godartede hyperproliferativ inflammatorisk hudsygdom psoriasis. Tilsammen vores data antyder kraftigt, at Wnt5a signalering bidrager til vævsinvasion af ikke-melanom hudcancer

Henvisning:. Pourreyron C, Reilly L, Proby C, Panteleyev A, Fleming C, McLean K, et al. (2012) Wnt5a udtrykkes kraftigt på forkant i ikke-melanom hudkræft, Danner Aktive Gradienter, mens Canonical Wnt Signalering er undertrykt. PLoS ONE 7 (2): e31827. doi: 10,1371 /journal.pone.0031827

Redaktør: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, USA

Modtaget: 24 oktober, 2011; Accepteret: 12 januar 2012; Publiceret: 22 feb 2012

Copyright: © 2012 Pourreyron et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Cancer Research UK (C. Pourreyron, APS). C. Pourreyron blev finansieret af Debra International (dystrofisk epidermolysis bullosa Research Association) og Det Europæiske Forskningsråd (ERC) (APS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Vingeløse-type (Wnt) ligander er signalmolekyler vigtige i udviklingen. Wnt ligander er klassificeret som “canonical” eller “ikke-kanoniske” [1]. Canonical Wnts, eksemplificeret ved Wnt3a, binder til FZD-receptorer, samt LRP5 /6 co-receptorer, efterfulgt af ansættelse af en heteromert proteinkompleks herunder Dishevelled, Axin, og GSK3p til receptoren kompleks. Dette fører til phosphorylering af LRP5 /6, frigivelse og nuklear translokation af β-catenin, der kulminerede i induktion af målgener. Derimod ikke-kanoniske Wnts, herunder Wnt5a, binde FZD receptorer i forbindelse med alternative co-receptorer, herunder ROR1 /2 eller Ryk, forårsager β-catenin-uafhængige forandringer såsom PKC-aktivering og cytoskelet rearrangementer [2]. Vigtigere er det, ved at binde til fælles FZD receptorer, kanoniske og ikke-kanoniske Wnts act som kompetitive antagonister ved delte receptorer [3].

I udvikling, sekretion af alle Wnt-ligander, herunder Wnt5a er underlagt præcis tidsmæssig og rumlig kontrol hvorved opnås koncentrationsgradienter [4]. Disse gradienter direkte morfogenetisk bevægelse af target-celler samt arrangement af asymmetrisk polarisering af epitelceller [5]. Således Wnt5a væsentlige dirigerer migration af celler i det omgivende væv, for eksempel i udvikling af ekstremiteter. Et centralt element at bestemme virkningen af ​​Wnt på målceller er tilstedeværelsen af ​​secernerede hæmmende proteiner. Disse omfatter Dickkopf (Dkk) familie, der specifikt binder LRP5 /6, og dermed fungerer som specifikke inhibitorer af kanoniske Wnts. Andre inhibitorer omfatter Wif og de udskilte Frizzled beslægtede proteiner (SFRP), som binder begge typer Wnt-ligander samt FZD receptorer, for derved at inhibere både kanoniske og kanonisk Wnts [6]. Den geografiske fordeling af SFRP, FZD, Dkk, og Wnt er minutiøst orkestreret i udvikling (f.eks [7], effektivt skabe diffusion korridorer for Wnt aktivitet.

Ikke overraskende givet sin rolle som regulator af celle migration til tilstødende væv den uregulerede aktivering af Wnt5a er blevet forbundet med invasivitet og i adskillige tumortyper, herunder melanom [8], [9], brystcancer [10], gastrisk cancer [11], pancreascancer [12], og osteosarkom [13] . Wnt5a-relateret tumorinvasion kan også medieres af tumorassocierede celler. således brystcancerceller inducerer Wnt5a ekspression i tumorinfiltrerende makrofager, forårsager syntese af matrixmetalloproteinase (MMP) 7 [10].

Wnt5a kan binde flere frizzled receptorer, herunder Fzd2, Fzd5, Fzd3, Fzd4. af disse har vi tidligere vist, at Fzd5 og Fzd3 udtrykkes i forældrenes væv til både planocellulært karcinom (SCC), epidermis, og basalcellekræft (BCC ), hårsækken, henholdsvis [14]. Disse FZD receptor isoformer har også vist sig at mediere Wnt5a-induceret retningsbestemt motilitet i melanom [15], samt invasiv migration i brystcancer [16]. Vigtigere er det, Fzd3 er for nylig blevet vist at akkumulere i polariserede fokale aggregater, når cellerne udsættes for en Wnt5a gradient in vitro [15]. Mens Wnt5a gradienter ikke kan påvises direkte i den primære væv, denne opdagelse åbner muligheden for at udnytte den intracellulære fordeling af Fzd3 som indikator for funktionelle Wnt5a gradienter virker på celler

in vitro

.

Ikke-melanom hudkræft bestående BCC og SCC er den hyppigste human cancer og stadig stigende i forekomsten med mere end 100.000 diagnosticerede tilfælde hvert år i Storbritannien. Selv om kun SCC metastaserer i immunkompetente individer, SCC’er er meget lokalt invasive, hvilket gør dem let tilgængelige naturlige modeller til at studere vævsinvasion. Udtrykket af Wnt5a og beslægtede receptorer er ikke blevet undersøgt på proteinniveauet i disse tumorer og få data findes om virkningen af ​​Wnt5a på retningsbestemt migration i SCC celler eller keratinocytter in vitro.

Her rapporterer vi fordelingen af Wnt5a og receptorerne Fzd5 og Fzd3 i SCC og BCC. Vi benytter Fzd3 lokalisering til at identificere Wnt5a gradienter operative i voksen hud samt i SCC /BCC. Vi give yderligere funktionel dokumentation for, at Wnt5a gradienter forbedre rettet motilitet af keratinocytter. Expression profilering viser, at invasive SCC, i modsætning til benign inflammatorisk hyperproliferation af keratinocytter, er præget af den samtidige opregulering af ikke-kanoniske og undertrykkelse af kanoniske Wnt-signalering. Vores data tillader formuleringen af ​​en arbejdsgruppe model for, hvordan Wnt5a kan virke til at forbedre motilitet og invasionsevne i disse tumorer.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Før biopsi, patienter gav skriftligt samtykke til lagring og analyse af biopsiprøver. Opbevaring og anvendelse af alle væv, der indgår i arbejdet præsenteres her blev udført i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen og godkendt af Tayside udvalg for medicinsk forskning Ethics B (REC ref. Nr. 07 /S1402 /90).

Tumor prøver

SCC studerede her blev udskåret fra immunkompetente patienter fra hovedet (n = 7) eller hænder /ben (n = 4), i hvert tilfælde udviser omkringliggende tegn på solskader og klassificeret som godt differentierede (n = 8) eller moderat /dårligt differentierede (n = 3). BCC (n = 9) var alle fra hovedet, bortset fra en BCC skåret ud af hånden

Immunhistokemi

Antistoffer blev anvendt, var anti Wnt5a (R .. D, ordre nr AF645, endelig fortynding 1:400, alternativ antistof (vist i figur S1:.. Abcam, klon 3D10, ordre nr Ab86720, der anvendes ved 1:10000 fortynding), anti-frizzlede 3 (Insight Biotech, bestilles gennem acris Antistoffer, Tyskland, ordre nr. SP4568P, 1:200), anti-frizzlede 5 (Cambridge Bioscience, ARP41245_P050, 1:800), β-catenin (Millipore, 05-665). Immunhistokemi blev udført nøjagtigt som beskrevet [14] med Paraffin-indlejrede prøver fra Tayside Tissue bank.

Stabil udtryk for Wnt5a og cellekultur

Etablering af Wnt5a-stabilt transfekterede HaCat celler.

HaCat celler blev opnået som tidligere [17] beskrevet. celler blev udpladet i 6-brønds celledyrkningsplader i en tæthed på 5 x 10

4 celler /brønd før lipofectamin transfektion med enten pcDNA3 WNT5A-HA-konstruktion (fuld længde human rekombinant Wnt5a med C-terminale HA-mærke) eller en pcDNA3 tom vektor. Celler blev transficeret med 1 ug plasmid-DNA komplekseret med 8 pi Lipofectamine 2000 transfektionsreagens og inkuberet med transfektion kompleks i 4 timer. Supernatanten blev fjernet og DMEM + 10% FCS indeholdende 800 ug /ml G418 blev tilsat til hver brønd. Celler blev observeret i løbet af to uger, med medier skifter hver 2-3 dage. Når kolonier begyndte at dukke blev cellerne trypsineret og overført til 25 cm

2 cellekultur kolber. Kulturer blev opretholdt i DMEM indeholdende 10% FCS (non-varmeinaktiveret) med 800 ug /ml G418. Fortsat Wnt5a ekspression blev verificeret ved Western blot ved hjælp af anti Wnt5a (R . Tabel 1). Som med Fzd3, tumorer, der gjorde udtrykkelig Fzd5 udstillet Fzd5-positive regioner skiftende med Fzd5-negative regioner (fig. 3a). Derimod tumor – associerede endotelceller konsekvent udviste stærk Fzd5 ekspression (fig 3c, h.). Tumorassocierede fibroblaster var svage til moderat positiv for Fzd5 (fig. 3c, indsat). Således, mens Fzd5 udtryk er variabel i ikke-melanom hudkræft celler, dens udtryk niveauet i tumor-skibe er i overensstemmelse med en rolle af denne receptor i formidling Wnt5a-afhængige inflammatoriske veje, i overensstemmelse med tidligere rapporter [20], [21].

Immunhistokemi af SCC (a-d), eller BCC (e-h), i hvert tilfælde viser et eksempel på tumorer, der udviser høje (SCC: a, C, BCC: e, g) eller lav (SCC : b, d, BCC: f, h) Fzd5 udtryk. Farvning intensiteter i tumorer kan sammenlignes direkte farvning intensiteter af Fzd5 i det granulære lag af epidermis (sorte pilespidser). Panel a, b, e, f er vist ved 40 × og c, d, g, h ved 200 ganges forstørrelse. Den indsatte på den nederste højre (c) viser en tumor-associeret fibroblast. Røde pile betegne blodkar.

Wnt5a og FZD receptorer udtrykkes af ikke-overlappende tumor celle delmængder

Vi næste undersøgt den rumlige forhold Wnt5a, Fzd3 og Fzd5 i de enkelte tumor prøver. Til dette formål har vi bestemt farvning intensiteter af disse proteiner i serielle sektioner af individuelle tumorer henholdsvis, da antistoffer er egnede til co-immunfluorescens i paraffinindlejrede prøver var ikke tilgængelig. Som vist i figur 4 blev Wnt5a overvejende udtrykt på randen af ​​tumoren i SCC (samt i tumorassocieret stroma). Derimod Fzd3 lokaliseret til celler i tumormassen, undertiden danner reden-lignende Fzd3-positive tumor-domæner (midterste panel, hvid pil hoved) og, som beskrevet ovenfor, udviser fokalt polariseret intracellulær fordeling. Fzd5 udstillet heterogen intra-tumor distribution, lokaliseret til intra-tumor klynger (øverst), svag /diffust ved kanten (nederst), eller ensartet fordelt i hele (i midten). Analoge ordninger blev observeret i BCC, med Wnt5a er stærkest udtrykt ved forkanten, samt i tumorassocieret stroma (figur 5, venstre paneler), mens Fzd3 viste polariseret ekspression i tumoren (figur 5, øverst i midten), eller i Fzd3-positive reder (hvid pilespidser). Fzd5 var svag eller fraværende i de fleste BCC (nederst til højre, se tabel 1). Hvor udtrykt, Fzd5 udviste diffus intra-tumorlokalisering (øverst til højre), eller i tumoren kant (midten til højre). Tilsammen viser dataene, at Wnt5a og dens receptorer udtrykkes af ikke-overlappende delpopulationer. Den stærke ekspression af Wnt5a ved forkanten, såvel som i tumor-omsluttende stromaceller, sammenholdt med den polariserede ekspression af Fzd3 inden tumormassen antyder, at Wnt5a gradienter rage ind i tumoren kan forbedre motilitet i distinkte subpopulationer.

Serial sektioner af tre paraffin indlejret SCC tumor prøver (top, midt, nederste række, henholdsvis) blev farvet for Wnt5a, Fzd5, Fzd3 henholdsvis som beskrevet i Methods, og vist ved 200 × forstørrelse. Rød stjerne angiver kunstig kernefarvning muligvis på grund af antigen retrieval betingelser. Røde pile angiver grænserne for tumorer, peger mod stroma

Immunhistokemi af serielt skåret prøver farvet for Wnt5a, Fzd5 eller Fzd3 som anført, forstørrelse:. 100 × (øverste række), 200 × (midten, nederste rækker).

Wnt5a koncentrationsgradienter forbedre retningsbestemt motilitet af keratinocytter

De data, der er sammenfattet ovenfor foreslåede Wnt5a koncentrationsgradienter kan være vigtige for dens virkning på celle motilitet. For at teste denne hypotese funktionelt, vi brugte humane HaCat keratinocytter som model. Vi stabilt transficeret HaCat celler med et Wnt5a udtrykkende vektor eller tomme kontrol vektor (betegnet HaCat pcDNA). Ekspression af rekombinant Wnt5a blev verificeret ved Western-blot (fig. 6A). Først vurderede vi rettet cellemigrering i en to-kammer Transwell assay. Som vist i figur 6B, når rekombinant Wnt5a blev tilsat direkte til HaCat-pcDNA keratinocytter i det øvre kammer, således til stede i en homogen koncentration omkring migrerende celler, det hæmmede kemotaktisk migrering til 5% FCS stede i bunden godt. Ligeledes blev kemotaktisk migration signifikant reduceret i celler, der overudtrykker Wnt5a forhold til ikke-overudtrykkende celler (fig. 6C). Et analogt resultat blev opnået på kort sigt (6 timer) migration assay ved anvendelse af enten 5% FCS eller EGF som kemoattraktant (fig. S2A). Endvidere i scratch-assays, migration af Wnt5a-overudtrykker HaCat-celler i 10% FCS DMEM (fig. 6D) mod bunden kant var stærkt reduceret sammenlignet med HaCat-pcDNA-celler (lignende resultater blev fundet, når anvendelse af 1% FCS som kemoattraktant, fig. S2A). Således er keratinocyt migration inhiberes når Wnt5a omgiver cellerne ved homogen koncentration. Derimod når Wnt5a-udskillende HaCat-celler blev podet ved bunden af ​​et Transwell kammer, hvorved der etableres en opadgående Wnt5a koncentrationsgradient blev migrering af ikke-Wnt5a overudtrykkende Hacat celler podet i øverste kammer mod Wnt5a kilden signifikant forøget (fig. 6e). Disse data viser, at humane keratinocytter induceres til at migrere mod en Wnt5a-gradient, men at ikke-gradient Wnt5a nedsætter motilitet mod andre kemoattraktanter.

A. Ekspression af endogen og rekombinant Wnt5a i hele cellelysater af stabilt transficeret Wnt5a-overekspression HaCat eller kontrol (HaCat-pcDNA) celler verificeret ved Western blot. B. Ikke-Wnt5a overudtrykker HaCat-pcDNA-celler blev podet i det øvre kammer i et Transwell i 0,1% BSA DMEM i fravær eller nærvær af rekombinant Wnt5a ved 1 ug /ml, som angivet i figuren. Det nedre kammer blev fyldt med 600 pi DMEM indeholdende 5% FCS som kemoattraktant. Resultater er udtrykt som procent af migrerende celler når HaCat-pcDNA blev podet i 0,1% BSA DMEM alene. De viste resultater repræsenterer middelværdien ± s.d. af to uafhængige forsøg, hver udført in triplo, * p ≤ 0,05. C. Sammenligning af Wnt5a-overudtrykkende og pcDNA kontrol cellemigrering. Celler suspenderet i 0,1% BSA DMEM blev udsået i det øvre kammer. Det nedre kammer blev fyldt med 600 pi DMEM indeholdende 5% FCS som kemoattraktant. Migration blev vurderet ved 18 h under anvendelse af en kolorimetrisk assay. Resultater er udtrykt som procent af HaCat-pcDNA migrerende celler. De viste resultater repræsenterer middelværdien ± s.d. af n = 4 uafhængigt forsøg, hver udført in triplo, *** p≤0.001. D. Scratch sår assay udført på mitomycin-C-behandlede celler. Under overførslen, HaCat-pcDNA (a, b, c), eller Wnt5a-overekspression celler (d, e, f) blev opretholdt i DMEM indeholdende 10% FCS. Billeder blev taget lige efter bunden blev foretaget (0 timer) (A og D), samt 18 timer (B og e), og 24 timer senere (c og f). E. Migration af HaCat-pcDNA kontrolceller i nærvær af en Wnt5a koncentrationsgradient. Wnt5a-overudtrykkende eller pcDNA HaCat-celler blev podet i de nederste brønde i Transwell-plader. Umiddelbart før du tilføjer indsatserne indeholder HaCat-pcDNA celler i det øverste kammer, blev medierne i de nederste brønde udskiftes for at fjerne pre-udskilt Wnt5a. Migration blev vurderet på 18 timer. Resultater er udtrykt som procent af HaCat-pcDNA migrerende celler. De viste resultater repræsenterer middelværdien ± s.d. af n = 3 uafhængige forsøg, hver udført i tre eksemplarer, *** p≤0.001.

Øget Wnt5a udtryk i kutan SCC er ledsaget af undertrykkelse af kanoniske Wnt signalering og nedregulering af signalering hæmmere

Da kanoniske og ikke-kanoniske pathways tværs inhiberer hinanden, virkningen af ​​Wnt5a signalering

in vitro

er afhængig af den relative forekomst af andre ligander, modulatorer, receptorer og nedstrømseffektorer i Wnt-signalering netværk. Vi udførte derfor en omfattende analyse af ekspressionen af ​​Wnt-signalering komponenter i primær invasiv kutant planocellulært karcinom. Som vist i tabel 2, Wnt5a var den mest signifikant opreguleret af alle wnt ligander (fire-fold, p = 8 × 10

-6), independenly bekræfter immunhistokemiske data. Derimod den mest udtrykte kanoniske Wnt medlem, Wnt3a, betydeligt nedreguleres og derved lindre kompetitiv antagonisme for Wnt5a på receptor-niveau. (En anden kanoniske Wnt ligand, Wnt8b, formelt opreguleres, men ser ud til at blive udtrykt ved meget lavere totale niveauer, tabel 2). Blandt anerkendte Wnt5a-bindende frizzled receptorer, er Fzd2 og Fzd5 opreguleres, omend på marginal statistisk signifikans (tabel 3). Blandt ekstracellulær Wnt antagonister SFRP1 opreguleres, i overensstemmelse med yderligere undertrykkelse af kanoniske Wnt signalering (se nedenfor, diskussion). DKK2, specifikke for kanoniske Wnt medlemmer, også undertrykt, men udtryk for den meget højere udtrykte DKK1 er uændret. Derimod antagonister rettet mod både kanoniske og ikke-kanoniske Wnts, Wif og SFRP2 /3, samt den centrale intracellulær signalering antagonist Axin2, er alle betydeligt nedreguleret. Disse ændringer er grafisk opsummeret i fig. 7a. Kollektivt, de foreslår, at opregulering af Wnt5a i invasive SCC er en del af et sæt af ændringer, der handler synergistisk at øge ikke-kanoniske, men undertrykke kanonisk Wnt signalering (se nedenfor, diskussion).

(a) Cartoon illustrerer funktionelle relationer mellem Wnt signalering komponenter er anført i tabel 2 og 3. Rød: opreguleres, Grøn: nedreguleret. Store stiplede linier repræsenterer proteinbinding. (B) Særlig dysregulering af SFRP1 og SFRP2 i invasiv SCC, men ikke psoriasis. Fold-dysregulering af udskrifter i psoriasis plaques blev beregnet som tidligere beskrevet [19] og tilpasset til SCC datasæt beskrevet i tabel 2 og 3. Farvekodning og fed skrift, der er som i tabel 2. “ns”:. Ikke signifikant

Samtidig inverse transkriptionel regulering af Wnt5a og Wnt3a skelner SCC fra ikke-invasiv godartet hyperproliferation

transkriptionel opregulering af Wnt5a selv er usandsynligt, at forårsage invasiv, da det er også kraftigt opreguleret i psoriasis, en hyperproliferativ men ikke-invasiv sygdom [14]. Vi søgte derfor at identificere yderligere faktorer dreje fysiologisk Wnt5a aktioner i en forstærker for invasiv migration. Til dette formål sammenlignes vi genekspression af wnt signalering komponenter i SCC med psoriasis. I begge betingelser, er den respektive patologisk tilstand sammenlignet med raske kontrol hud. Det relative niveau af genekspression, udtrykt som rang niveau, blev fundet at korrelere godt mellem kontrol hudprøver i begge datasæt, hvilket angiver, at dysregulering af gener påvist i disse situationer indtræffer i forhold til en lignende kontrol (fig. S3). Figur 7b viser en farvekodet dysregulering zonekort af Wnt-signalering komponenter er anført i tabel 2 og 3 til SCC vs. psoriasis. I bekræftelse af vores tidligere resultater [14], er Wnt5a og Fzd5 også opreguleret i psoriasis. Ligeledes nedreguleringen af ​​den kanoniske wnt inhibitor DKK2, CTNNBIP1 (ICAT), Axin2, samt FRZB (SFRP3) er fælles for SCC og psoriasis. Men undertrykkelsen af ​​Wnt3 samt dysregulering af SFRP1 og SFRP2 kun findes i invasive kutan SCC, men ikke psoriasis.

Mangel på nukleare β-catenin farvning og svag Axin2 proteinekspression bekræfter nedreguleret kanoniske Wnt-signalering i SCC og BCC

for at få yderligere uafhængig evidens for aktivering status kanoniske Wnt-signalering vi udførte immunhistokemi af β-actin, anvendelse af et antistof specifikt for aktiveret (Ser38 /Thr41 dephosphoryleret) β – actin. Som vist i figur 8, nuklear β-catenin var rigelig i granulære lag af epidermis, men fraværende fra enten SCC eller BCC tumorer. Dette var tilfældet for alle SCC (n = 12) og BCC (n = 7) prøver undersøgt. Vi tog endvidere fordel af den offentligt tilgængelige væv vifte repository findes på ProteinAtlas hjemmeside. Denne database indeholder immunhistokemiske data varierer i kvalitet afhængig af de anvendte reagenser. I tilfælde af β-catenin, indeholder hjemmesiden serien farvet med fire forskellige antistoffer, hvoraf tre er blevet grundigt valideret (se data S1). IHC billeder frembragt ved anvendelse af enten den samme antistof specifikt for aktiveret β-catenin eller antistoffer detekterer total β-catenin afslørede tilstedeværelsen af ​​membranen placeres β-catenin, men konsekvent fravær af nuklear β-catenin i 12/12 SCC og i 11 /BCC anvendelse af fire forskellige antistoffer (fig. 9, data S1). Endelig har vi minerede også data på ProteinAtlas rådighed for Axin2. Selvom niveauet for validering af dette antistof er ikke helt så robust som for β-catenin antistoffer, de foreliggende data tyder på, at Axin2 ikke ophobes i enten SCC eller BCC (figur S6). Således proteinniveau data stemmer overens med ekspressionsprofil data, hvilket antyder undertrykkelse af kanonisk Wnt signalering.

Immunhistokemi af tre BCC (a-c) og SCC (d-f) prøver farvet med et antistof specifikt for aktiveret p-catenin. Bemærk stærk nuklear β-catenin begrænset til det granulære lag af epidermis i hver prøve, samt i en forstørret hårsækken umiddelbart under SCC-celler (indsat i d). Alle prøver er vist ved 100 ganges forstørrelse, indsat ved 400 ×.

Prøverne blev farvet enten med et antistof specifikt for aktiveret ikke-phosphoryleret β-catenin (øverst) eller pan-β-catenin (bund) . Billeder i (a) og (d) viser β-catenin fordeling observeret med det respektive antistof. Bemærk, at stærke kernekraft β-catenin er begrænset til det granulære lag af epidermis.

Diskussion

Talrige undersøgelser har antydet en rolle Wnt5a i cancer invasion (f.eks [16], [22] -. [25]. Ikke desto mindre rolle Wnt5a i kræft er kontroversiel, nogle rapporter tyder på, at Wnt5a kan virke som tumorsuppressor ved antagonisering kanonisk Wnt signalering (revideret i [26]), på den anden side, både kanoniske og