PLoS ONE: perineurale mastceller Specielt Beriget i pancreas Neuritis og neuropatisk smerte i kræft i bugspytkirtlen og kronisk Pancreatitis

Abstrakt

Baggrund

bugspytkirtlen neuritis er en histopatologisk kendetegnende for pancreas neuropati og korrelerer til abdominal neuropatisk smerte sensation i pancreas adenocarcinom (PCA) og kronisk pancreatitis (CP). Men inflammatoriske celle undertyper, som udgør bugspytkirtlen nervebetændelse og deres korrelation til den neuropatisk smerte syndrom i PCa og CP er endnu ukendt.

Metoder

Inflammatoriske celler i bugspytkirtlen neuritis læsioner af patienter med PCa (n = 20) og CP (n = 20) blev immunmærket og kolorimetrisk kvantificeret med den pan-leukocyt markør CD45, med CD68 (makrofager), CD8 (cytotoksiske T-lymfocytter), CD4 (T-hjælper celler), CD20 (B-lymfocytter ), NCL-PC (plasmaceller), neutrofil elastase, PRG2 (eosinofiler), anti-mastcelle (MC) tryptase og korreleret til smerte sensation. Perineurale mast cell undertyper blev analyseret ved dobbelt immunmærkning med MC chymase. Expression og neurale immunoreaktivitet af protease-aktiveret receptor type 1 (PAR-1) og type 2 (PAR-2) blev analyseret i PCa og CP og korreleret til smerte status af patienterne.

Resultater

i PCa og CP blev nerver overvejende infiltreret af cytotoksiske T-lymfocytter (PCA: 35% af alle perineurale inflammatoriske celler, CP: 33%), makrofager (PCA: 39%, CP: 33%) og MC (PCA: 21%, CP: 27%). I begge enheder, blev neuropatisk smerte sensation forbundet med en bestemt stigning i perineurale MC (PCA uden smerter: 14% vs. PCa med smerte: 31%; CP uden smerter: 19% vs. CP med smerte: 34%), ikke påvirker frekvensen af ​​andre inflammatoriske celler undertyper. Langt størstedelen af ​​disse MC indeholdt MC chymase. PAR-1 og PAR-2-ekspression korrelerede ikke til den smerte sensation PCA og CP-patienter.

Konklusion

Bugspytkirtelkræft neuritis i PC og CP er sammensat af cytotoksiske T-lymfocytter, makrofager og MC. Den specifikke berigelse af MC omkring intrapankreatiske nerver i neuropatisk smerte på grund af PCa og CP tyder på tilstedeværelsen af ​​MC-induceret visceral hypersensitivitet i bugspytkirtlen. Derfor pancreas og enteriske neuropatier synes at dele en lignende type neuro-immun interaktion i dannelsen af ​​visceral smerte

Henvisning:. Demir IE, Schorn S, Schremmer-Danninger E, Wang K, Kehl T, Giese NA et al. (2013) perineurale mastceller Specielt Beriget i pancreas Neuritis og neuropatisk smerte i kræft i bugspytkirtlen og kronisk betændelse i bugspytkirtlen. PLoS ONE 8 (3): e60529. doi: 10,1371 /journal.pone.0060529

Redaktør: Anthony WI. Lo, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: 15. december, 2012; Accepteret: 27 februar 2013; Udgivet: 28 Mar 2013

Copyright: © 2013 Demir et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Inflammation og cancer er flettet sammen i generation, kursus og resultatet af menneskelige maligniteter. En specifik og unik undertype af cancer-relaterede inflammation stødes omkring nerverne i pancreas tumorer, især i pancreascancer (PCA) og i den inflammatoriske pancreas hoved tumor forbundet med kronisk pancreatitis (CP). Faktisk begge disse tumorer ofte indeholde fokale inflammatoriske celle klynger omkring intrapankreatiske nerver [1], [2]. I sin skelsættende elektron-mikroskopiske undersøgelse om nerverne i CP, Dale Bockman rapporteret om forekomst af alvorlige skader i sådanne nerver, der specifikt blev infiltreret af inflammatoriske celler [3]. Senere undersøgelser foretaget den afgørende bidrag relateret til betydningen af ​​denne målrettede neural immun celle infiltration betegnes

bugspytkirtlen neuritis

i PCA og CP patienter: Øget hyppighed og sværhedsgrad af pancreas neuritis har vist sig at bære en større korrelation til sværhedsgraden af mavesmerter sensation og neuroplastiske ændringer i PCa og CP patienter [1], [4], [5].

mekanismer i bugspytkirtlen nervebetændelse mangler at blive belyst. Med hensyn til de inflammatoriske mediatorer involveret i pancreas neuritis, interleukin-8 (IL-8), den neuronale kemokin fractalkin og dets receptor CX3CR1 har vist sig at være overudtrykt i nerver i CP væv og forøget endoneural fractalkin tilstedeværelse blev detekteret at korrelere med sværhedsgraden af pancreas neuritis, væv makrofag infiltration og smerte sensation [6] – [8].

de nøjagtige undertyper og karakteristika for de immunceller infiltrerer pancreas nerver er endnu ukendt. I den eneste undersøgelse relateret til dette spørgsmål, Keith et al. påvist i en semi-kvantitativ måde den øgede tilstedeværelse af eosinofiler omkring nerverne i CP og sammenhængen mellem smerte sensation og omfanget af perineurale eosinofil infiltration [9].

En bedre forståelse af karakteristika perineurale inflammatoriske celleinfiltrat i PCa og CP vil være muligt en dyb indsigt i mekanismerne i bugspytkirtlen neuritis. Derfor, i den foreliggende undersøgelse, vi sigter mod at give en systematisk kvantitativ karakterisering af pancreas neuritis-associeret inflammatorisk celle klynger i PCa og CP. Til dette formål, vi kvantificeret peri- og endoneural leukocytter i normalt humant bugspytkirtlen (NP), PCa og CP. Endvidere undersøgte vi den kvantitative fordeling af et stort panel af leukocyt subset markører i PCa og CP væv, herunder CD68 (makrofager), CD8 (cytotoksisk T-lymfocytter), CD4 (T-hjælper celler), CD20 (B-lymfocytter), NCL-PC (plasmaceller), neutrofil elastase, proteogylcan 2 /PRG2 (eosinofiler) og anti-mastcelle (MC) tryptase og chymase inden neurale inflammatoriske klynger. Endelig har vi korreleret mængden af ​​disse neurale inflammatoriske celleundergrupper, og ekspressionen af ​​to potentielle receptorer (protease-aktiveret-receptor /PAR-1 og PAR-2) for MC-afledte proteaser til neuropatisk smerte sensation PCa og CP-patienter .

Materialer og metoder

Etik erklæring

undersøgelsen blev godkendt af de etiske komitéer i Technische Universität München, München, Tyskland og universitetet i Heidelberg, Tyskland.

patienter og væv

pancreas vævsprøver til immunohistokemi blev indsamlet fra patienter efter bugspytkirtlen hoved resektion for kræft i bugspytkirtlen (PCA, n = 20; mand /kvinde = 8/12, median alder = 66 år ) og kronisk pancreatitis (CP, n = 20; mand /kvinde = 13/7, median alder = 51 år). Alle patienter blev informeret, og skriftligt samtykke blev opnået for væv samling. Ifølge den internationale klassificering af UICC (2009), havde alle patienter stadie IIb kræft i bugspytkirtlen. Ætiologien for CP var alkoholisk hos alle patienter. På grund af hyppigt observeret samtidig inflammatorisk proces på resektionsrandene af pancreas vævsprøver blev normale pancreas vævsprøver opnået fra raske organdonorer (NP, n = 10; mand /kvinde = 6/4, median alder = 38 år), når der var nogen egnet modtager til transplantation til rådighed. Samlingen væv blev godkendt af de etiske komitéer i Technische Universität München, München og University of Heidelberg, Tyskland. De resektion pancreas vævsprøver blev opdelt i dele, som straks blev fikseret i 4% paraformaldehyd efterfulgt af paraffin-indlejring, som tidligere beskrevet [1], [10].

Mavesmerter

I alt PCA og CP patienter, den enkelte smerte status (Pain vs ingen smerter) og den individuelle smerte score (smerteintensitet og frekvens) blev prospektivt registreret inden operationen, som tidligere beskrevet [2]. Smerteintensitet blev gradueret ved hjælp af en kort skala: 0 = ingen, 1 = mild, 2 = moderat og 3 = stærk smerte. Smerter frekvens blev klassificeret som 3 = dagligt, 2 = ugentligt og 1 = månedligt. At beregne graden af ​​smerte, blev smerteintensiteten og smerte hyppigheden af ​​hver enkelt multipliceret. Ifølge den endelige smertescore blev patienterne opdelt i tre undergrupper: Pain I (0), som repræsenterer gruppen af ​​patienter uden smerter, Pain II (1-3) patienter, der led af mild smerte og smerte III (4-9), med moderate til svære smerter

Immunohistokemi dobbelt immunofluorescens mærkning

Konsekutive 3 um snit fra paraffinindlejrede NP, PSA og CP blev analyseret for den pan-neuronal markør Protein Gene Product 9.5 (PGP 9.5) og for inflammatoriske celleoverflademarkører, herunder klynge af differentiering 45 (CD45) som pan-leukocyt markør, CD8 som markør af cytotoksiske T-lymfocytter, CD4 at mærke T-hjælper lymfocytter, CD68 som markør af makrofager, neutrofile elastase (NE) for neutrofile granulocytter, CD20 for B-lymfocytter, NCL-pc til plasma celler, PRG2 for eosinofiler og anti-mastcelle (MC) tryptase og anti-MC chymase at identificere mastceller. Proteasen-aktiveret receptor type 1 (PAR-1) og type 2 (PAR-2) blev immunolabeled i yderligere konsekutive sektioner. Snittene blev inkuberet med de primære antistoffer ved de angivne fortyndinger natten over i et fugtigt kammer ved 4 ° C (tabel 1). De negative kontroller blev inkuberet med det samme IgG eller IgM subklasse ikke-immuniserede antistoffer. Primært antistof-fortyndinger blev udført med normalt gedeserum. blev påvist Alle antigener gennem DAKO Envision System-HRP (Hamborg, Tyskland) eller ved Alexa Fluor

® 488 og 594 antistoffer (Invitrogen, Tyskland) til de matchende arter. DAB blev anvendt som kromogen. Digital billedbehandling blev udført med Keyence Biorevo BZ-9000-system (Keyence, Neu-Isenburg, Tyskland).

Kvantitativ analyse af inflammatorisk celle fordeling omkring nerverne

For at bestemme mængde af inflammatoriske celle undertyper omkring intrapankreatiske nerver, blev immunfarvet område besat af hver celle undertype inden neurale inflammatoriske celleklynger målt via ImageJ software (ImageJ 1.36b, Wayne Rasband). Til dette formål fra hver sektion af en patient, mellem tre og fem nerver demonstrerer pancreas neuritis blev først identificeret og efterfølgende fotograferet ved hjælp af et fortløbende PGP9.5-farvede sektion og en konsekutiv hematoxylin-eosin-farvede sektion. Pancreas neuritis blev histologisk defineret og identificeret som “en klynge af neurale inflammatoriske celler, som er i kontakt med perineuriet og /eller endoneurium og kan klart afgrænset fra den resterende generelle væv inflammatorisk celleinfiltrat”. Efter konvertering af RGB-billede til en 8-bit billede, blev tærskel funktion, der bruges til at definere en fase ved hjælp af en forudindstillet tærskel, der udelukkende etiketter området besat af immunfarvet neurale inflammatoriske celler, og softwaren bestemmes automatisk det absolutte og pct område af fasens på hvert billede, som også er beskrevet tidligere [10]. De absolutte områder målt på hvert billede for immunoreaktiviteten af ​​CD8, CD4, CD68, CD20, NCL-PC, PRG2, NE, anti-MC-tryptase og -chymase blev derefter relateret til, at der for CD45 som pan-leukocyt markør for at bestemme fordelingen af ​​inflammatoriske celle-undergrupper i pancreas neuritis cellepopulation. Den fotografere og efterfølgende kvantitativ analyse blev udført af tre observatører (SS, IED og ESD) blindede kliniske og immunhistokemiske data, som tidligere beskrevet [1].

Real-time Light Cycler® Quantitative-polymerase-kæde- reaktion (QRT-PCR)

Ekstraktion af mRNA fra pancreasvæv blev fremstillet ved anvendelse af TissueLyser II og RNeasy plus (Qiagen /Hilden) ifølge producentens instruktioner. Efterfølgende blev RNA mængde og renhed bestemmes ved hjælp NanoDrop ND1000 (Peqlab /Erlangen). Første streng cDNA-syntese blev udført med Transcriptor-First-Strand cDNA Synthesis kit (Roche /Mannheim) ifølge producentens instruktioner. Ekspression af protease-aktiverede-receptor type 1 (PAR-1, GeneBank, GeneID: 2149), protease-aktiverede receptor type 2 (PAR-2, GeneBank, GeneID: 2150) og af referencen housekeeping-genet cyclophilin-B (CypB , GeneBank, GeneID: 5479) blev målt med Roche LightCycler-480 Real-Time PCR System og LightCycler-480 SYBR Green i Master kit. I overensstemmelse med Pfaffl metoden [11], blev relative ekspression baseret på gennemsnitsværdien grænseovergang afvigelse mellem de 3 prøver normaliseredes til middel grænseovergang afvigelse for referencen genet, efter effektivitet korrektion af PCR-reaktionerne. Den relative ekspression af PAR-1 og PAR-2 ​​i prøver blev derefter normaliseret til niveauet i normalt humant pancreas (NP). Alle primere blev opnået fra Sigma-Aldrich.

Kvantificering af neurale immunoreaktivitet for PAR-1 og PAR-2 ​​

På hver sektion, den gennemsnitlige neurale immunoreaktivitet for PAR-1 og PAR-2 ​​blev bestemmes via ImageJ-baserede kolorimetri, som også tidligere vist [10]. Kort fortalt blev immunmærket nerver med pancreas neuritis fra hver sektion med PCa eller CP photomicrographed og underkastes den tærskel funktion af software efter omdannelse til en 8-bit-billede. Den procent immunfarvet areal i hver nerve blev bestemt ved softwaren efter indstilling en bestemt tærskel i nerver som områder af interesse for hver farvning (dvs. PAR-1 og PAR-2) og svarede til neurale immunoreaktivitet. Middelværdien immunoreaktivitet for hver patient blev beregnet ved at bestemme den gennemsnitlige neurale immunoreactivitiy af alle nerver med pancreas neuritis hos hver patient.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført under anvendelse af GraphPad Prism 5 Software (La Jolla, CA, USA). For flere sammenligninger og på grund af den indbyrdes afhængighed af de målte celle undergruppe områder og procenter inden for en given neuritis befolkning, Friedmans test efterfulgt af Dunns post hoc test blev anvendt. Især blev denne test anvendt til sammenligning af de immunreaktive områder af inflammatoriske celleundergrupper, og også til sammenligning af deres relative (procent) portion i hver neuritis population. Til analysen af ​​PAR-1 og PAR-2-ekspression mellem NP, PCa og CP, og korrelationen af ​​neurale invasion med perineurale mast celle infiltration, blev Kruskal-Wallis-test i forbindelse med Dunns post hoc-test anvendes. Til sammenligning af immunoreaktiviteter af hver inflammatorisk celle undertype, og PAR-1 og PAR-2 ​​neuro-immunoreaktiviteter og ekspressionsniveauer mellem patienter med smerter og patienter uden smerte blev Mann-Whitney U-test anvendt. For disse to grupper smerter analyser blev den uparrede t-test yderligere anvendes til at bekræfte de observerede forskelle. For mastcelle delmængde analyse involverer tryptase-chymase co-lokalisering frekvens, blev Fishers eksakte test anvendt. Resultater udtrykkes som median (Minimum; Maximum) undtagen for mRNA-ekspression data der blev præsenteret som middelværdi ± standardfejl på middelværdien (SEM). To-sidet p-værdier var altid beregnet, og en effekt blev betragtet som statistisk signifikant på et

s

-værdi ≤ 0,05.

Resultater

intrapankreatiske nerver i PCa og CP overvejende infiltreret af cytotoksiske T-lymfocytter, makrofager og mastceller

som det vigtigste formål med den foreliggende undersøgelse, vi kvantificerede mængden af ​​leukocytter og leukocytsubpopulationer i bugspytkirtlen neuritis. Til dette formål blev området besat af hver leukocytundertype kvantificeret via kolorimetrisk analyse og udtrykt i um

2. I PCa blev pancreas neuritis immun celle population hovedsagelig består af CD68

+ makrofager [39,87% (10,15; 64,88) af alle perineurale inflammatoriske celler, 2545 um

2 (665,9; 22012)], efterfulgt af CD8

+ cytotoksiske T-lymfocytter [33,20% (21,06; 54,11), 2623 um

2 (586,5; 21.092)] og mastceller [MC, 14,46% (0,28; 52,10), 1106 um

2 (21,51; 16090), Figur 1A-C]. Vigtigere er det, alle andre store inflammatoriske cellepopulationer var til stede i næsten påviselige mængder [CD20

+ B-lymfocytter: 0,79% (0,10; 13,84) og 76,84 um

2 (3,06; 2598); CD4

+ T-hjælper celler: 1,61% (0,39; 28,45) og 83,03 um

2 (13.55; 2962); NCL-PC

+ plasmaceller: 1,87% (0,01; 10,54) og 140,9 um

2 (0,31; 986,9); PRG2

+ eosinofile: 0,49% (0,10; 19,77) og 38,71 um

2 (9.93; 888,8); Figur 1A-C)]. Den procent fordeling af leukocytsubpopulationer i pancreas neuritis i PCa er afbildet i figur 1C.

(A) Pankreatisk neuritis blev identificeret ved hjælp af et hematoxylin-modfarvet sektion som blev immunolabeled med den pan-neuronal markør PGP9. 5 eller ved hjælp af en hematoyxlin-eosin (H 11334)], CD68

+ makrofager [34,40% (1,562; 54,22) og 1852 um

2 (126,9; 11667)] og mastceller [24,16% (1,78; 56,63) og 2339 um

2 (221,1; 10155)] var mest udbredt i bugspytkirtlen neuritis læsioner (Figur 2A-C). De resterende inflammatoriske celle- undertyper blev kun lejlighedsvis detekteret omkring intrapankreatiske nerver [CD20

+ B-lymfocytter: 0,57% (0,07; 3,19) og 21,93 um

2 (1,27; 293,9); CD4

+ T-hjælper celler: 0,56% (0,16; 6,22) og 27,77 um

2 (5,38; 1325); NCL-PC

+ plasmaceller: 1,20% (0,05; 17,44) og 121,3 um

2 (2,08; 474,3); PRG2

+ eosinofile: 0,61% (0,13; 6,24) og 23,33 um

2 (2,41; 1384); Figur 2A-C]. Den procent fordeling af leukocytsubpopulationer i pancreas neuritis i CP er afbildet i figur 2C.

Ved kronisk pancreatitis, pancreascancer neuritis viste en lignende sammensætning pancreascancer, der omfatter CD68 + makrofager, CD8

+ cytotoksiske T-lymfocytter og mastceller (MC). “N” står for den identificerede nerve. Mellem tre og fem nerver med pancreas neuritis blev analyseret fra hver patient. Alle billeder ved 200x forstørrelse. Scale søjler indikerer 50 um.

neuropatiske smerter hos PCa er forbundet med specifikt øget mast celle infiltration omkring intrapankreatiske nerver

Et af hovedmålene med denne undersøgelse var at sammenligne fordelingen af de ovennævnte leukocytsubpopulationer blandt PCA patienter med og uden mavesmerter. Ser man på hele mængden af ​​leukocytter i de neurale inflammatoriske celle infiltrater, har PCA patienter med smerter ikke påvise nogen forskel i størrelsen af ​​den inflammatoriske cellepopulation pr nerve [7574 um

2 (3121; 36358)] i forhold til PCa patienter uden smerter [7320 um

2 (1155; 33793)]. Analysen af ​​inflammatoriske celle undertyper afslørede, at der var et skift i fordelingen af ​​kun en enkelt inflammatorisk celle delmængde blandt PCA patienter med smerter: Mængden af ​​perineurale mastceller blev specielt steget blandt PCA patienter med smerter [pcap, 30,96% (10,75; 52,10) og 3081 um

2 (21,51; 16090)] end blandt patienter uden smerter [PCaN, 13,41% (6,64; 26,29) og 777,6 um

2 (69,93, 3228),

s

0,05 Figur 3A-C]. Alle andre inflammatoriske celle undertyper ikke påvise nogen signifikant variation med smerten status PCA patienter [CD8

+ cytotoksiske T-lymfocytter i pcap: 32,22% (22,62; 42,07) og 2802 um

2 (116; 10933) vs . 39,57% (21,06; 54,11) og 2208 um

2 (586,5; 21.092) i PCaN; CD68

+ makrofager: 38,74% (21,21; 64,88) og 2628 um

2 (1214; 22012) i pcap vs. 40,99% (10,15; 53,00) og 2486 um

2 (665,9; 8097) i PCaN; CD20

+ B-lymfocytter: 0,77% (0,23; 5,11) og 70,64 um

2 (3,36; 2598) i pcap vs. 1,1% (0,10; 13,84) og 83,04 um

2 (3,06; 418,8) i PCaN; CD4

+ T-hjælper celler: 1,42% (0,39; 15,13) og 82,62 um

2 (30.62; 562,9) i pcap vs. 1,79% (0,41; 28,45) og 83,03 um

2 (13,55; 2962 ) i PCaN; NCL-PC

+ plasmaceller: 2,08% (0,01; 8,61) og 245,4 um

2 (0,31; 986,9) i pcap vs. 1,46% (0,20; 10,54) og 69,83 um

2 (9,50; 597,9) i PCaN; PRG2

+ eosinofile: 0,50% (0,14; 19,77) og 48,98 um

2 (10,75; 888,8) i pcap og 0,53% (0,10; 2,44) og 26,99 um

2 (9,93; 156,6) i PCaN ; Figur 3A-C). Den procent fordeling af leukocytsubpopulationer i bugspytkirtlen neuritis blandt PCA patienter med versus uden smerter er afbildet i figur 3C.

Pain status PCA patienter påvirkede ikke den relative fordeling af størstedelen af ​​perineurale inflammatoriske celle-undergrupper i PCa , men det var kun mastceller, som specifikt blev beriget omkring intrapankreatiske nerver af PCA patienter med smerter sammenlignet med patienter uden smerter. “N” står for den identificerede nerve. Mellem tre og fem nerver med pancreas neuritis blev analyseret fra hver patient. Alle billeder ved 200x forstørrelse. Scale søjler indikerer 50 um.

neuropatiske smerter hos CP er karakteriseret ved øget perineurale mast celle infiltration og undertrykkelse af perineurale cytotoksiske T-lymfocytter i bugspytkirtlen neuritis

Selvom bugspytkirtlen neuritis først blev beskrevet i CP af nogle pionerstudier [5], [9], påvirkning af smerter ved fordelingen af ​​inflammatoriske celle-undergrupper i CP-associeret pancreas neuritis er bredt ukendt. Når vi sammenlignet mængden af ​​leukocytter omkring intrapankreatiske nerver i CP patienter med vs uden smerte, der var interessant mindre mængder af perineurale inflammatoriske celler blandt CP patienter med smerter [(CPP, median perineurale CD45-immunreaktivt område: 4333 um

2 (1118; 10375)] end blandt CP patienter uden smerter [(CPN, median perineurale CD45-immunoreaktivt område:. 9831 um

2 (1687; 25685)] Denne krympning af perineurale inflammatoriske celle infiltrere i CPP blev ledsaget af en specifik stigning i den relative andel af mastceller i denne inflammatoriske celle andel [CPP: 36,93% (10,92; 56,63) vs. CPN: 20,25% (1,78; 37,22)], men ikke i de absolutte mængder af perineurale mastceller [CPP: 1546 um

2 (455,8; 3129) vs. CPN:. 2833 um

2 (221,1; 7396)] Endvidere er både absolutte og den relative mængde af CD8

+ T-lymfocytter blev formindsket i smertefulde CP [CPP: 22,35% (12.27, 78,97) og 768,6 um

2 (142,7; 11334) vs. CPN: 37,32% (28,31; 48,09) og 3628 um

2 (653,0; 7365)]. Der var ingen yderligere større ændringer i de relative eller absolutte mængder af andre inflammatoriske celle undertyper blandt CP patienter med smerter [CD68

+ makrofager: 34,40% (5,57; 54,22) og 1409 um

2 (546,8; 4811) i CPP vs. 34,29% (1,56; 51,03) og 3129 um

2 (126,9; 6613) i CPN; CD20

+ B lymfocytter: 0,50% (0,07; 1,65) og 7,07 um

2 (1,27; 40,86) i CPP vs. 0,76% (0,08; 3,19) og 61,42 um

2 (2,57; 293,9) i CPN; CD4

+ T-hjælper celler: 0,50% (0,16; 4,10) og 14,47 um

2 (5,38; 208,3) i CPP vs. 0,87% (0,28; 6,22) og 46,73 um

2 (21,97; 351,2 ) i CPN; NCL-PC

+ plasmaceller: 1,06% (0,05; 6,32) og 49,05 um

2 (2,08; 264,0) i CPP vs. 2,38% (0,45; 17,44) og 151,5 um

2 (8,58; 474,3) i CPN; PRG2

+ eosinofile: 0,42% (0,15; 5,48) og 16,22 um

2 (2,41; 174,1) i CPP og 0,94% (0,13; 6,24) og 39,42 um

2 (3,34; 1384) i CPN ; Figur 4A-C)]. Den procent fordeling af leukocytsubpopulationer i pancreas neuritis blandt CP-patienter med versus uden smerter er afbildet i figur 4C.

Svarende til PCa, også i CP, patienter med smerter udviste større relative mængde af mastceller (MC ) omkring intrapankreatiske nerver end patienter uden smerter. Desuden var denne stigning i mængden af ​​perineurale MC parallelt med nedsat mængder af cytotoksiske CD8

+ T-lymfocytter omkring intrapankreatiske nerver. “N” står for den identificerede nerve. Mellem tre og fem nerver med pancreas neuritis blev analyseret fra hver patient. Alle billeder ved 200x forstørrelse. Scale søjler indikerer 50 um.

perineurale mast celle infiltration ikke korrelerer til neurale invasion i bugspytkirtelkræft

Neural invasion (NI) er en af ​​de histopatologiske kendetegnende for PCa og stødt i op til 100% af PCa prøver [12]. Som vi observerede en bestemt stigning i mængden af ​​perineurale MC i smertefulde PCa, en stort spørgsmål, der opstod på dette tidspunkt var, om perineurale MC infiltration også korrelerer til øget tumor invasion af nerver. Til dette formål, vi klassificeret sværhedsgraden af ​​NI i PCa prøver i tre kategorier ( “0 /ingen invasion”, “I /peri-neural invasion” og “II /endo-neural invasion” [1]) og korreleret NI sværhedsgrad til den relative mængde af perineurale MC. Her var der ingen sammenhæng mellem perineurale MC infiltration og stigende sværhedsgrad af NI i PCa [ingen invasion /Grade 0: 15,73% (3,08; 65,16), peri-neural invasion /Grade I: 14,79% (0,34; 51,71) og endo- neural invasion /Grade II:. 37.67% (17,65; 60,05),

s

= 0,08, figur 5]

intrapankreatiske nerver i PCA væv blev undersøgt for tilstedeværelsen af ​​neural invasion (NI) og klassificeret i NI grader “0 /nej invasion”, “1 /peri-neural invasion” og “2 /endo-neural invasion). I vores kohorte, har de relative perineurale mast celle beløb, der ikke adskiller sig mellem de forskellige grader af NI i humant PSA. Resultaterne er præsenteret som median (minimum maksimum)

Expression og neurale immunoreaktivitet af PAR-1 og PAR-2 ​​i PCa og CP

Neuroner kan blive sensibiliseret ved virkningen af. thrombin på protease-aktiveret receptor type 1 (PAR-1) eller af MC-afledte proteaser (såsom tryptase) efter protease-aktiveret receptor type 2 (PAR-2) [13]. Som vi bemærkede markant forhøjede mast celle mængder omkring intrapankreatiske nerver i PCa og CP, vi kvantificeret også niveauerne af PAR-1 og PAR-2 ​​i disse væv og derudover i intrapankreatiske nerver. Her, sammenligning af mRNA-ekspression for PAR-1 og PAR-2 ​​i NP, PCa og CP viste ingen væsentlig forskel i niveauerne af disse receptorer (figur 6A). Tilsvarende, når PCA og CP-patienter blev stratificeret i “ingen smerte” og “smerte” grupper, mRNA-niveauerne af disse receptorer var ikke forskellige mellem de to grupper (figur 6B-C). Når de neurale immunoreaktiviteterne af disse receptorer blev sammenlignet mellem patienter med og uden smerter, PCA patienter med smerte tendens til at udvise en lidt større immunoreaktivitet for PAR-1 [3,272% (0,20; 9,44)] end dem uden smerter [1,22% (0,14; 5,57), Figur 6D]. Der var imidlertid ingen forskel i PAR-2 ​​immunoreaktivitet i PCA patienter med smerter [11,06% (4,45; 17,23)] versus uden smerter [11.90% (1,843; 28,64), (figur 6D)]. Tilsvarende smertestatus CP-patienter havde ingen indflydelse på den neurale immunreaktivitet for PAR-1 eller PAR-2 ​​i vores kohorte (figur 6E).

(A) Ekspression af PAR-1 og PAR-2 ​​var sammenlignet mellem normal menneskelig bugspytkirtlen (NP), CP og PCA væv via QRT-PCR og adskilte sig ikke mellem disse tre enheder. Ekspression blev normaliseret først til husholdning gen cyclophilin B og derefter til NP. (B) I PCa havde de væv niveauer af PAR-1 og PAR-2 ​​ikke forskellig patienter med smerter versus patienter uden smerter. (C) På lignende måde, også i CP, var der ingen forskel i vævet mRNA niveauer af PAR-1 og PAR-2 ​​hos patienter uden smerter versus med smerter. (D) intrapankreatiske nerver i PCa blev analyseret for immunreaktivitet for PAR-1 og PAR-2 ​​og korreleret til smertestatus patienter. Her blev smerte sensation ikke forbundet med forskelle i immunreaktivitet af intrapankreatiske nerver for PAR-1 eller PAR-2. (E) Analogt med PCa, også i CP, patienter med smerter udviste lignende immunoreaktiviteter i nerver til PAR-1 og PAR-2 ​​som patienter uden smerter.

neuropatisk smerte-associerede perineurale mastceller i PCa og CP er MC

TC-type mastceller

Hos mennesker kan MC klassificeres på grundlag af deres mægler indhold i to kategorier: MC

T-typen mastceller, der indeholder heparin og tryptase, og MC

TC-type mastceller som yderligere indeholde det proteolytiske enzym “chymase” [14]. For at bestemme den fremherskende mast celle fænotype i PCa, CP og NP, vi udførte dobbelt-immunofluorescens mærkning i pancreas væv mod mastcelletryptase og mast-chymase. I NP, mastceller var næsten ikke påvises på alle omkring intrapankreatiske nerver. I alle NP patienter, der indgik i analysen, kunne vi kun finde tre nerver, som viste en tæt rumlig sammenhæng med inflammatoriske celler. Den dobbelte immunmærkning af disse mastceller viste, at alle disse celler indeholdt både tryptase og chymase [100% (100; 100)], hvilket klassificeres som MC

TC-type mastceller (figur 7A). På den anden side, både i PCa og CP, MC

TC typen mastceller blev igen den dominerende perineural mast cellefænotype (81,7 ± 4,9% og 77,0 ± 4,0%, henholdsvis), men begge sygdomsenheder indeholdt yderligere perineural MC

T type (tryptase-only) mastceller (18,3 ± 4,9% og 23,7 ± 4,0%, henholdsvis). Undergruppen analyse overvejer smerten status af patienterne viste en tilsvarende fordeling af perineurale MC

TC og MC

T typen mastceller i PCA patienter med smerter (MC

TC: 85,6 ± 6,4% og MC

T: 14,4 ± 6,4%) versus dem uden smerter (MC

TC: 77,4 ± 7,4% og MC

T: 22,6 ± 7,4%, figur 6A). I modsætning hertil CP patienter med smerter udstillet signifikant større andele af perineurale MC

TC-typen mastceller (MC

TC: 86,9 ± 4,4% og MC

T: 13,1 ± 4,3%,

p

0,0001) end CP-patienter uden smerter (MC

TC: 62,9 ± 6,4% og MC

T:. 37,1 ± 6,4%, figur 6A)

(A) human pancreas væv prøver fra NP, PCa og CP var dobbelt-immunolabeled for perineurale MC-tryptase (rød) og MC-chymase (grøn). I alle tre enheder, at langt størstedelen af ​​perineurale MC demonstrerede dobbelt immunoreaktivitet (gul overlay) for MC-tryptase og -chymase. I CP, der var signifikant større relative mængder af dobbelt-immunreaktivt MC blandt patienter med smerter end blandt dem uden smerter. Skalaen søjler hvide indikerer 100 um.