PLoS ONE: synergistiske virkninger af kombineret Wnt /KRAS Hæmning i kolorektal cancer Cells

Abstrakt

Aktivering af Wnt signalering skyldes manglende evne til at nedbryde β-catenin findes i 85% af tarmkræft. Ca. halvdelen af ​​coloncancere udtrykke en konstitutivt aktiv KRAS-protein. En betydelig del af patienterne viser begge abnormiteter. Vi har tidligere rapporteret, at samtidig nedregulering af både β-catenin og KRAS var nødvendigt at inducere signifikant celledød og tumorvækst inhibering af kolorektal cancerceller. Selv attraktiv, en RNAi-baserede terapeutiske tilgang er stadig langt fra at være ansat i den kliniske omgivelser. Derfor søgte vi at rekapitulere vore tidligere fund ved anvendelse af små molekyler inhibitorer af β-catenin og KRAS. Vi viser her, at β-catenin hæmmere PKF115-584 og pyrvin pamoat blok β-catenin-afhængige transkriptionel aktivitet og synergi med KRAS-hæmmer

S-trans, trans

-farnesylthiosalicylic syre (FTS, salirasib) i tyktarmen kræftceller drevet af Wnt og KRAS onkogene signaler, men ikke i celler, der bærer BRAF-mutationer. Den kombinerede anvendelse af disse forbindelser var bedre anvendelse af noget lægemiddel alene til at inducere celle vækststandsning, celledød, MYC og survivin nedmodulering, og inhibering af forankringsuafhængig vækst. Expression analyse af udvalgte cancer-relevant gener afsløret nedregulering af CD44 som et fælles svar på de kombinerede behandlinger. Disse data giver et bevis for princippet for en kombination terapeutisk strategi i kolorektal cancer

Henvisning:. Mologni L, Brussolo S, Ceccon M, Gambacorti-Passerini C (2012) synergistiske virkninger af kombineret Wnt /KRAS Hæmning i Kolorektal cancerceller. PLoS ONE 7 (12): e51449. doi: 10,1371 /journal.pone.0051449

Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, England

Modtaget: August 16, 2012; Accepteret 31. oktober, 2012; Udgivet: December 5, 2012 |

Copyright: © 2012 Mologni et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af den italienske forening for Cancer Research (AIRC), Cariplo Foundation, det italienske sundhedsministerium og Lombardiet regionale regering. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Nylige fremskridt i vores forståelse af tumor biologi har vist, at på trods af deres store heterogenitet, kræftceller ofte forbliver afhængige af et begrænset delmængde af genetiske defekter for deres overlevelse. Succesen med målrettede behandlinger i CML, GIST og undergrupper af NSCLC viser tydeligt, at selv fremskreden sygdom har behov funktionen af ​​dets grundlæggende onkogener at vokse og overleve [1], [2]. Dette fænomen, kaldet “onkogen afhængighed”, giver det grundlag for en målrettet kræftbehandling, som ideelt set bør være fri for uønskede bivirkninger på normale celler [3].

Kolorektal cancer (CRC) er kendetegnet ved godt -known genetiske defekter: det store flertal (70-95%) af sporadiske CRCs bærer mutationer, som hyper-aktiverer Wnt-vejen, i sidste ende fører til unormal β-catenin-afhængig genekspression [4], [5], [6], [7]. Disse ændringer forekommer tidligt under tumor udvikling [8] og sandsynligvis repræsenterer vanedannende læsioner for tumoren. Faktisk nedregulering af β-catenin inducerer vækst anholdelse og differentiering i CRC celler [9]. β-catenin målretning imidlertid ikke, at dræbe cellerne [9], [10], [11]. Dette kan være relateret til den kendsgerning, at CRCs bære en række yderligere mutationer, der også synes at være relevant for overlevelse. For eksempel KRAS aktiverende mutationer er til stede i ca. 35-50% af coloncancer [4], [6], [12], [13], [14]. Hvis der tages fuldtallige Ras-vejen medlemmer i betragtning, herunder de nationale tilsynsmyndigheder, BRAF, NF1, RASSF1A og opstrøms receptortyrosinkinaser, så 60-80% af tumorerne viser ændring af vejen [7], [15], [16 ]. Genomsekvensering data viste, at ca. 30-60% af CRC prøver havnen både Wnt og Ras-vejen mutationer samtidigt [6], [7], [16]. Nylige transgene musemodeller for CRC fremhævede betydningen af ​​både Wnt og KRAS signalering i tyktarmen tumorudvikling [15], [17], [18]. Derfor kan dobbelt målretning være nødvendig for at opnå væsentlige terapeutiske virkninger.

I vores tidligere arbejde, demonstrerede vi, at kombineret shRNA-medieret inaktivering af β-catenin og KRAS i CRC-celler førte til massiv induktion af apoptose

In vitro

og undertrykkelse af tumorvækst

in vivo

, mens individuelt målrettet en af ​​de to veje viste beskedne virkninger [19]. Her forsøger vi at omsætte vores resultater i en farmakologisk tilgang. To uafhængige forbindelser med forskellige virkningsmekanismer, PKF115-584 og pyrvin pamoat, blev anvendt til at blokere β-catenin-afhængig transskription. PKF115-584 er en potent og specifik små-molekyle inhibitor af β-catenin /Tcf4 interaktion og er blevet valideret som en inhibitor af Wnt signalering i forskellige cancermodeller [20], [21], [22], [23]. Pyrvin er et anthelmintisk lægemiddel [24], som er blevet vist at inducere nedbrydning af β-catenin og dens co-faktor pygopus, via aktivering af caseinkinase 1α [25].

S

–

trans

,

trans

-farnesylthiosalicylic syre (FTS, salirasib) er blevet beskrevet som en specifik RAS-hæmmer [26]. FTS efterligner den carboxyterminale

S

-farnesylcysteine ​​mediere rekruttering af Ras-proteiner til cellemembranen. Som følge heraf FTS selektivt forstyrrer associering af kronisk aktiv RAS med membranen, således blokere dens funktion [27], [28], [29].

Vi fandt, at kombinationen af ​​β-catenin-inhibitorer PKF115 -584 og pyrvin pamoat- med RAS-hæmmer FTS synergistisk inducerer vækst anholdelse og apoptose i CRC celler indeholdende både Wnt og KRAS afvigende aktivering. Disse data repræsenterer et bevis for princippet for kombineret Wnt /RAS hæmning i kolorektal cancer.

Materialer og Metoder

cellelinjer, antistoffer og inhibitorer

SW837 var en slags gave Dr. Manuela Gariboldi (IFOM, Milano, Italien), som oprindeligt fået dem fra ATCC. IFOM Cell Biology Unit bekræftet deres identitet ved mikrosatellit genotypning. Alle andre cellelinier blev indkøbt fra American Type Culture Collection, hvor de rutinemæssigt kontrolleres ved hjælp genotypiske og fænotypiske test for at bekræfte deres identitet. LS174T og HCT-116 celler bærer mutationer i CTNNB1 gen, der stabiliserer β-catenin-protein [30]. DLD-1, SW480, LoVo og SW837 celler har en trunkeret APC-gen [31], [32]. Disse seks cellelinjer udtrykker en konstitutivt aktiveret KRAS protein [33], [34], [35]. HT-29 og Colo-201 cellelinjer har vildtype-KRAS, men huser en mutant BRAF

V600E allel [33], [36]. Fuld annotation af disse mutationer er rapporteret i tabel S1. LS174T-celler stabilt transficeret med doxycyclin-inducerbar shRNA konstruktioner blev beskrevet tidligere [19]. Alle celler blev holdt i RPMI 1640 medium (undtagen DLD-1, som blev dyrket i DMEM og LoVo i Hams F12 næringsstof) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 enheder /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 2 mmol /L L -glutamine, og inkuberet ved 37 ° C med 5% CO

2 atmosfære. LS174T-celler med inducerbar β-catenin og KRAS shRNA blev beskrevet tidligere [19]. Følgende antistoffer blev anvendt i denne undersøgelse: anti-KRAS (Abnova, klon 4F3, fortyndet 1:1000), anti-pygopus (Santa Cruz Biotechnology, H-216, 1:200), anti-myc (Santa Cruz Biotechnology, 9E10 , 1:200), anti-actin (Sigma-Aldrich, 1:2000), anti-survivin (Santa Cruz Biotechnology, D-8, 1:200), anti-β-catenin (Millipore, 2H4A7, 1:1000) . PKF115-584 blev venligst stillet til rådighed af Novartis, Inc. (Basel, Schweiz).

S

–

trans

,

trans

-farnesylthiosalicylic syre (FTS) blev syntetiseret som beskrevet [26]. Pyrvin pamoat blev købt fra Sigma-Aldrich. Alle inhibitorer blev opløst i DMSO og opbevaret i små alikvoter ved -20 ° C.

cellevækst og celledødsassays

cellevækst og levedygtighed blev vurderet på de angivne tidspunkter ved anvendelse af CellTiter 96® vandige Solution celleproliferationsassay System (Promega Corporation) efter instruktioner, som tidligere rapporteret [37]. For at evaluere induktionen af ​​apoptose, blev cellerne udsået i 6-brønds plader natten over og derefter behandlet med inhibitorer eller køretøj. Efter 72 timer blev cellerne løsrevet med trypsin, vasket, og apoptose blev bestemt under anvendelse af Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Bender Medsystems) ifølge producentens instruktioner. Alle grafer og IC

50 værdier blev dannet ved anvendelse af GraphPad software.

Dual luciferase assay

Cellerne i 6-brønds plade blev behandlet med inhibitorer eller køretøj, og transficeret med 2 pg af TOPflash eller FOPflash plasmider og 0,1 ug phRL-CMV (kodning for

Renilla luciferase

, der anvendes som en intern kontrol til transfektion effektivitet) ved hjælp af 3 pi af FuGENE

TM 6 reagens. Efter 24 timer blev cellerne høstet, vasket og lyseret. Luciferase signaler blev opdaget ved hjælp af den dobbelt-Luciferase® Reporter Assay System (Promega). Ildflueluciferase intensitet blev normaliseret i løbet af Renilla luciferase signal

Aktiv KRAS pull-down assay

Cellerne blev behandlet med FTS eller DMSO i 15 timer og derefter lyseret i magnesium Lysis Buffer (MLB:. 25 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, 1% NP-40, 0,25% natriumdeoxycholat, 10% glycerol) indeholdende proteaseinhibitorer (10 pmol /l benzamidin-HCI og 10 ug /ml hver aprotinin, leupeptin og pepstatin A). Lysater blev klaret ved centrifugering ved maksimal hastighed og kvantificeres ved Bradford assay. Tilsvarende mængde af totale proteiner (1 mg) blev derefter inkuberet med 10 ug Raf-1 RBD agaroseperler (Millipore) i 45 minutter ved 4 ° C på et roterende hjul. Efter 3 vaske med MLB blev perlerne resuspenderet i 2 x Laemmli-prøvebuffer, kogt og påført på SDS-PAGE. Aktiv, trukket ned KRAS blev afsløret af anti-KRAS-antistof. Total KRAS (input) blev evalueret fra det rå lysat.

Synergi analyse

Celler blev behandlet med vehikel eller inhibitorer, enkelt eller kombineres ved forskellige koncentrationer og forskellige forhold. Efter 3 dage blev cellerne delt 1:10 og podet i nærvær af inhibitorer. På dag 6 blev cellekultur vækst /levedygtighed overvåget ved MTS-assay. Relative vækst, sammenlignet med vehikelbehandlede kontroller, blev anvendt til at beregne den påvirkede fraktion og kombinationen indekset for hver forsøgsgruppe kombination, ved hjælp af CalcuSyn software.

Western blotting

Cellerne blev høstet, vasket med iskold PBS og resuspenderet i lysepuffer som beskrevet [19]. Total celleekstrakter blev påsat på SDS-PAGE, overført til en nitrocellulosemembran og probet med de angivne primære antistoffer natten over ved 4 ° C. Proteiner blev afsløret ved kemiluminescens efter inkubering med HRP-konjugerede sekundære antistoffer (GE Healthcare, fortyndet 1:2500).

Soft-agar koloniassay

Ti tusind celler blev indlejret i RPMI indeholdende det angivne forbindelserne og 0,3% lavtsmeltende agarose typen VII (Sigma-Aldrich) og podet på toppen af ​​en 0,5% agarose /RPMI bærelag i 6-brønds plader. Friske inhibitorer blev tilsat hver 7. dag til topagarlag. Kolonierne blev talt efter 20 dage.

Kvantitativ realtids-PCR

Celler blev behandlet med vehikel eller inhibitorer i 24 eller 72 timer og høstet. Totalt RNA blev ekstraheret med TRIzol-reagens (Invitrogen) og retrotranskriberet med tilfældige hexamerer hjælp af en standard procedure. For 96-brønd-array gensæt, forward og reverse primer mix (5 pmol hver) blev spottet i tilsvarende brønd for hver målgen, og pladerne blev holdt nedfrosset ved -80 ° C indtil brug. Reaktionen mix (2 pi cDNA, 10 pi Brilliant III Ultra-Fast SYBR® Green QPCR Master Mix og 7 pi vand, per brønd) blev sat til pre-made plader og kvantitativ PCR blev kørt på en Stratagene MX3000P detection system, under følgende betingelser: 95 ° C, 3 min (1 cyklus); 95 ° C, 10 sek, 60 ° C, 20 sek (40 cyklusser). Bekræftelsen kørsel blev udført tredobbelt under anvendelse af standard real time PCR-protokol anbefalet af producenten. GAPDH housekeeping-genet blev altid anvendt som en intern reference. Primere til GAPDH var TGCACCACCAACTGCTTAGC (fremad) og GGCATGGACTGTGGTCATGAG (tilbage). Primerne for alle andre gener er opført i tabel S2.

Resultater

PKF115-584 (figur 1A) og pyrvin pamoat- (figur 1B) har vist sig at blande sig i β-catenin associeret transkriptionel kompleks gennem forskellige mekanismer. For at kontrollere aktiviteten af ​​de to lægemidler i CRC celler, vi karakteriseret deres virkninger i LS174T cellelinie, der bærer β-catenin og KRAS aktiverende mutationer [30], [33]. Denne cellelinje blev oprindeligt valgt som en model, fordi det tidligere blev anvendt til at karakterisere virkningerne af siRNA-medieret gen-nedregulering [19]. Som rapporteret i figur 1D-E, hæmmede begge lægemidler cellevækst på en dosis-afhængig måde. Tilsvarende inhibering vækst blev opnået i DLD-1-celler, som udtrykker en trunkeret APC allel (figur S1A-B). Samtidig er de to forbindelser inhiberede transkription fra β-catenin /Tcf4-responsiv reporter plasmid TOPflash (figur 1G-H). IC

50 værdier observeret for celledeling og TOPflash kurver er enige, hvilket tyder på, at væksten anholdelse medieres af β-catenin hæmning. Som forventet pyrvin induceret tab af pygopus udtryk (figur 1K). Det samme resultat blev opnået i DLD-1-celler (figur S1E). Desuden har pyrvin blevet rapporteret at tvinge β-catenin-nedbrydning [25]. Overraskende β-catenin udtryk var uændret i pyrvin-behandlede DLD-1 celler (figur S1E), mens den faldt lidt i LS174T celler (figur 1K). Sekvensanalyse af β-catenin-genet bekræftede tilstedeværelsen af ​​den S45F substitution i LS174T-celler og vildtype-sekvens i DLD-1 celler i det N-terminale phosphorylering region (figur S2). Begge lægemidler blokeret endogen ekspression af MYC, en velkendt β-catenin transkriptionel mål og en stærk promotor af cellevækst (figur 1J-K og figur S1D-E). For at bekræfte inhibering af Wnt-vejen, blev ekspression af to yderligere kendte målgener analyseret ved real-time kvantitativ PCR. Både AXIN2 og CCND1 (kodning for cyclin D1) gener blev nedreguleret ved behandling med PKF115-584 og pyrvin (figur 1 M-N).

(A-C) Kemiske strukturer af PKF115-584, pyrvin og FTS, som tidligere beskrevet (se ref. 20-29) (D-F) Dosis-respons effekter af PKF115-584, pyrvin og FTS på vækst LS174T-celler. Cellerne blev eksponeret ved stigende doser af hver inhibitor i 72 timer. MTS-assay blev anvendt til at evaluere virkningen af ​​forbindelserne på celleproliferation. IC

50 værdier er vist for hver forbindelse. (G-H) Luciferaseaktivitet fra TOPflash plasmidet blev bestemt efter inkubation i 24 timer med PKF115-584 eller pyrvin. Værdier er relative lysenheder (RLU) med DMSO-behandlede celler sat som 1,00. (I) Western blot-analyse af aktiv GTP-loaded KRAS pull-down (øverste panel) og total KRAS (nederst) fra LS174T celler behandlet med FTS. (J-L) Western blot-analyse viser c-myc ekspression i LS174T-celler behandlet med stigende koncentrationer af hver forbindelse i 48 timer. Fra pyrvin-behandlede celler, der pygopus og β-catenin-ekspression også vist (K). Actin vises altid som en belastning kontrol. (M-N) Kvantitativ PCR-analyse af AXIN2 og CCND1 /cyclin D1-ekspression efter behandling med stigende doser (fra 0,125 til 1,0 uM), i PKF115-584 (M) og pyrvin (N). (O) Western blot-analyse af MEK phosphorylering i FTS-behandlede celler. Samlet MEK og actin er vist som kontroller. (P-Q) Dosis-respons-kurver for PKF115-584 og pyrvin i fravær (tomme cirkler) eller nærvær (fyldte cirkler) af 100 uM FTS. Hver enkelt kurve er normaliseret på den tilsvarende prøve uden β-catenin-hæmmer.

De RAS-hæmmer FTS (figur 1C) hæmmede cellevækst ved høje mikromolære koncentrationer (figur 1F og regne S1c), i overensstemmelse med tidligere rapporter [38], [39], [40]. FTS forarmet GTP-loaded (aktiv) KRAS pool, mens total KRAS beløb uændret (figur 1I). Denne anti-KRAS aktivitet translateres til et markant fald myc protein niveauer (figur 1 I) og MEK phosphorylering (fig 1O), men ikke af FOS-ekspression (data ikke vist) i LS174T-celler. Men FTS behandling førte til forskellige molekylære reaktioner i DLD-1 celler: phospho-MEK signal var uændret og MYC blev kun minimalt påvirket, mens FOS udtryk faldet betydeligt (figur S1F). For at vurdere om den anti-proliferative aktivitet af β-catenin-inhibitorer kunne blive forstærket af FTS blev dosisresponskurver genereret ved at eksponere LS174T-celler til stigende doser af PKF115-584 (figur 1P) og pyrvin pamoat (figur 1Q) i fravær eller nærvær af 100 uM FTS. I begge tilfælde, tilsætning af FTS flyttet kurven væsentligt. Især at følsomheden pyrvin steget med omkring 10 gange (IC

50 pyrvin, 0,1 uM; IC

50 pyrvin + FTS, 0,01 uM). Disse resultater tilsammen indikerer, at anti-proliferative virkninger af to β-catenin inhibitorer og RAS-inhibitoren FTS korrelere med specifik hæmning af β-catenin og KRAS aktiviteter i henholdsvis LS174T celler. Desuden FTS øger cytotoksicitet β-catenin inhibitorer i disse celler.

For bedre at definere samarbejde β-catenin og KRAS hæmning i CRC celler, aktiviteten af ​​PKF115-584 og pyrvin, alene og i forskellige kombinationer med FTS, blev testet ved MTS-assay på et panel af CRC cellelinjer der bærer forskellige onkogene mutationer (tabel S1). Resultater opnået i fastsatte koncentrationer er vist i figur 2 som søjlediagrammer (PKF115-584: 125 eller 250 nm; pyrvin: 50 nM; FTS: 100 uM). Interessant, mens følsomheden over for enkelte midler forskelligt for de forskellige cellelinier, i alle KRAS-muterede celler de kombinerede behandlinger forårsagede signifikant højere vækstinhibering forhold til en enkelt behandlinger. Synergi blev derefter undersøgt mere grundigt over et område af inhibitorer koncentrationer, ved anvendelse af metoden beskrevet af Chou og Talalay, baseret på love princip masse-handling [41]. Kombination indeksværdier (CI) blev beregnet ud fra eksperimentelle data langs hele spektret af brøkdele virkninger og er vist som XY plots i figur 2. Specifikke Cl-værdier ved ED50, ED75 og ED90 er rapporteret i tabel 1. Som forudsagt af onkogen mutation status, alle cellelinjer bærer mutationer i både Wnt vejen (APC eller β-catenin) og KRAS viste synergistiske interaktioner (CI 1), undtagen ved ekstreme punkter af fraktion påvirket, hvor effekter er enten ubetydelig eller for stærk. I modsætning hertil HT-29-celler (der bærer vildtype-KRAS og et muteret BRAF

V600E allel) viste ingen synergisme. Snarere, antagonistiske virkninger (CI 1) blev noteret. Men kombinationen af ​​PKF115-584 med en BRAF inhibitor (PLX-4032) viste svag synergisme HT-29 celler ved høje doser (figur S3). Yderligere data opnået med pyrvin /FTS i to KRAS- og en BRAF-muterede cellelinjer er vist i figur S4. Samlet analyse af CI-værdier ved ED50 (pyrvin /FTS) viser korrelation mellem KRAS /BRAF mutationsstatus og synergistisk interaktion (p = 0,0021): alle KRAS muterede celler viste synergi, mens hverken af ​​to BRAF mutant cellelinjer gjorde (figur S5) , selv om det begrænsede antal BRAF testet tillader ikke at drage endelige konklusioner mutant cellelinjer. I modsætning hertil virkningerne ikke korrelerer med p53 eller MSI status (tabel 1). Tilsammen antyder disse resultater, at PKF115-584 og pyrvin kan kombineres med FTS i CRC-celler, der huser samtidig Wnt /KRAS genetiske abnormiteter, for at opnå bedre terapeutiske virkninger.

De angivne cellelinier blev dyrket i 6 dage i tilstedeværelse af inhibitorer som enkelte midler eller i kombination, eller vehikel alene. MTS-assay blev anvendt til at vurdere virkningerne af hver behandling på cellevækst kultur og levedygtighed. (A) PKF115-584 /FTS og (B) pyrvin FTS kombination /. For hver cellelinie, bargrafen (til venstre) viser effekten ved en enkelt dosis (PKF115-584, 0,25 pM [LS174T og DLD-1] eller 0,125 pM [SW480 og HCT-116] pyrvin, 50 nm; FTS, 100 uM). XY graf (højre) viser kombination indekser som en funktion af den berørte del (se Materialer og fremgangsmåder). For hver cellelinie, de gener, der er muterede, påvirker Wnt og Ras pathways, er angivet i parentes. CTRL = kontrol; Pyrv = pyrvin. I alle paneler, antal symboler (#) angiver signifikans versus β-catenin-inhibitor (PKF115-584 eller pyrvin); asterisk (*) angiver signifikans versus FTS; ét symbol, p 0,05; to symboler, p 0,01; tre symboler p. 0,001

Vi derefter yderligere karakteriseret de synergistiske kombinationer brug af yderligere uafhængige analyser (figur 3 og figur S6). Cellevækst blev overvåget i løbet af flere dage, efter at udsætte LS174T og DLD-1-celler til de tre lægemidler, alene eller i kombination, som viser, at FTS potenseret PKF115-584 og pyrvin toksicitet allerede efter 3-4 dage (figur 3A og figur S6A). Vækstinhibering blev ledsaget af induktion af apoptose: antallet af tidlige apoptotiske celler var signifikant højere i kombination prøver sammenlignet med hvert lægemiddel alene (figur 3B og figur S6B). Som sammenligning blev apoptose i LS174T celler vurderes parallelt efter induktion af anti-β-catenin og anti-KRAS shRNAs og nåede et sammenligneligt tidlig apoptose i den dobbelt-lyddæmpet prøve (figur 3B). Silencing af målproteiner er vist i figur S7. Dernæst alle tre forbindelser kan inhibere MYC-ekspression i LS174T-celler (figur 1J-L), bestemte vi, om at kombinere suboptimale koncentrationer af lægemidlerne kunne fremkalde en bedre blokering af MYC transcription. Tidligere rapporter har vist, at både KRAS og β-catenin er i stand til at regulere MYC udtryk i colon cancerceller [19], [42], [43]. Faktisk kombinationsbehandlinger i 24 timer viste en signifikant forbedring i MYC udtryk inhibering sammenlignet med enkelt behandlinger (figur 3C). Dette resultat antyder, at MYC er en fælles effektor af de to veje og dets nedregulering korrelerer med cellevækst og levedygtighed inhibering i disse celler. I modsætning hertil observerede vi ingen virkning af kombinationerne på MYC niveauer i DLD-1-celler (figur S6c), i overensstemmelse med manglen på MYC nedregulering af FTS i disse celler. Endvidere kombineret inhibering forårsaget stærk ned-modulering af survivin ekspression, mens ingen eller lille ændring blev opnået ved enkelt behandlinger (figur 3D og figur S6D). Survivin er en transskriptionel mål for både Wnt og KRAS veje [19], [44], [45] og har en afgørende rolle i overlevelsen af ​​KRAS-drevne kræft [46]. Endelig, for at studere de langsigtede virkninger af β-catenin og KRAS kombineret hæmning blev forankringsuafhængig vækst vurderes efter en enkelt tilsætning af subletale doser af PKF115-584 eller pyrvin, og FTS. Som vist i figur 3E-F og i figur S6E-F, en kombination af hver β-catenin-inhibitor med FTS haft en dybtgående virkning på blød-agar vækst af LS174T og DLD-1-celler. Salg

(A) Celler blev behandlet med 100 um FTS, 0,25 uM PKF115-584 eller 50 nM pyrvin, alene eller i kombinationer, eller et køretøj, i 6 dage. cellelevedygtigheden kultur blev vurderet på dag 3, 4 og 6 af MTS. Den relative OD sammenlignet med vehikelbehandlede kontrolceller blev registreret som overlevende fraktion. (B) LS174T-celler blev dyrket i 3 dage i nærvær af de angivne forbindelser (samme koncentrationer som i [A]); parallelt, LS174T-celler, der bærer inducerbare siRNA’er (Sint, ikke-målrettethed; SIBC, anti-β-catenin, siKR, anti-KRAS) blev behandlet med doxycyclin i det samme tidsrum. Apoptose blev bestemt ved annexin V /propidiumiodid dobbelt farvning. Procentdelen af ​​tidlige apoptotiske celler (annexin V-positive /propidiumiodid-negative) er rapporteret i grafen. (C) LS174T-celler blev behandlet med PKF115-584 (0,5 uM), pyrvin (50 nM) og FTS (100 uM), alene eller i kombination, i 24 timer og c-myc ekspression blev vurderet ved real-time PCR under anvendelse GAPDH som reference gen. Ekspression blev normaliseret på vehikelbehandlede kontrolceller. (D) Cellerne blev inkuberet i 72 timer med inhibitorer og cellelysater probet med anti-survivin og p-actin-antistoffer. (E-F) Ti tusind LS174T-celler blev dyrket i blød agar i nærvær af PKF115-584 (0,1 uM), pyrvin (25 nM), FTS (50 uM), alene eller kombineret. Store kolonier blev talt 20 dage senere. Antallet af kolonier dannet af ubehandlede kontrolceller er angivet som 100% (E). Repræsentative fotografier er vist i panel (F). Statistisk analyse: se forklaringen til figur 2.

For at opnå yderligere indsigt i de transkriptionelle ændringer fremkaldt af de kombinerede behandlinger, udtryk for et udvalgt panel af gener relateret til Wnt og KRAS signalering, colon cancer og apoptose, blev undersøgt under anvendelse af et hjemmelavet kvantitativ PCR array. Den Heatmap i figur 4A viser relative ændringer i ekspression efter 72 timers behandling med enkelte eller kombinerede lægemidler, sammenlignet med vehikelbehandlede kontrolceller. Som forventet, enlige agenter forlod de fleste gener uændret, mens kombinationerne inducerede en generel undertrykkelse af det udvalgte gen sæt. Især CD44, COX2, CTBP2, Cycliner D1 og D2, ITF2, p70S6K2 og RASSF7 var stærkt nedreguleret af begge kombinationer i forhold til enkelte behandlinger. Derudover pyrvin FTS kombination /forårsagede nedmodulering af yderligere gener, såsom BCL2, BCL2L1 (koder for Bcl-X

L anti-apoptotisk faktor), BCL9L, KRAS, CDKN1A (p21

WAF1) og PRKCA. For at fange tidligt transkriptionelle forandringer, der sker, før nogen tegn på cellulært stress, blev en 24-timers puls køre med pyrvin /FTS kombination. Denne kombination blev foretrukket frem for en med PKF115-584 for denne analyse, som pyrvin viste en højere grad af gen-nedregulering. Dataene indberettes i højre mest kolonne i Heatmap. Trods nogle forskelle med længere eksponering stoffet, mange af de ændringer blev bevaret, herunder nedregulering af CD44, COX2, BCL2 og Cycliner D. Desuden opregulering af den pro-apoptotiske protein APAF1 blev bemærket. Interessant p21

WAF1 var transient opreguleret ved 24 timer, før den nedreguleres efter 72 timer. For yderligere at bekræfte disse data blev et par gener analyseret uafhængigt af standard realtids-PCR i fire cellelinjer. Figur 4B viser resultaterne fra LS174T celler, hvilket bekræfter genregulering observeret i den oprindelige datasæt. Dataene fra alle fire cellelinjer blev yderligere analyseret for at identificere synergistiske genekspression modulation, defineret som 2-gange ændring af ekspression i en kombination forhold til en enkelt behandlinger (figur 4C). Interessant BCL2 udtryk var synergistisk nedreguleret i alle fire cellelinier ved pyrvin /FTS kombination (fyldt grå bokse). Cyclin D1 og CD44 scorede synergistisk i tre ud af fire cellelinier. CD44 blev også nedreguleret i DLD-1 celler, men omfanget af modulation nåede ikke grænsen for en synergistisk effekt (figur S8). Den PKF115-584 /FTS kombination viste sig mindre effektive i denne analyse, med kun CD44 viser synergistisk nedregulering i mindst to cellelinjer (LS174T og SW480). Disse resultater indikerer CD44 som en fælles reaktion på den dobbelte β-catenin /KRAS målretning.

LS174T-celler blev behandlet i 24 eller 72 timer med inhibitorer og et panel af gener fokuseret på Wnt, blev Ras og apoptoseveje studeret ved QPCR anvendelse af en 96-brønds array (a) eller standard realtids-PCR (B). Graferne i (B) viser udtryk fold ændring i forhold til vehikelbehandlede kontroller. (C) Oversigtstabel rapportering realtids-PCR analyse af data fra alle cellelinier. Fyldte kasser indikerer synergistisk virkning på genekspression ( 2-gange ændring versus hver enkelt behandling). PY = pyrvin.

Efter at have bevist effekten af ​​dobbelt Wnt /KRAS hæmning

in vitro

, vi forsøgte at omsætte disse resultater i en roman terapeutisk strategi

in vivo

. Imidlertid er PKF115-584 ikke længere produceres af Novartis og dets syntese i stor skala vist sig yderst udfordrende og tidskrævende. Som for pyrvin pamoat, rapporteres det at være dårligt absorberet [47]. Imidlertid blev oral administration af pyrvin beskrevet af to grupper [48], [49]. Derfor blev et pilotforsøg køre for at kontrollere, hvis lægemidlet kunne nå målet i nøgne mus, ved at se på pygopus udtryk i LS174T-xenotransplantater efter tre daglige orale administrationer af 10 mg /kg pyrvin. Resultaterne var negative (figur S9), derfor vi ikke forsøge yderligere

in vivo

analyser.

Diskussion

Næsten alle tarmkræft viser ændring af Wnt-vejen, der styrer p-catenin aktivering. Derfor kan hæmning af β-catenin føre til betydelige fremskridt i forvaltningen af ​​denne sygdom. afslørede imidlertid seneste data, at mere end en “driver” onkogen vej ofte aktiveres i en enkelt tumor [50], [51]. Derfor, flere onkogen målretning er forventes at være nødvendig for at udrydde sygdommen. I en betydelig brøkdel af kolorektale tumorer, Wnt og KRAS pathway ombygninger sameksistere [6], [13], [14]. På trods af at det har været kendt i næsten 30 år har KRAS onkogenet været en flygtig mål hidtil. Midler, der blokerer KRAS posttranslationelle modifikationer har været ineffektive i kliniske forsøg [52]. Strategier til at målrette nedstrømseffektorer af KRAS [53], [54], [55] eller at etablere syntetiske dødelige interaktioner [56], [57], [58] har vist forskellige svar fra sag til sag, muligvis på grund af kompleksiteten af KRAS-vejen. Dette er også fremhævet af forskellige molekylære resultat af KRAS hæmning observeret i to CRC cellelinjer i vores undersøgelse. Under en anden tilgang, FTS specifikt forstyrrer KRAS docking til cellemembranen, ved at efterligne dens farnesylcysteine ​​del [29].

I dette arbejde, effekten af ​​kombineret β-catenin og KRAS hæmning af små molekyler blev undersøgt . Synergisme var tydelig i et panel af CRC cellelinjer der bærer forskellige typer mutationer, der påvirker mål-veje, ved brug af flere uafhængige assays. Kombinere suboptimale doser af β-catenin og KRAS-hæmmere observerede vi en markant vækst hæmning og apoptose, som blev afspejlet af en stærk nedregulering af survivin udtryk. Survivin inhiberer aktivering af effektorceller caspaser og opreguleres i mange cancere. Ved at trykke to veje, der styrer dets ekspression i CRC celler, opnåede vi fuldstændig undertrykkelse af sin anti-apoptotisk aktivitet og dermed induktion af apoptose.