PLoS ONE: mekanismer, som Low Glukose Forbedrer Cytotoksicitet af Metformin for cancerceller Både in vitro og in Vivo

Abstrakt

Forskellige kræftceller udviser ændret følsomhed over for metformin behandling. Nylige undersøgelser tyder disse resultater kan skyldes til dels, at den fælles cellekultur praksis med at udnytte høj glucose, og når glucose sænkes, metformin bliver stadig cytotoksiske for cancerceller. Ved lave glukose betingelser spænder fra 0 til 5 mM, metformin var cytotoksisk for brystkræft cellelinier MCF7, MDAMB231 og SKBR3, og æggestokkene kræft cellelinjer OVCAR3, og PA-1. MDAMB231 og SKBR3 blev tidligere vist sig at være resistente over for metformin i normale høje glucose-medium. Når glucose blev forøget til 10 mM eller derover, alle disse cellelinjer bliver mindre reagerer på metformin behandling. Metformin behandlingen reducerede ATP-niveauer i celler inkuberet i medier med lav glucose (2,5 mM), høj fructose (25 mM) eller galactose (25 mM). Reduktioner i ATP-niveauer blev ikke observeret med høj glucose (25 mM). Dette blev opvejet af forbedret glykolyse gennem aktivering af AMPK når oxidativ fosforylering blev hæmmet af metformin. Dog forbedret glykolyse var enten formindsket eller afskaffes ved at erstatte 25 mM glucose med 2,5 mM glucose, 25 mM fruktose eller 25 mM galactose. Disse resultater tyder på, at sænkning glukose potenserer metformin celledød ved at reducere metformin stimuleret glykolyse. Derudover under lave glukose betingelser metformin faldt betydeligt phosphorylering af AKT og forskellige mål for mTOR, mens phospho-AMPK ikke var signifikant ændret. Således inhibering af mTOR signalering ser ud til at være uafhængig af AMPK aktivering. Yderligere in vivo-undersøgelser under anvendelse af 4T1 brystkræft musemodel bekræftede, at metformin inhibering af tumorvækst blev forstærket, når serumglucoseniveauer blev reduceret via lav kulhydrat ketogene diæter. Dataene understøtter en model, hvor metformin behandling af cancerceller i lav glucose-medium fører til celledød ved at sænke ATP-produktion og inhibering af overlevelse signalveje. Den forbedrede cytotoksicitet af metformin mod kræftceller blev observeret både in vitro og in vivo

Henvisning:. Zhuang Y, Chan DK, HAUGRUD AB, Miskimins WK (2014) mekanismer, som Low Glucose Forbedrer Cytotoksicitet af Metformin til Cancer Cells Både

In vitro

In Vivo

. PLoS ONE 9 (9): e108444. doi: 10,1371 /journal.pone.0108444

Redaktør: Viji Shridhar, Mayo Clinic College of Medicine, USA

Modtaget: 13 juli, 2014 Accepteret: August 29, 2014; Udgivet: 25 September, 2014

Copyright: © 2014 Zhuang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet gennem tilskud KG100497 (W.K. Miskimins) fra Susan G. Komen for Cure. Seahorse XF24 eksperimenter blev støttet af COBRE award 5P20GM10358 (W.K Miskimins) fra National Institute of General Medical Sciences på National Institutes of Health. Projektet blev også støttet delvist af en COBRE pilot award (Y. Zhuang) og PHS tilskud 1R01CA180033-01 (W.K. Miskimins) fra National Cancer Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i transformationen til kræft, celler undergår omprogrammering af deres almindelige metaboliske funktioner for at lette hurtig vækstpotentiale. Otto Warburg rapporterede høje glykolysen i kræftceller, selv i aerobe forhold. Denne paradoksale ændring er en mekanisme, hvorved cancerceller har tilpasset til hurtig spredning. Som følge af denne ændrede metabolisme, cancerceller bruge store mængder glucose og generere store mængder af lactat. Glucosemetabolisme gennem glycolysen bidrager til ATP-syntese og giver mellemprodukter for andre biosyntetiske processer. Således kræftceller er afhængige af den høje glukoseoptagelse og metabolisme for overlevelse [1], [2].

Aktuelle metoder til

in vitro

kræft cellekultur almindeligt brug høj glukose, 25 mM (450 mg /dl), i vækstmediet. Mens høj glucose medium skaber et optimalt miljø for cancercelleproliferation, kan disse blodsukkerniveauet komplicere fortolkningen af ​​lægemiddel virkningsundersøgelser. Høj glucose alene har evnen til at aktivere sprednings veje i en cancercelle [2], og den konstante tilgængelighed af glucose placerer lidt af den normale stress cancerceller erfaring

in vivo

. I bugspytkirtelkræftceller, Sinnett-Smith

et al

. [3] fandt, at metformin handlinger på AMPK aktivering blev forøget ved brug af 5 mM glucose medier i dyrkede celler.

Normalt serum glukose er normalt opretholdes mellem 4 og 6 mM (ca. 72-108 mg /dl). I tilfælde af lav tilgængelighed af næringsstoffer, kan serumglucoseniveauer falde til 2,5 mM (45 mg /dl), med vævsniveauer af glucose almindeligvis lavere. Reduktion glukosetilgængelighed er også blevet forsøgt som en kræftbehandling ved en række forskellige metoder. Ændring kost ved direkte kaloriefattige begrænsning eller fastende er blevet undersøgt som en metode til at reducere kræft vækst med nogle lovende resultater [4] – [6]. Generelt synes fastende at være mere effektiv end konstant kaloriefattige begrænsning på at reducere kræft vækst [5]. Udover kost modifikation, antidiabetiske lægemidler er et andet middel til sænkning plasmaglucose. I et klinisk studie, der sammenligner metformin effekt af de eksisterende type II diabetes medicin, blev metformin fundet til lavere koncentrationer plasma glucose med ca. 3 mM (55 mg /dl) fra niveauerne før behandling [7]. Men det er værd at bemærke, at metformin ikke få væsentlig indvirkning på reduktion af plasma glukose i ikke-diabetikere [8].

For nylig har metformin vundet fornyet interesse som en potentiel cancer terapeutisk og kemoterapi adjuvans. Metformin potentiale anticanceraktivitet var impliceret ved lavere forekomst af cancer hos type II diabetikere versus andre glucose kontrollerende lægemidler [9]. Denne effekt blev oprindeligt tilskrevet metformin s systemiske glukose og insulin regulerende egenskaber. Senere metformin viste sig også at inhibere cancervækst på celleniveau. Den anti-onkogen indsats for metformin er sandsynligvis en kombination af systemiske insulin kontrol effekter og direkte cellulære virkninger. Mange grupper har påvist metformin handling

in vitro

i en række forskellige cancertyper [10] – [14]. Men for at efterligne virkningerne af metformin

in vitro

, der observeres

in vivo

, høje koncentrationer, almindeligvis 5-20 mM, metformin er nødvendige. Nylige undersøgelser tyder disse resultater kan skyldes til dels, at den fælles cellekultur praksis med at udnytte høj glucose, og når glucose sænkes, metformin bliver stadig cytotoksiske for cancerceller [15], [16]. Yderligere blev carbonkilde til cancerceller fundet til signifikant kan ændre anti-cancer virkninger af metformin, når man sammenligner glucose til glutamin [17]. I denne undersøgelse cancerceller udsat for høj glutamin i fravær af glucose var meget mere følsomme for inhibering med metformin.

Mens den præcise mekanisme for metformin kræft cytotoksicitet forbliver ukendt, metformin systemiske aktioner sandsynligt kombinere med direkte cellulære aktioner at forbedre dens virkning på cancer cellevækstinhiberingen og kræft celledød. Her viser vi, at lav til normale glucoseniveauer, i modsætning til høje glucosebetingelser, forstærke virkningen af ​​metformin i bryst- og ovarie-cancer-cellelinjer. De mulige mekanismer for denne aktivitet udforskes. Disse observationer kan afsløre både mere relevante celle kultur teknikker til at studere metformin i kræft samt give indsigt i klinisk anvendelse af metformin som hjælpestof kræftbehandling.

Metoder

Kemi og reagenser

følgende kemikalier blev anvendt i denne undersøgelse: metformin (1, 1-dimethylbiguanide,), D – (-) – fructose, D – (+) – galactose, 2-deoxy-D-glucose, oligomycin (Sigma Chemical Co). Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med højt glucoseindhold (Hyclone), Gibco DMEM uden glucose (Life Technology), SYTOX Green Nucleic Acid Stain (Invitrogen), og ATP Assay kit (Invitrogen).

Cellekultur

humane cancercellelinier MCF7, MDAMB231, OVCAR3, PA-1, SKRB3, og humane mammae epitelceller MCF10A celler blev alle anskaffet fra ATCC og opretholdt i DMEM indeholdende 10% føtalt bovint serum med varierende glucoseniveauer og 1% penicillin- streptomycin ved 37 ° C under en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2. Alle cellelinier blev anvendt inden passage ti efter fra ATCC at sikre cellelinje autentificering.

Celledød under anvendelse Sytox Green nucleinsyrefarve

Celler blev udpladet i 96-brønds plader og behandlet med den angivne behandling for en eller to dage. Sytox Green nucleinsyrefarve (10 uM) blev tilsat direkte til cellerne i 96-brønds plader og inkuberet i 10 minutter. Pladen blev aflæst ved excitation /emission på 485 nm og 530 nm, med en 515 nm cutoff ved anvendelse af en fluorescenspladelæser (SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader, Molecular Devices, LLC). Fluorescens blev målt til opnåelse af antallet af døde celler. Efterfølgende at bestemme totale celleantal blev 0,4% Triton-X100 tilsat til hver prøve, og den blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur for at permeabilisere alle cellerne, og fluorescens ved 485/530 nm blev målt igen for at få den samlede celleantal .

ATP assay

Celler blev podet i plader med 6 brønde efterfulgt af inkubation i 24 timer. Behandling blev givet med frisk medium i 24 timer. Lige antal af celler blev lyseret i hver behandlingsgruppe og 10 pi blev anvendt fra hver prøve efter fabrikantens protokol for ATP assays (Invitrogen, ATP Bestemmelse Kit, A22066). Kort beskrevet blev 100 pi standard reaktionsopløsning måles i et luminometer til baggrund luminescens. Derefter 10 pi af lysatet supernatant blev tilsat til reaktionsopløsningen, og luminescens blev igen målt. Baggrund luminescens blev subtraheret fra prøve luminescens og resultaterne blev afbildet som gange ændring fra kontrolprøver.

Western blotting

Celler i 35 mm skåle blev skyllet en gang med PBS og lyseret ved tilsætning af natriumdodecylsulfat ( SDS) prøvepuffer [2,5 mM Tris-HCI (pH 6,8), 2,5% SDS, 100 mM dithiothreitol, 10% glycerol, 0,025% pyronin Y]. Lige store mængder protein fra hver behandlingsgruppe blev separeret på 10% eller 15% SDS-polyacrylamidgeler. Proteiner blev overført til Immobilon P-membraner (Millipore) under anvendelse af en halvtør Bio-Rad Trans-blot-apparat med en overførsel puffer af 48 mM Tris-HCI og 39 mM glycin. Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk eller 5% BSA i Tris-bufret saltvand [10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 150 mM NaCl] indeholdende 0,1% Tween-20 (TBS-T) i en time ved stuetemperatur. Membranen blev derefter inkuberet med det passende antistof i TBS-T indeholdende 5% fedtfri tørmælk eller 5% BSA i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C. Efter vask i TBS-T blev membranen inkuberet med det passende peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært antistof. Proteiner blev påvist ved anvendelse af Super Signal West Pico kemiluminescerende substrat (Pierce Biochemical). Anti-β-actin monoklonalt antistof (A5441, anvendt ved 1:10,000) blev indkøbt fra Sigma. Antistoffer mod phosphoryleret AKT på threonin 473 (# 05-669 bruges på 1:1000) blev købt fra Upstate Biotechnologies. Antistoffer mod AKT phosphoryleret ved threonin 308 (# 4056, anvendes på 1:1000), ATK (# 4691, anvendes på 1:1000), phosphoryleret S6K (# 9206, anvendes på 1:2000), S6K (# 9202, anvendes på 1:2000), PARP (# 9542, anvendes på 1:2000), spaltet PARP (# 9541, anvendes på 1:2000), AMPK phosphoryleret ved threonin 172 (# 2535, anvendes på 1:1000), og AMPK (# 2532, der anvendes ved 1:1000), kløvet Caspase 7 (# 9491, der anvendes ved 1:1000) købt fra Cell Signalling Technology. Sekundær peberrodsperoxidase-koblet anti-muse (# 31430, anvendes ved 1:5000) og anti-kanin (# 31460, anvendes ved 1:5000) IgG-antistoffer blev anskaffet fra Pierce Biochemical.

lactat assay

MCF7 blev udpladet i plader med 96 brønde og behandles som anført i 15 timer. Medium fra hver behandling blev opsamlet og testet for lactat koncentration under anvendelse af en L-lactat Assay Kit (Eton Biosciences Inc.). Celler blev talt under anvendelse Sytox Green farvning fremgangsmåde som tidligere beskrevet. Relative lactat niveauer blev opnået efter normalisering af totalt celle nummer.

Måling af Ekstra Cellular Forsuring Rate (ECAR) og Oxygen Forbrug Rate (OCR)

ECAR og OCR blev målt ved hjælp af en Seahorse XF24 analysator ifølge producentens instruktioner (Seahorse Bioscience). Kort beskrevet blev MCF7-celler udpladet med 40.000 celler /brønd i XF24-brønds plader. Celler blev behandlet som anført den næste dag. Inden de behandles med Søhest XF24 analysatoren blev cellerne vasket og ækvilibreret med puffer medium (D5030, Sigma) ved 37 ° C i en CO

2-fri inkubator i en time. Indledende målinger af ECAR og OCR blev opnået efterfulgt af tilsætning af forskellige koncentrationer af glucose (2,5 mM eller 25 mM), fruktose (25 mM) eller galactose (25 mM). ECAR og OCR blev yderligere målt følgende injektion af oligomycin og 2-deoxyglucose. Celleantal blev opnået ved trypsinbehandling celler og tælling under anvendelse af et hæmocytometer. ECAR og OCR blev afbildet efter normalisering af totalt celle nummer

In vivo

musestudier

Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle og nationale retningslinjer og regler.; protokollen blev godkendt af den institutionelle dyr pleje og brug udvalg på Sanford Research. Kort beskrevet anvendelse af en 25-gauge kanyle, Balb /C-mus blev subkutant injiceret med 1 x 10

5 celler i flanken (10 mus pr behandlingsbetingelse). Fire dage efter tumor celle injektion blev musene skiftet til en kalorie begrænset lav kulhydrat ketogen diæt (BioServ P3666) for KD gruppen (se nedenfor for detaljer om kost). Kontrolgrupperne forblev på normal mus chow (Teklad Global 18% Protein gnaver Diet) og blev fodret som libitum. Metformin (2 mg /mus) blev indgivet intraperitonealt dagligt begyndende 7 dage efter tumorinjektion. Tumorvolumen blev estimeret ved anvendelse af A

2 × B, hvor A er den større diameter, og B er den mindre diameter. Dyrene blev aflivet, når tumoren størrelse var større end 15 mm i sin største dimension, eller tumor volumen nå 3000 mm

3, eller når dyret var væsentligt afmagret.

Serum glukose måling

serumglucoseniveauer blev målt ved anvendelse halevenen blodet efter punktering af halen med en 25 gauge nål for at frembringe en dråbe blod til hver test. Glukose blev målt ved hjælp af et Bayer Contour Glucometer og glukose teststrimler.

Kost information

Den lave kulhydrat ketogen diæt blev købt fra BioServ (# F3666). Denne diæt giver kalorier fra protein, fedt og kulhydrater på ca. 4,6%, 93,4% og 2%, hhv. Alle mus fodres denne diæt blev underkastet 30% kalorieindhold begrænsning (7 kcal /dag /mus) startes 4

th dag efter tumorcelle-injektion. Kalorie begrænsning blev bestemt ved måling af vægten af ​​mad indtages hver dag. Den passende mængde af den ketogen diæt blev leveret hver dag på en petriskål i buret. Kalorier blev øget til 7,5 Kcal /dag /mus (25% restriktion) på dag 7 efter påbegyndelse af ketogenic kost for at forhindre vægttab. Kalorier blev yderligere forøget til 8 kcal /dag /mus på dag 11 efter initieringen af ​​ketogen diæt og holdt ved dette niveau indtil slutningen af ​​eksperimentet. De kontrol kost grupper blev fodret ad libitum på standard mus chow (Teklad Global 18% protein gnaver kost), der giver kalorier fra protein, fedt og kulhydrater på ca. 24%, 18%, og 58%, hhv.

Statistisk analyse

Fejl barer vist er standard afvigelser fra middelværdien af ​​mindst tre gentagelser. To-halede parvise Students

t

tests blev anvendt til at sammenligne to grupper.

P

værdier mindre end eller lig med 0,05 blev anset for at have betydning.

Resultater

Vores tidligere forskning har vist, at metformin er cytotoksisk for mange bryst- og æggestokkræft cellelinjer . Men nogle cellelinjer, såsom bryst-cellelinjer MDAMB231 og SKBR3 udstillet modstand mod metformin cytotoksicitet [14], [18], [19]. Tidligere forsøg blev udført i DMEM indeholdende 25 mM glucose, hvilket er betydeligt højere end normale fysiologiske betingelser i 4-8 mM. For at bestemme indflydelsen glucosekoncentrationen den har på cytotoksiciteten af ​​metformin, testede vi virkningerne af forskellige koncentrationer af glucose i dyrkningsmediet af cancerceller udsat for metformin behandling. Alle cellekulturer blev først fastholdt i høj glucose medium (25 mM glucose) og udpladet i 96-brønds plader for én dag, blev den næste dag celler behandlet med metformin (0 mM, 2 mM, 4 mM, 8 mM og 16 mM) i medium indeholdende forskellige koncentrationer af glucose (0 mM, 2,5 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM og 25 mM) i en dag. Som glucoseniveauer i mediet falde, metformin behandling signifikant øget procentdelen af ​​døde celler i MDAMB231, MCF7, og SKBR3 celler (figur 1A, 1B, 1C). Tidligere data viser, at der i høj glukose medium, både MDAMB231 og SKBR3 celler er resistente over for metformin behandling (8 mM) i op til tre dage [14], [18], [19]. I høje glucosebetingelser disse cellelinier, MDAMB231 og SKBR3, fortsatte med at være resistente over for metformin behandlinger op til 16 mM koncentrationer af lægemidlet. Men når blodsukkerniveauet blev reduceret til 2,5 mM eller mindre både MDAMB231 og SKBR3 viser en cytotoksisk reaktion på metformin behandling fra 4 mm til 16 mm.

Alle celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af metformin (0, 2 , 4, 8, 16 mM) i medium indeholdende forskellige niveauer af glucose (0, 2,5, 5, 10, 15, 25 mM) i en dag. Procentdelen af ​​døde celler blev bestemt ved anvendelse Sytox Green farvning. Metformin signifikant større procentdel af døde celler med faldende glucosekoncentration i (A) MDAMB231-celler, (B) MCF7-celler, og (C) SKBR3 celler, men ikke i (D) MCF10A celler. Data blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse.

Samtidig blev virkningerne af metformin ved forskellige koncentrationer af glucose undersøges i ikke-cancer human mammae epitelcellelinie MCF10A (figur 1D). I modsætning til de kræft cellekulturer, gjorde reduktion af glukose-koncentration ikke signifikant bevidstgøre MCF10A til metformin behandling løbet af denne periode. Denne forskel kan være et resultat af underliggende forskelle i glukosemetabolismen mellem normale mammae epitelceller og kræftceller.

For at teste, om disse virkninger på metformin cytotoksicitet anvendes på andre cancer celletyper, vi undersøgte også ovariecancerceller . På en tilsvarende måde, sænke glucose blev fundet at forøge cytotoksiciteten af ​​metformin i de ovarian cancer cellelinjer OVCAR3 og PA-1 (figur 2). Dette antyder, at sænke glukose flux i kræftceller kunne i høj grad styrke cytotoksicitet af metformin, og at denne effekt kan være stort set relevant for forskellige cancer celletyper.

A. Efter 48 timers behandlinger med metformin (5 mM, +) eller vehikelkontrol (H

2O, -), levende OVCAR3 celleantal blev bestemt ved tælling trypanblåt negative celler og døde celler blev bestemt ved at tælle trypanblåt-positive celler. B. PA-1 celledød blev bestemt som beskrevet i A. fasekontrast billeder (40x) af celler dyrket med (nederste billede) eller uden (øverste billede) metformin behandling. Bar grafer repræsenterede middelværdi ± standardafvigelse. Alle metformin behandlede grupper i medium, der indeholder lav glukose (1 mM) var signifikant forskellige fra deres kontrolgrupper. * Angiver signifikant forskel mellem grupperne.

Andre kendte cellulære handlinger metformin omfatter hæmning af kompleks I i elektrontransportkæden og oxidativ phosphorylering [20]. Denne handling kan resultere i afdøde produktionen af ​​ATP og andre cellulære mellemprodukter. De cellulære ATP-niveauer af MCF7, MDAMB231, og PA-1 blev undersøgt efter metformin behandling (24 timer) i enten høj glucose (25 mM) eller lav glucose (2,5 mM) vævskulturmedium (figur 3). Resultaterne viser, at metformin kraftigt reducerer ATP-niveauer kun i lav glucose-medium. I høje glucosebetingelser, på dette tidspunkt, metformin tendens til at stige ATP, men ikke til et signifikansniveau.

MDAMB231 (A) og (B) MCF7-celler blev behandlet med metformin (8 mM) i enten 25 mM glucose eller 2,5 mM glucose for én dag og ATP-niveauer blev målt og fold ændring af ATP sammenlignet med kontrol blev afbildet. C. ATP målinger i PA-1 celler efter 12 timer med eller uden metformin. Dette tidspunkt blev valgt på grund af den hastige PA-1 vækst under kontrol dyrkningsbetingelser. Data blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse. Alle metformin behandlede grupper i medium, der indeholder lav glukose (2,5 mM) var signifikant forskellige fra deres kontrolgrupper. * Angiver signifikant forskel mellem grupperne.

I høje glucose betingelser, metformin behandlede celler potentielt opretholde ATP niveauer ved aktivering af AMPK og styrke glykolysen [21], [22]. For at teste dette blev MCF7-celler behandlet med metformin (8 mM) i 15 timer, cellulære ilt forbrug (OCR) og ekstracellulær forsuring sats (ECAR) blev målt ved hjælp af XF24 søhest analysator. Som forventet, metformin signifikant inhiberede oxygen forbrug af MCF7-celler i medium indeholdende enten 25 mM eller 2,5 mM glucose (figur 4A). Forbedret glykolyse i metformin behandlede celler i 25 mM glucose medium blev bekræftet ved forøget syrning af det ekstracellulære medium (figur 4B) og lactat sekretion (figur 4C). Men i lavt glucoseindhold behandlet cancerceller viste formindsket forøgelse af ECAR og laktat produktion af metformin, hvilket indikerer en reduceret evne til at fremme en stigning i glycolyse (figur 4B, 4C). Således manglende tilstrækkelig fremme glykolyse korrelerer med en manglende evne til at opretholde intracellulær ATP under disse betingelser.

A. MCF7-celler blev behandlet med metformin (8 mM) i 15 timer i enten 25 mM eller 2,5 mM glucose holdige medier. Oxygenforbrugshastighed (OCR) blev bestemt under anvendelse af FX24 instrument for metabolisk flux analyse. Metformin behandlede grupper var signifikant forskellige fra deres kontrolgrupper. B. MCF7-celler blev behandlet med metformin (8 mM) i 15 timer. Ekstracellulær forsuringshastighed (ECAR) blev bestemt under anvendelse af FX24 instrument for metabolisk flux analyse. Metformin behandlede grupper var signifikant forskellige fra hinanden og deres kontrolgrupper. C. MCF7-celler blev behandlet med metformin (8 mM) i 15 timer, og mellemstore lactat blev målt som en indikator for glycolytiske flux. Metformin behandlede grupper var signifikant forskellige fra hinanden. D. Ekstrakter af MCF7 og MDAMB231 celler høstet ene dages behandling med metformin i enten 25 eller 2,5 mM glucose blev anvendt til Western blotting påvisning af phosphoryleret AMPK og total AMPK. p-actin blev detekteret som en loading kontrol. Densitometri af p-AMPK /AMPK eller p-AMPK /Actin for MCF7-celler er præsenteret som et søjlediagram. Spaltet capsase 7 i MCF7-celler blev påvist med western blotting. p-actin blev detekteret som en loading kontrol. E. MCF7-celler i høj glucose blev behandlet med metformin (8 mM) og forbindelse C (10 uM) som angivet i 15 timer. DMSO er køretøjets styring for forbindelse C. ECAR blev bestemt som beskrevet i B. Metformin behandlede grupper var signifikant forskellige fra hinanden. F. MCF7-celler i høj glucose blev behandlet med metformin (8 mM) og forbindelse C (10 uM) som angivet i 15 timer. Medium lactat-niveauer blev bestemt som i C. Metformin behandlede grupper var signifikant forskellige fra hinanden. Alle søjlediagrammer repræsenterer middelværdier ± standardafvigelse. * Angiver signifikant forskel mellem grupperne

AMPK er kendt for at regulere glykolysen ved at øge glukoseoptagelse og regulering af flere vigtige enzymer i vejen [21] -. [25]. Vores tidligere data viste, at metformin kunne aktivere AMPK ved at øge phosphorylering af AMPK ved threonin 172 i medium indeholdende 25 mM glucose [14]. Derfor blev niveauerne af AMPK aktivering med metformin behandling i både høj glucose og lav glucose undersøgt. MCF7 og MDAMB231-celler blev behandlet med metformin (8 mM) i en dag i enten 25 mM eller 2,5 mM glucose medium. Western blotting blev udført for at detektere phosphoryleret AMPK og total AMPK. I begge cellelinier forbedret metformin niveauerne af phosphoryleret af AMPK, den aktive form af enzymet, i medium indeholdende 25 mM glucose, men ikke i medium indeholdende 2,5 mM glucose efter en dags behandling (figur 4D). Derimod mens lav glucose, selv, øget phosphorylering af AMPK, tilsætning af metformin i disse betingelser syntes at formindske både phospho-AMPK og totale niveauer af enzymet. Dette er yderligere demonstreret ved densitometery af Western blots af MCF7-celler til at kvantificere forholdet af phosphoryleret AMPK til total AMPK og forholdet af phosphoryleret AMPK til actin (figur 4D). I medium indeholdende 2,5 mM glucose, metformin stadig forbedret aktiveringen af ​​AMPK sammenlignet med kontrol, demonstreret ved forøget forhold af phosphoryleret AMPK til total AMPK. Men på grund af den kraftige reduktion af den samlede AMPK blev totalt phosphoryleret AMPK faldt med metformin behandling sammenlignet med kontrol. Reduktionen af ​​AMPK niveauer med metformin behandling i medium indeholdende 2,5 mM glucose var forbundet med signifikant apoptotisk celledød som påvist ved forøget spaltet caspase 7 (figur 4D nedre panel). Variansen i niveauerne af aktiv AMPK mellem høj og lav glucose-holdigt medium kunne være den underliggende årsag til forskellen i glycolytiske metabolisme stimulering med metformin behandling. For yderligere at bekræfte rolle AMPK at fremme glycolyse blev MCF7-celler behandlet med eller uden forbindelse C (10 uM), en specifik inhibitor af AMPK. Efter 15 timer i medium indeholdende 25 mM glucose med eller uden metformin, blev ECAR samt lactat målinger opnået. Omfanget af ECAR augmentation og akkumulering af laktat med metformin behandling blev delvist blokeret af samtidig behandling med forbindelse C (figur 4E, 4F). Dette understøtter en rolle for metformin-induceret AMPK aktivering i stimulering glycolyse i høj glucose medium. Desuden er disse resultater støtter den konklusion, at manglende aktivere eller opretholde AMPK aktivering ved metformin ved lav glukose medium fører til nedbrydning af ATP.

For bedre at forstå de intracellulære forandringer, der sker med metformin behandling høj og lav glucose medier, proteinniveauer af flere kinaser undersøgt. Både MCF7- og MDAMB231-celler blev behandlet med metformin (8 mM) i en dag i medium indeholdende enten 25 mM eller 2,5 mM glucose. Western blotting blev udført for at teste phosphorylering af AKT og mål for mTOR signalering. Reaktionen på metformin var stærkt betydeligt ændret i lav glukose betingelser. I lave glucosebetingelser fandtes metformin til væsentligt at reducere phosphoryleringen af ​​AKT og mindske phosphoryleringsniveauerne af målene i mTOR (S6K og 4EBP1), sammenlignet med højglucose betingelser (figur 5A, 5B). Da disse veje er kendt for at fremme celleoverlevelse samt glycolytisk metabolisme, kan deres inhibering med metformin bidrage til reduceret glycolyse, efterfølgende udtynding af ATP, og i sidste ende celledød.

MCF7 og MDAMB231-celler blev behandlet med metformin i DMEM indeholdende enten 25 mM glucose eller 2,5 mM glucose i en dag. Western blotting blev anvendt til at estimere niveauet af p-AKT (Thr308), p-AKT (Thr473), total AKT, p-S6K, total S6K, 4EBP1 (lavere bånd repræsenterer hypophosphorylerede og højere bånd repræsenterer hyperphosphoryleret), og β-actin- som ladningskontrol.

for yderligere at undersøge den rolle, glucose i at beskytte celler fra metformin-induceret død, virkningerne af glucose blev sammenlignet med dem af beslægtede sukkerarter, herunder hexoser fructose og galactose. Det er tidligere blevet rapporteret, at fructose og galactose ikke bidrager væsentligt til glycolytisk metabolisme i cancerceller [26], [27]. Desuden behandling af galactose gennem glycolyse resulterer i nogen netto ATP-syntese. Baseret på disse finde forudsagde vi, at fructose og galactose ville være i stand til at understøtte ATP-syntese i nærvær af metformin. For at teste dette, blev glucose-fri cellekultur medium suppleret med glucose, fructose eller galactose og kulturer blev igen analyseret for celledød (figur 6A, 6B). Brystcancercellelinier MCF7 og MDAMB231 blev behandlet med eller uden metformin i 1,5 dage i DMEM indeholdende glucose (0 eller 25 mM), fruktose (25 mM), galactose (25 mM), eller fruktose plus galactose (12,5 mM hver). I lighed med tidligere resultater, øge glucosekoncentrationen væsentlig mindre cytotoksicitet af metformin i både MCF7 og MDAMB231-celler. Imidlertid fructose og galactose var ikke effektive til forebyggelse af cytotoksiciteten af ​​metformin. ATP-niveauer blev også undersøgt i celler behandlet med metformin i medium, der indeholder de forskellige hexoser. Metformin behandling medførte signifikant reduceret ATP-niveauer i lav glucose, høj fructose eller høje galactose betingelser, men ikke i høj glucose (25 mM) betingelser. Reduktionen i ATP trods høj fructose eller galactose kan forklare, hvorfor disse sukkerarter er ikke i stand til at redde cellerne fra metformin induceret cytotoksicitet.

MCF7 (A) og MDAMB231 (B) celler blev behandlet med metformin i DMEM uden glucose, med 25 mM glucose, med 25 mM galactose, 25 mM fruktose, eller 12,5 mM fruktose plus 12,5 mM galactose i 1,5 dage. Procentdelen af ​​døde celler blev bestemt ved Sytox Green farvning. Metformin behandlede grupper i 25 mM galactose, 25 mM fructose og 12,5 mM fructose plus 12,5 mM galactose var signifikant forskellige fra metformin behandlede grupper i 25 mM glucose. MCF7 (C) og MDAMB231 (D) celler blev behandlet i den angivne medium med eller uden metformin (8 mM) i en dag og ATP-niveauer blev målt. Metformin behandlede grupper i 2,5 mM glucose, 25 mM galactose og 25 mM fruktose var signifikant forskellige fra deres kontrolgrupper. Resultaterne blev vist som fold ændring i forhold til kontrollen. Data er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse. * Angiver signifikant forskel mellem grupperne.

For yderligere at undersøge glukose som en specifik kulstofkilde for at opretholde glykolyse og produktionen af ​​ATP i tilstedeværelse af metformin, vi næste testede effekten af ​​lægemidlet på oxidative fosforylering og glycolyse ved måling OCR og ECAR i 25 mM glucose, 25 mM fruktose, eller 25 mM galactose medier.