PLoS ONE: MicroRNA-210 Regulerer Mitokondriel Free Radical Reaktion på Hypoxi og Krebs Cyklus i cancerceller ved målretning Iron Svovl Cluster Protein ISCU

Abstrakt

Baggrund

Hypoxi i kræftformer resulterer i opregulering af hypoxi inducerbare faktor 1 (HIF-1) og en microRNA, HSA-miR-210 (miR-210), som er forbundet med en dårlig prognose.

Metoder og Resultater

i human cancer cellelinjer og tumorer, fandt vi, at miR-210 henvender mitokondrie jern svovl stillads protein ISCU, der kræves for montering af jern-svovl-klynger, cofaktorer for centrale enzymer involveret i Krebs cyklus, elektron transport og jern stofskifte. Nedregulering af ISCU var den væsentligste årsag til induktion af reaktive oxygenarter (ROS) i hypoxi. ISCU undertrykkelse reducerede mitokondrie kompleks 1-aktivitet og aconitase aktivitet, forårsagede et skift til glykolyse i normoxi og forbedret celle overlevelse. Kræft med lav ISCU havde en dårligere prognose.

Konklusioner

Induktion af disse store kendetegnende for kræft, viser, at en enkelt microRNA, miR-210, medierer en ny mekanisme for tilpasning til hypoxi, ved at regulere mitochondrial funktion via jern-svovl klynge metabolisme og frie radikaler

Henvisning:. Favaro E, Ramachandran A, McCormick R, Gee H, blancheringsindretningen C, Crosby M, et al. (2010) MicroRNA-210 Regulerer Mitokondriel Free Radical Reaktion på Hypoxi og Krebs Cyklus i cancerceller ved målretning Iron Svovl Cluster Protein ISCU. PLoS ONE 5 (4): e10345. doi: 10,1371 /journal.pone.0010345

Redaktør: Andrei L. Gartel, University of Illinois i Chicago (UIC), USA

Modtaget: 16. december 2009; Accepteret: 29 2010; Udgivet: 26 April, 2010

Copyright: © 2010 Favaro et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Cancer Research UK og venner af Kennington Cancer Research Fund (EF, ALH, JL), The Wellcome Trust (CB1, CC, IR), Royal College of Surgeons British Urologi Foundation (CB2, RMcC), EU, ACGT (FB), Rhodes Scholarship (HG), Nuffield Medical Fellowship (AR), FIRC Studentship (EF). Biobank støttet af NIHR Biomedical Research Centre Oxford; Elsa Pardee Foundation (MI), American Cancer Society (MC, MI). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hypoxi er en væsentlig fysiologisk forskel mellem tumorer og normalt væv, primært genereret af tumorvækst med utilstrækkelig forsyning og forbrug af ilt ved tumorceller blod [revideret i [1]]. Hypoxi inducerer en kompleks transkriptionel respons hovedsageligt via induktion af hypoxi inducerbar faktor 1α (HIF1α), der påvirker mange biologiske processer såsom glycolytiske vej, angiogenese, pH-regulering, invasion og immortalisering [2].

En spirende paradigme i hypoksi er, at mitokondrier producere reaktive oxygenarter, medieret af elektrontransport fortsætter i hypoxi [3]. Denne fri radikal pathway bidrager til opregulering af HIF [4] og forøget vækst in vivo [5], men kan også være giftige. En række veje induceret af HIF er allerede blevet rapporteret at beskytte mod den sidstnævnte virkning, for eksempel induktion af pyruvatdehydrogenase-kinase hæmmer enzymet kompleks af pyruvatdehydrogenase og blokerer omdannelsen af ​​pyruvat til acetyl coenzym A, det første trin i Krebs cyklus [6] og forbedrer lactatproduktion [7]. Mitophagy kan være fremkaldt af BH3-domænet protein BNIP3, [8], og cytochrom C oxidase subunits kan skifte til mere effektive [9].

For nylig microRNA (Mirs), der er små (-22 nt) ikke-kodende RNA, der regulerer posttranskriptionel genekspression ved at blokere translation af mål-mRNA’er eller ved at accelerere deres nedbrydning [10], [11], er blevet rapporteret at blive induceret af hypoxi. Men nogle af deres mål eller virkningsmekanismer kendes [revideret i [12]]. Vi og andre [13] har vist MIR-210 er robust induceret af hypoxia i mange cellelinjer, via HIF1α [14]. Vi analyserede nylig sit udtryk i en serie på 216 brystkræftpatienter og viste miR-210-ekspression korreleret med mange HIF1α mål på mRNA-niveau (målt ved en hypoxi metagene) og var stærkt forbundet med dårlig patient overlevelse. Afledt fra sekvens-baserede algoritmer, nogle af de tidligere validerede targets af MIR-210 omfatter Ephrin A3 [15], E2F3 [16], RAD52 [17], CASP8AP2 [18], og MNT [19]. Vi kombinerede offentligt tilgængelige algoritmer, med vores genarray datasæt, at forudsige potentielle MIR mål af betydning i cancerceller. Vi fandt, at den mitokondriske jern svovl klynge homolog ISCU var den højeste forudsagte mål for MIR-210. For nylig, ISCU er blevet identificeret som en MIR-210 target også i normale pulmonale endotelceller [20], hvor den bidrager til Pasteur virkning, og styrer niveauet af ROS-produktion i hypoxi, tyder på potentiel adaptive rolle for hypoxi i forbindelse med pulmonal endotel.

Jern svovl klynger [Fe-S] er til stede i de aktive steder af mange enzymer og proteiner, afgørende for deres aktiviteter og kan tillægge regulering af redox status [21]. Disse klynger er samlet i mitokondrierne [22] af en kompleks serie af chaperoner og enzymer, herunder ISCU, derefter eksporteres til cytoplasmaet, hvor de er samlet i den relevante protein [23]. Blandt de Fe-S-klynge proteiner involveret er flere, der omfatter centrale elementer i komplekse I, II og III i mitokondrierne, og komponenter i Krebs cyklus såsom succinat dehydrogenase og aconitase. Den cytoplasmatiske form sidstnævnte regulerer jern metabolisme via sin funktion som en translationel regulator-IRP1 [24].

I denne rapport viser vi de store biologiske virkninger af miR-210 rettet mod ISCU, som alle kan forventes at bidrage til vigtige fænotyper i cancer. Ved nedregulering ISCU, miR-210 falder Krebs cyklus enzymaktivitet og mitokondrie-funktion, giver en større mekanisme for den øgede frie radikaler generation i hypoxi, øger celle overlevelse under hypoxi, inducerer et skift til glykolyse i normoxi og hypoxi (Warburg og Pasteur effekter) og opregulering af jernoptagelse kræves til cellevækst. Vigtigere, analyse af over 900 patienter med forskellige tumortyper viste, at suppression af ISCU stærkt korreleret med en dårligere prognose. Denne undersøgelse viser således en ny vej aktiveres i hypoxiske tumorer, medieret af miR-210 påvirker mitokondrie enzymaktivitet og frie radikaler generation og fremhæver betydningen af ​​mitokondrie metabolisme i hypoxi biologi [3].

Resultater

Udvælgelse af ISCU som et potentielt mål

Vi sammenlignede miR-210 udtryk i vores offentliggjorte serier af brystkræft [14] med vores hypoxi metagene af klynger af mRNA [25] og kombineret vurdering med mål forudsigelse algoritmer viste ISCU var den højeste forudsagte mål, og tre kendte målgener også sidde i højt klassificeret positioner blev udvalgt af denne tilgang (støttemateriale og metoder S1, Støtte tabel S1).

MIR-210 og ISCU mRNA gennemgår gensidig regulering

efter aftale med tidligere udgivelser [13], [14], miR-210 blev håndfast induceret i MCF7 og HCT116 af hypoxi (1% eller 0,1% ilt) ved 24 og 48 timer, med maksimal induktion observeret ved 48 timer i 0,1% ilt (figur 1A og støtte Figur S1A). ISCU mRNA kvantificeres ved RTPCR blev omvendt korreleret til miR-210 og faldt mest markant, når cellerne blev udsat for mere alvorlig hypoxi i længere perioder (figur 1B og støtte Figur S1B). Svarende til reguleringen af ​​miR-210 under hypoxi, ISCU undertrykkelse på udskrift niveau var afhængig af HIF1α og ikke HIF2α (Støtte figur S1c og S1D). Endvidere blev fænomenet gensidig regulering af miR-210 og ISCU af hypoxi også findes i mange andre cellelinier (Støtte Tal S1E og S1F).

En

, miR-210 stiger under hypoxi, med de mest robuste induktion ses ved 48 timer med 0,1% oxygen.

B

, under de samme betingelser, den stærkeste nedregulering af ISCU mRNA observeret ved 48 timer med 0,1% ilt. Ekspressionsniveauerne af MIR-210 og ISCU mRNA under hypoxi er i forhold til deres normoksiske ekspressionsniveauer efter 24 timer (N). Middel ± S.E.M. af tre uafhængige forsøg er vist (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).

C

, transfektion af anti-210 delvist redder den hypoxiske undertrykkelse af ISCU mRNA og efterligner-210 overekspression falder ISCU mRNA i normoxi på 48 timer. Ekspression af ISCU mRNA er i forhold til den anti-ctrl i normoxi (N). Middel ± S.E.M. af tre uafhængige forsøg er vist (** p 0,01, *** p 0,001).

D

, (

toppanelet

) ISCU protein nedreguleres i MCF7 lysater på 0,1% ilt i forhold til normoksiske lysater (N), når anti-ctrl er transficeret i 48 timer. Dette fald i proteinniveauet under hypoxiske betingelser er delvist reddet når anti-210 transficeres. Under normoksiske betingelser, mimik-210 undertrykker ISCU protein niveauer i forhold til at efterligne-ctrl transfekterede celler.

D

, (

nederste panel

), kvantificering af redningen af ​​ISCU proteinniveau ved transfektion af anti-210. Transfektion af anti-210 redder de ISCU proteinniveauer i MCF7 med ca. 40%. Middelværdi ± S.E.M af to uafhængige forsøg er vist. (* P 0,05).

Mimic-210 undertrykte ISCU i normoxi og anti-210 vendt undertrykkelsen i hypoxi

Vi opsummerede den observerede hypoxisk induktion af miR-210 ved transfektion MCF7 og HCT116 med mimic-210 i normoxi. Mimic-210 undertrykte ISCU mRNA-niveauer med ca. 60% (figur 1C og støtte Figur S2A). Vi derefter antagoniserede miR-210 induceret under hypoxiske betingelser med anti-210. Hæmning af endogen miR-210 betydeligt reddet undertrykkelse af ISCU mRNA, selv om dette ikke var fuldstændig (figur 1C og støtte Figur S2A).

ISCU har to alternativt splejsede isoformer. ISCU1 har en alternativ N-terminal sekvens og er lokaliseret til cytosolen, mens ISCU2 er forbundet med mitokondrier. For at bekræfte specificiteten af ​​antistof, der anvendes i disse studier blev MCF7-celler behandlet med siRNAs mod ISCU. Det påvises i kontrol- celler bandet blev fuldstændig undertrykt ved transfektion med siISCU1 og siISCU3 (Støtte Figur S2B). De to isoformer af ISCU kunne ikke skelnes ved Western blotting af helcellelysater grund af den mindre forskel i molekylvægt. det immunoreaktive bånd blev imidlertid opdaget, både i cytosol og mitokondrie fraktioner (Støtte Figur S2C). Dette bånd omtales som ISCU protein og dets molekylvægt er kompatibel med resultaterne af Tong et. al. [23].

Under hypoxi, viste MCF7 og HCT116 celler en reduktion i ISCU protein, og dette blev gentaget med mimik-210 i normoxi (Figur 1D og støtte Figur S2D). Desuden anti-210 delvist vendt hypoxiske undertrykkelse af ISCU protein (figur 1D og støtte Figur S2D). Hypoxi kraftigt undertrykt en luciferase reporter indeholdende 3’UTR af ISCU, der indeholdt det formodede MIR-210 målområde og denne undertrykkelse delvis kunne reddes ved transient transfektion af anti-210 (Støtte fig S2E). Derudover efterligner-210 undertrykte væsentlige luciferaseaktiviteten sammenlignet med kontrollen i normoksiske MCF7-celler (understøtter Figur S2E). Endelig mens siRNA mod ISCU førte til en nedregulering af både endogen ISCU og et exogent mærkede ISCU mangler 3’UTR blev mimic-210 medieret nedregulering kun observeret på det endogene ISCU protein (Støtte fig S2F). Tilsammen disse observationer viser, at miR-210 nedregulerer ISCU mRNA og protein niveauer ved at målrette sin 3’UTR.

Effekter af ISCU nedregulering på Fe-S-proteiner

En forventet effekt af nedregulering af ISCU ville være en reduktion af Fe-S levering til at målrette proteiner. Derfor analyserede vi virkningen af ​​ISCU undertrykkelse på to enzymer, der kræver Fe-S for deres aktiviteter, aconitase og mitokondrie kompleks I. siRNA mod ISCU væsentligt reduceret aconitase aktivitet i MCF7 og HCT116 celler sammenlignet med kontrol celler i normoxi (figur 2A). En tilsvarende fald i aconitase aktivitet var tydelig i begge cellelinier ved transfektion af mimic-210 (figur 2A). Men der var ingen ændring i aconitase proteinniveauer som vurderet ved Western blot (Støtte fig S3A). Aconitase tømt for Fe-S fungerer som translationel regulator-IRP1, for at øge optagelsen af ​​jern. Vi fandt mimic-210 øget jern optagelse i HCT116 celler (Støtte Figur S3B). Der var også klart inhibering af mitokondriel kompleks I-aktivitet induceret af mimic-210, i de to cellelinier (figur 2B). I begge cellelinier var der nedregulering af aktiviteten af ​​hypoxi, i et lignende omfang til den, der induceres af mimic-210 eller ved ISCU depletion. Endvidere transfektion af anti-210 i MCF7-celler var i stand til at øge aconitase-aktivitet i hypoxi (figur 2C). Salg

Celler transficeret med siRNA mod ISCU eller med mimic-210 viser et signifikant fald i aktiviteten af Fe-S protein aconitase (

A

) og kompleks i (

B

) på 48 timer. Aktivitet udtrykkes i forhold til SCR for siISCU3 eller at efterligne-ctrl for mimik-210. Middel ± S.E.M. af tre uafhængige forsøg er vist (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).

C

, hypoxi nedsætter aconitase og kompleks I-aktivitet i MCF7 og HCT116. Aktivitet udtrykkes i forhold til normoxi (N). Transfektion af MCF7 med anti-210 øger niveauet af aconitase aktivitet, sammenlignet med anti-ctrl. Middel ± S.E.M. af tre uafhængige forsøg er vist (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).

D

, i normoxi, MCF7 transficeret med mimic-210 har en stigning i det secernerede lactat koncentration og en reduktion i den ekstracellulære pyruvat efter 48 timer. Laktat: pyruvat-forhold viser en betydelig stigning under de samme betingelser. Transfektion med anti-210 i hypoxi reduceret laktat produktion i forhold til anti-ctrl transficerede celler. Middel ± S.E.M. af tre biologiske replikater vises (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).

Da faldet i aconitase og kompleks I-aktivitet reducerer Krebs cyklus og mitokondriel funktion undersøgte vi, om der var et skift til glykolyse og laktat produktion. Vores resultater viste en meget signifikant reduktion af pyruvat og stige i lactat i normoxi med mimic-210, med en stigning i lactat pyruvat-forhold. Der var også et fald i laktat produktion med anti-210 i hypoxi (figur 2D).

Effekter af ISCU nedregulering på frie radikaler produktion

Tabet af Fe-S fra komplekse I er kan påvirke transporten af ​​elektroner i elektrontransportkæden og indvirkning på produktionen af ​​frie radikaler. Vi har derfor målt produktionen af ​​superoxid i MCF7 og HCT116 celler. I normoxi viste begge cellelinier en markant stigning i produktionen af ​​frie radikaler ved transfektion af efterligne-210 sammenlignet efterligne-kontrol (figur 3A).

En

i normoxi, transfektion af mimik -210 øger superoxid produktion på 48 timer som målt ved MitoSox farvning. Repræsentative billeder fra efterligner-210 transficerede celler er vist på de øverste paneler og middelværdien ± S.E.M. på ca. 300 celler er vist på de nederste paneler (***, s 0,001).

B

, udsættelse af celler til 0,1% oxygen i 48 timer øger produktionen af ​​superoxid; denne effekt er næsten helt omvendt ved transfektion af anti-210. Repræsentative billeder fra miR-210 transficeret er vist til venstre paneler og middelværdien ± s.e.m. på ca. 300 celler er vist på de rigtige paneler (***, P 0,001).

C

, ROS-produktion induceret af mimic-210 inhiberes i MCF7-celler ved cotrasfection med ISCU2 udtrykkende plasmid. Middel ± S.E.M. omtrent 300-celler er vist (*** p 0,001). Bars = 10 um.

I hypoxi bemærkede vi en meget betydelig stigning i superoxidproduktion, der var næsten fuldstændig vendes ved anti-210 (figur 3B). Derudover transfektion af ISCU2 konstruktionen næsten fuldstændigt vendt fri radikal induceret af MIR-210 (figur 3C). Dette viser en stor ny mekanisme til regulering af ROS i hypoxi, og at det ikke er en passiv effekt af reduceret tilgængelighed ilt.

Virkninger af miR-210 på apoptose og overlevelse i normoxi og hypoxi

Tidligere undersøgelser i gær har vist letale konsekvenser af ISCU homologer deletion [23]. Dette begreb fik os til at undersøge virkningerne af miR-210 på apoptose i normoxi og hypoxi. Der var en slående forskel i virkningerne af mir-210 i disse modsatrettede betingelser. I normoxi, mimic-210 væsentligt forøget apoptose som målt ved annexin V-farvning, men i hypoxi, antagonisme af MIR-210 forøgede apoptose (figur 4A).

A

, apoptose (Annexin V + celler) blev målt i MCF7 (

venstre

) og HCT116 (

højre

) celler behandlet med miR-210-hæmmer eller efterligner, efter 48 timers udsættelse for 0,1% ilt eller normoxi. Middel ± S.E.M. er repræsentativt for 3 uafhængige forsøg (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).

B

, efter transfektion af MCF7-celler med røræg LNA eller mir-210 LNA og eksponeret for 0,1% oxygen eller normoxi (48 timer), blev cellerne genudpladet (100 og 500 celler /brønd). Efter en 12-dages inkubation blev kolonier fikseret, farvet, og de overlevende fraktioner blev beregnet baseret på udpladningseffektiviteten.

C

, overlevende fraktioner blev beregnet som i (

B

) i HeLa-celler, der blev transficeret med anti-ctrl eller anti-210 (Applied Biosystems /Ambion, Austin, TX, USA) og eksponeret for 0,01% oxygen eller normoxi. I alle koloniassays, gennemsnit ± S.E.M. er repræsentativ for 2 uafhængige forsøg udført i tre eksemplarer beskæftiger 2 forskellige plating tætheder. (** P 0,01, *** p 0,001).

D

, RT-PCR for ISCU og miR-210 i U87-xenotransplantater behandlet med anti-angiogene terapi (bevacizumab). Relativ udtryk for ISCU normaliseret til p-actin, miR-210 normaliseret til tre små nucleolar kontrol, RNU43, RNU44 og RNU48. Mean udtryk ± s.e.m. i 4 dyr /gruppe vises (** p 0,01, *** p 0,001).

For at vurdere effekten af ​​miR-210 på celleproliferation under hypoxiske betingelser blev en klonogene assay brugt med en låst nukleinsyre antagonist (LNA) mIR-210-molekyle (figur 4B). Selv om de fleste af reduktionen i clonogenicity i hypoxi klart via andre mekanismer, virkningerne af anti-210 resulterede i nedsat klonogene overlevelse i hypoxi, som vi også fundet i en mere hypoxi-resistent cellelinje, HeLa-celler (figur 4C).

In vivo undertrykkelse af ISCU af hypoxi og kliniske betydning af ISCU udtryk

Vi undersøgte, om ekspressionen af ​​ISCU genekspression blev reguleret in vivo, ved at studere humane tumorxenoplantater. Xenotransplantater af glioblastoma-cellelinien U87 blev behandlet med VEGF-inhibitor Avastin (bevacizumab), eller med vehikelkontrol. Immunhistokemi af disse tumorer demonstrerede Avastin-induceret nekrose, ekspression af HIF1α og HIF målgener CA9 og VEGF (data ikke vist). Vi analyserede mRNA fra tumorer og fundet markant opregulering af miR-210 og gensidig nedregulering af ISCU mRNA (figur 4D).

De eneste data til sammenligning af miR-210 med ISCU RNA i humane tumorprøver er fra vores bryst og hoved og hals serien. Der var en meget signifikant omvendt forhold af miR-210 til ISCU udtryk i 216 patienter med brystkræft (rho = -0,39, p 0,001) (figur 5A,

venstre

). Der var en yderst signifikant omvendt korrelation af ISCU med mere aggressive høj kvalitet tumorer (p = 0,008) og en dårlig tilbagefald overlevelse (figur 5A,

højre

). I en multivariat analyse, ISCU forblev signifikant (p = 0,028), sammen med noder, klasse og alder (Støtte tabel S2). I to andre serier af brystkræft (Rotterdam [26], 286 tilfælde: Uppsala [27] 235 tilfælde) lav ISCU var en dårlig prognostisk faktor i multivariat analyse (Støtte Borde S3 og S4) (p = 0,038 og 0,015 henholdsvis). I Uppsala serien [27] vi kunne vurdere precursor MIR-210 under anvendelse af Affymetrix prober (Affymetrix U133b, 230710_at) og dette viste også et omvendt forhold af forstadiet til ISCU og ringe overlevelse (figur 5B). I vores hoved og halscancer serien [25], der var et omvendt forhold af disse variabler (figur 5C,

venstre

). I en serie med offentliggjort opfølgning, Chung et al [28], var der en stærk sammenslutning af undertrykt ISCU med dårligt resultat (figur 5C,

højre

). Analyse af udtryk i normale væv versus tumorvæv i 9 tumor datasæt ved hjælp Oncomine viste i alle studier undertrykkelse sammenlignet med normale væv (Støtte Figur S4).

En

, miR-210 qPCR udtryk (DDCT) plottet som funktion af ISCU mRNA-ekspression (Illumina arrays) i Oxford brystkræft serie (

venstre

), og, tilbagefald overlevelse for prøver med høj ISCU og lav ISCU split ved median i Oxford brystkræft serien (

rigtige

).

B

, mRNA udtryk for udskrift vært for miR-210 forløber plottet som funktion af ISCU mRNA-ekspression foranstaltning Affymetrix U133b og U133a henholdsvis i Uppsala brystkræft serien (

venstre

), og tilbagefald overlevelse for prøver med høj ISCU og lav ISCU delt af median i Uppsala brystkræft serie (

højre

).

C

, miR-210 qPCR udtryk (DDCT) plottet som funktion af ISCU mRNA-ekspression (Affymetrix arrays) i Oxford-Manchester HNSCC kræft serie, hvor ISCU blev oprindeligt fundet at være forbundet til hypoxi (

venstre

), og tilbagefald overlevelse for prøver med høj ISCU og lav ISCU delt af median værdi i Chung et al. HNSCC serien (

rigtige

).

Diskussion

Vores undersøgelser viser tydeligt miR-210 regulerer ekspressionen af ​​ISCU RNA og protein ved hjælp af den mimic i normoxi i kræft cellelinier. ISCU mRNA og protein blev undertrykt under hypoxi, og denne virkning var signifikant vendes ved anti-210. Den ufuldstændige vending indebærer andre mekanismer er også involveret i ISCU nedregulering, og det er velkendt, at RNA-oversættelse reduceres ved hypoxi via den udfoldede protein respons [29].

Et fald i ISCU ville forringe cellernes evne til at generere Fe-S klynger og vil efterfølgende påvirke aktiviteten af ​​enzymer, der kræver disse co-faktor-dele. Vi viste, at aconitase, et vigtigt enzym mellemmand stofskifte, der kræver Fe-S klynger, havde nedsat aktivitet efter reduktion ISCU. Af særlig relevans for kræft er den dobbelte rolle aconitase som IRP1 når den mangler sin Fe-S klynge. IRP1 regulerer stabilitet og translation af mRNA for transferrin og ferritin [24]. Virkningerne af tab af aconitase ville være at modificere jern metabolisme og øge dens optagelse, som er kritisk for tumorvæksten. Faktisk observerede vi en ophobning af intracellulært jern ved transfektion af celler med efterligne-210 eller siISCU.

Mutationer i ISCU giver anledning til laktatacidose hos personer efter moderat motion, der giver stærke beviser for vigtigheden af ​​dette mål i opretholde effektive Krebs cyklus aktivitet [30], [31]. En tilhørende effekt af nedsat ISCU niveauer og efterfølgende fald i Krebs cyklus aktivitet var et skift til glykolyse og forøget lactat-produktion. Dette blev induceret i normoxi af MIR-210 og dermed svarer til Warburg virkning. Dette kan være relevant i situationer, hvor miR-210 opregulering sker i normoxi. For eksempel er dette blevet vist hos nyre cancer cellelinjer med mutationer i von Hippel Lindau-protein [14]. Omvendt i hypoxi, anti-210 reduceret laktat produktion, vende Pasteur-effekten (skift til glykolysen i hypoxi).

Jern-svovl klynger er integreret til effektiv aktivitet af den mitokondrielle elektron transportkæden. Vi har vist, at Kompleks I-aktivitet formindskes under hypoxi og ved transfektion af mimic-210 i normoxi. Ud over Complex I, Komplekser II og III indeholder også Fe-S klynger og vi spekulere, at aktiviteterne i alle tre komplekser kunne være nedsat i en miR-210 afhængig måde. En svækket elektrontransportkæden ville føre til en stigning i produktion af frie radikaler som følge af elektron lækage. Især kompleks III er en stor bidragyder til ROS i hypoxi [32] og kompleks I og II bidrager omkring 30% af ROS [33]. I normoksiske betingelser, transfektion af mimic-210 førte til forøget produktion af frie radikaler. Endvidere normoxiske ROS produktion observeret med mimic-210 blev næsten fuldstændig forhindret med en MIR-210 resistent ISCU konstrukt. Omvendt i hypoxi, vi observerede, at induktionen af ​​MIR-210 blev associeret med en stigning i ROS, og dette kunne næsten helt omvendt af anti-210. Dette tilvejebringer en vigtig ny link for at forklare den mekanisme af ROS induktion i hypoxi, som er blevet beskrevet af flere grupper [33] og kan forklare størstedelen af ​​hypoxisk ROS induktion. ROS udgivet i hypoxi har vist sig at fungere som O

2 sensorer, som signalerer midler, som aktiverer HIF [32], mediere tumorvækst in vivo via en HIF afhængig mekanisme [5] og forlænge levetiden af ​​celler [34] .

i modsætning til den hypoksiske induktion af ROS og lindring med anti-210 observeret i vores undersøgelse, Chan et al. kunne ikke måle nogen væsentlig ændring i ROS produktion efter eksponering for hypoxi, og viste en omvendt tendens, når miR-210 blev hæmmet [20]. Årsagen til denne uoverensstemmelse er uklar, men kan potentielt afspejle en underliggende forskel i kræft sammenlignet med normale endotelceller.

Endelig har vi analyseret, om der var nogen sammenslutning af ISCU nedregulering i primære humane kræftformer med hypoxi og resultat, og fundet en aggressiv fænotype var forbundet med denne ændring i studier af over 1000 patienter, og nedregulering sammenlignet med normale væv i mange tumortyper.

Som konklusion, vi har fundet en stor ny mekanisme for respons af kræftceller til hypoxi, koordineres af miR-210 undertrykkelse af ISCU og den efterfølgende nedgang i aktiviteten af ​​jern-svovl klynge proteiner (Støtte Figur S5). Udover aconitase, mange metaboliske enzymer kræver Fe-S klynger for deres aktivitet tyder på, at nedregulering af ISCU ville have vidtrækkende konsekvenser for cellens stofskifte. Mutationer i mange af disse Fe-S cluster-enzymer, herunder succinatdehydrogenase underenheder SDHD, SDHB og SDHC [35] og fumarat hydratase [36] er impliceret i hyperproliferative lidelser og kræft, viser en vigtig forbindelse mellem cellulær metabolisme og efterfølgende transformation og fremhæver en rolle for HIF via en mIR-210-ISCU aksen i disse processer. Ud over metaboliske enzymer, flere DNA reparation enzymer [37] med Fe-S klynger er potentielt mål. Vi har tidligere vist, miR-210 kan påvises ved en forhøjet niveau i serum af kræftpatienter [38], så det vil være af interesse, hvis de afspejler den metaboliske tilstand af deres primære cancer og dermed kunne bruges i fremtiden terapi valg. Reguleringen af ​​distinkte biologiske veje ved ISCU nedregulering foreslår en potentiel terapeutisk tilgang af syntetisk letalitet hvorved lægemidler, der medierer DNA skader repareret af jern-svovl klynge indeholder helicaser Rad3 [39] eller Fanconis anæmi [37] kunne være brug i synergi med PARP-inhibitorer eller hæmmere af glykolysen [36] og glutaminolysis i undergruppen af ​​patienter med højeste miR-210 niveauer.

Mens dette arbejde var under forberedelse, blev tre nye miR-210 mål valideret, dvs. HOXA1, HoxA9 og FGFRL1 og analysen af ​​tumorxenoplantater afledt af kræft cellelinjer overekspression miR-210 foreslog en potentiel involvering af miR-210 i tumorvækst initiering [40].

Materialer og metoder

Cell kultur

Cell eksponering for hypoxi (1%, eller 0,1%, eller 0,01% oxygen) blev foretaget i en hypoxi inkubator (MiniGalaxy a, RS Biotech, Scotland, UK), ved hjælp af en kontinuerlig strøm af en befugtet en blanding af 95% N

2 og 5% CO

2.

miRNA mimic eller hæmmer transfektion

transfektion blev udført med Dharmacon anti-210, MIR-210 efterligner eller kontrol oligoer (Thermo Scientific, CO, USA), ved en slutkoncentration på 20 nM, under anvendelse Optimem serum-frit medium og Oligofectamine reagens (begge fra Invitrogen, Paisley, UK) ifølge producentens protokol.

Transfektion og luciferase assays

Luciferase reporter plasmider, der indeholder 3′-utranslaterede regioner (UTR) af ISCU eller tilfældige genomiske sekvens (kontrol) blev indhentet fra sWITCHGEAR Genomics (Menlo Park, CA. En Renilla luciferase-ekspressionsplasmid (pRL-TK vektor, Promega, Southampton, UK) blev anvendt som transfektion kontrol.

enzymaktivitetsassays

aconitase aktivitet var ved hjælp af Bioxytech aconitase-340-assay (Oxis International Inc, Beverly Hills, CA). Data er præsenteret som% af aktivitet sammenlignet med kontrol.

Celler blev analyseret for Kompleks I-aktivitet under anvendelse af Mitoprofile Complex I Rapid ELISA Kit (MitoSciences, Eugene, OR, USA) ifølge producentens instruktioner. Data er præsenteret som% af aktiviteten i forhold til kontrol.

laktat og pyruvat målinger

laktat og pyruvat blev analyseret ved hjælp af kits fra Instruchemie (Delfzijl, Holland).

MitoSOX farvning

mitokondrie superoxid blev analyseret under anvendelse MitoSOX Red (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Billeder blev erhvervet med konfokal mikroskop (Radiance 2000, Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Herts, UK), og analyseret som beskrevet tidligere [41].

Genekspression data-mining

Vi har tidligere udledt en hypoxi metagene i primær hoved- og halscancer pladecellekræft [HNSCC] [25]. Klynger af gener anti-korreleret til MIR-210-ekspression blev dannet som beskrevet tidligere [25]; Spearman korrelation blev anvendt til at identificere gener signifikant anti-korrelerede MIR-210 og falsk opdagelse sats (FDR) blev estimeret ved anvendelse af en permutation-metode [42]. Gener med FDR 0,05 blev udvalgt. Vi brugte også 5 mål forudsigelse algoritmer: – TargetScanHuman (https://www.targetscan.org/); Pictar [43]; Miranda (https://microrna.sanger.ac.uk/); DianaLab (https://diana.cslab.ece.ntua.gr/), miRDB (https://mirdb.org/miRDB/).

Overlevelse analyser og andre statistiske analyser

Spearman korrelation blev anvendt til kontinuerlige variabler og Wilcox test for kategoriske variable.