PLoS ONE: Integreret proteomiske analyse af humane cancerceller og plasma fra tumorbærende mus for kræft i æggestokkene Biomarkør Discovery

Abstrakt

Baggrund

kompleksitet humant plasma proteomanalyse udgør en væsentlig udfordring for biomarkør opdagelse. Proteomisk analyse af gensplejsede musemodeller for kræft og isolerede kræftceller og cellelinier giver alternative metoder til identifikation af potentielle kræft markører, der ville være påvises i humant blod ved hjælp af følsomme analyser. Målet med dette arbejde er at vurdere nytten af ​​en integrativ strategi ved hjælp af disse to tilgange til biomarkør opdagelse.

Metodologi /vigtigste resultater

Vi undersøgte en strategi, kombineret kvantitative plasma proteomics af en æggestokkene kræft musemodel med analyse af proteiner udskilt eller udgydt af humane ovarie kræftceller. Af 106 plasmaproteiner identificeret med forhøjet indhold i tumor bærende mus blev 58 også udskilles eller stald fra æggestokkene cancerceller. Resten bestod primært af host-respons proteiner. Af 25 proteiner identificeret i undersøgelsen, der blev analyseret, blev 8 meste udskilte proteiner fælles for mus plasma og humane cancerceller signifikant opreguleret i et sæt af plasmaer fra æggestokkene kræftpatienter. Fem af de otte proteiner blev bekræftet at være opreguleret i et andet uafhængigt sæt af kræft i æggestokkene plasmaer, herunder tidlig fase sygdom.

Konklusioner /Betydning

Integreret proteomisk analyse af kræft musemodeller og den menneskelige kræft cellepopulationer giver en effektiv metode til at identificere potentielle cirkulerende protein biomarkører

Henvisning:. Pitteri SJ, JeBailey L, Faca VM, Thorpe JD, Silva MA, Ireton RC, et al. (2009) Integreret proteomiske analyse af humane cancerceller og plasma fra tumorbærende mus for kræft i æggestokkene Biomarkør Discovery. PLoS ONE 4 (11): e7916. doi: 10,1371 /journal.pone.0007916

Redaktør: Alfred Nordheim, University of Tübingen, Tyskland

Modtaget: Juni 30, 2009; Accepteret: 26 oktober 2009; Udgivet: November 19, 2009

Copyright: © 2009 Pitteri et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne ønsker at anerkende NIH SPORE tilskud, # P50 CA83636 og # P50 CA105009, National Cancer Institute Early Detection Research Network og Canary Foundation. Daniela Dinulescu er en V Foundation Scholar og er også støttet af Burroughs Wellcome, Rivkin, æggestokkene Cancer Research, og Mary Kay Ash Fonde, Dana-Farber Cancer Institute Madeline Franchi og Moorman Awards, og NIH musemodeller af menneskelig Cancer Consortium give # U01 CA084301. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Proteiner påviselige i serum og plasma er almindeligt påberåbes til at overvåge æggestokkene, bugspytkirtlen, og tyktarmskræft respons på behandlingen og sygdom tilbagefald gennem måling af ca125, CA19.9, og CEA henholdsvis. Derudover screening og overvågning af prostatacancer øjeblikket påberåbt delvist på målinger af PSA-niveauer i blod [1] – [3]. Udviklingen af ​​effektive strategier til identifikation af cirkulerende proteinmarkører, der supplerer de nuværende markører ville være gavnligt [4]. En række nylige æggestokkene undersøgelser kræft har udnyttet proteomics at identificere proteiner i ovariecancerceller, væv, og væsker [5] – [9]. Sådanne undersøgelser tyder hundredvis af potentielle kandidater på grund af overekspression, men ikke giver en indikation af, om der kan forekomme forhøjede niveauer af kandidatlandenes proteiner i cancerpatienter. Identifikation af nye cirkulerende proteinmarkører gennem plasma profilering udgør en væsentlig udfordring. Selvom plasma er en af ​​de mest tilgængelige biologiske materialer det indeholder store samlinger af proteiner og komplekser og udviser betydelig heterogenitet mellem og inden emner, der hindrer proteomisk analyse af lav hyppighed proteiner [10]. Manipulerede musemodeller for cancer karakteriseret ved begrænset heterogenitet og en gunstig tumor til organ masseforhold, og isolerede tumorcellepopulationer der kan være profileret på stor dybde stede alternative strategier til identifikation af potentielle kræft markører, især secernerede proteiner, der kan underkastes validering i humant blod ved hjælp af følsomme analyser.

Vi har udviklet flere musemodeller af epitelial ovariecancer [11]. Disse modeller er blevet genereret ved hjælp intrabursal levering af Adeno-Cre (AdCre) adenovirus via infundibulum i gensplejsede mus. Denne metode selektivt aktiverer onkogener og inaktiverer tumor undertrykkere i æggestokkene overflade epitel (OSE), et oprindelsesstedet for mange menneskelige ovarietumorer. Vi har tidligere påberåbt sig de

LSL-K-ras

G12D /+

PTEN

loxP /loxP

betingede murine stammer (heri benævnt K-ras /PTEN) at udvikle en musemodel for ovariecancer [11] – [13]. En anden model er udviklet parallelt af os og andre er baseret på samarbejdet mellem Wnt og PTEN veje (

APC

loxP /lox PTEN

loxP /lox

genetiske kombination, heri benævnt PTEN /APC) [14]. Begge modeller udviser træk af endometrioide ovarietumorer.

Vi har for nylig foretaget proteomisk profilering af ovariecancer cellepopulationer herunder cellelinjer og friske tumorceller beriget fra ascites væske, hvilket resulterede i identifikationen af ​​flere tusinde proteiner og belyst den repertoire af proteiner udtrykt på celleoverfladen og proteiner frigives i det ekstracellulære miljø [15]. Proteomanalyse har afdækket udgyde ekstra-cellulære domæner og meget dynamiske processer af protein sekretion. Her har vi anvendt en dybtgående kvantitativ proteom tilgang [16] – [18] til analysen af ​​plasma protein ændringer i forbindelse med tumor udvikling i en K-ras /PTEN æggestokkræft musemodel til at bestemme deres engagement i veje og netværk og deres korrespondance til proteiner udtrykt eller frigivet fra humane ovariecancerceller. Blinded analyse af humane prøver blev gjort for at bestemme, hvilke analyseret proteiner fra de integrerede kræft celle og mus plasma data gav statistisk signifikante stigninger i niveauet i æggestokkene kræfttilfælde i forhold til kontrol. Et protein delmængde repræsenterer primært udskilte proteiner fra den kombinerede mus plasma og menneskelige kræftceller proteom data gav signifikante forskelle i niveauer mellem plasmaer fra æggestokkene kræftpatienter og plasma fra kontrolpersoner.

Resultater

Kvantitativ Plasma Protein Ændringer observeret i en Cancer Mouse Model

æggestokkene

en pulje af plasmaprøver fra AdenoCre-inficerede K-ras /PTEN mus (n = 5) og en pulje fra adeno-tom injicerede kontroller (n = 5) var underkastet kvantitativ proteom analyse for at bestemme forskelle i plasma protein niveauer. Separate puljer af plasma fra cases og kontroller blev udsat for immunodepletion at fjerne rigelige plasmaproteiner, efterfulgt af differential isotop mærkning at skelne kræfttilfælde fra kontroller. Prøverne blev blandet og derefter udsat for intakt protein fraktionering ved ionbytning efterfulgt af omvendt fase-kromatografi. Proteiner i de enkelte indsamlede fraktioner blev enzymatisk spaltet og udsat for online LC-MS /MS til identifikation protein og kvantificering (figur 1). En funktion i IPAs platformen er, at omfattende fraktionering tillader de-kompleksdannelse af prøverne i enkelte fraktioner til at tillade identifikation og kvantificering af proteiner til stede i plasma over 6-7 størrelsesordener [16], [19]. En tidligere undersøgelse ved hjælp af denne metode har vist, at kvantitativ analyse af protein ændringer kan opgøres pålideligt [18]. I denne undersøgelse blev nogle 1.725.000 massespektre indsamlet og analyseret. 1.031 unikke proteiner blev identificeret med stor sikkerhed (tabel S1). 106 proteiner blev opreguleret 1,5-fold eller større (p-værdi 0,05) (tabel S2). Et flertal (57%) af de opregulerede proteiner indeholdt et signalpeptid til sekretion, mens 17% omfattet i deres tilsvarende gensekvens en transmembrane domæne. 28% af de opregulerede proteiner blev tidligere identificeret i proteomanalyse profilering af muse levervæv, en vigtig kilde til plasmaproteiner [20], [21]. 9% havde ingen menneskelig ortolog som fastlægges på baggrund af Mouse Genome Database [22]. I modsætning hertil blev 36-proteiner nedreguleret 1,5-fold eller større (p-værdi 0,05). (Tabel S3) herunder udskilte proteiner med 8 repræsenterer proteiner, der tidligere er identificeret i mus levervæv

En skematisk i arbejdsgangen anvendes i denne undersøgelse. Puljer af kontrol og kræft plasma fra K-ras /PTEN musemodel blev først immundepleteret at fjerne rigelige proteiner og derefter mærket med D0- og D3- akrylamid isotoper til at skelne kræft fra kontrol. I pools blev blandet og underkastet omfattende intakt protein fraktionering ved anionbytning efterfulgt af omvendt fase-kromatografi. Efter tryptisk fordøjelse blev prøverne udsat for højopløsningsmassespektrometri og shotgun LC-MS /MS-analyse til identifikation protein og kvantificering. Efter statistisk analyse og data mining, blev opreguleres proteiner i murine plasma sammenlignet med human ascites afledt tumor celler /cancercellelinie data. Desuden blev pathway analyse anvendes til at bestemme signifikante biologiske veje og processer. Udtrykket af relevante opregulerede proteiner blev yderligere valideret i mus og humane tumorer og plasma.

komparativ analyse af Tumor Bearing Mouse Plasma og human Ovarian Tumor Cell proteomer

Vi sammenlignede musen plasma data med data fra en omfattende proteom undersøgelse af tre humane ovarie cancer cellelinier (OVCAR3, CaOV3, og ES2) og af tumorceller fra ascites væske fås fra en ovariecancer patient [15]. Cellelinierne bestod af to ringe differentierede serøse adenocarcinomer (OVCAR3, CaOV3) og ét klart cellecarcinom (ES2). Ascites afledt tumorceller blev opsamlet fra en patient med serøs ovariecancer. Cellerne blev isotopmærket i kultur ved hjælp SILAC [23] for at tillade konstatering af den cellulære oprindelse af proteiner identificeret i mediet. Ved at sammenligne de opreguleret mus plasmaproteiner med listen over proteiner beriget med overfladen eller udskilles cellulære rum fra humane ovariecancerceller (Tabel S2), 55% (58/106) af opreguleret proteiner i mus plasma blev fundet at blive frigivet fra æggestokkene kræftceller gennem sekretion eller kaste eller beriget i kræft i æggestokkene celleoverfladen rum. Tidligere beskrevet kandidat markører for kræft i æggestokkene identificeret i både mus plasma og ovariecancer celler (tabel S4), inkluderet WFDC2 (HE4), IGFBP2, og LCN2. Den resterende del af proteiner, der ikke er identificeret i æggestokkene kræftcelle analyser bestod primært af inflammatoriske og immune respons relaterede proteiner. Interessant, selv om K-ras /PTEN model har funktioner i endometrioide kræft i æggestokkene, foreslog de data, opreguleret udskilte proteiner identificeret i mus plasma med tumor udvikling var mere bredt repræsentative for andre kræft i æggestokkene histologiske undertyper, da de humane cellelinjer og ascites afledt tumorceller skyldtes papillær adenocarcinom, klar celle og serøse undertyper henholdsvis [24], [25].

Ud over de kvantitative kræft-til-kontrol nøgletal for proteiner præsenteret, havde flere proteiner mærkede peptider kun detekteres med den tunge form af acrylamid, der repræsenterer “cancer-only” peptider. Af de 106 proteiner opreguleret i mus plasma IPAs, 33 proteiner havde yderligere kræft-only peptider identificeret (tabel S2), yderligere bestyrke deres opreguleret status. Derudover syv proteiner: Cacna1c, VCL, Fcgbp, MMP19, Lyz2, Eef1a1, og Gapdhs havde kræft-kun peptider (tabel S2). VCL fungerer som en bindingsgruppe protein i fokal adhæsion og er blevet undersøgt i forbindelse med cancer [26]. MMP19, en del af metalloproteinase familien impliceret i cancer, er blevet rapporteret at inducere epithelcellevandring, spiller en vigtig rolle i den tidlige fase af kræft [27]. Medlemmer af Eef1a familien er blevet rapporteret som formodede onkogener overudtrykt i ovariecancer [28], [29].

Biologiske funktioner og netværk blandt opreguleret Proteiner i Mouse Plasma

Pathway analyse blev udført til bestemme de biologiske processer, der bidrager ændringer i plasma proteom med æggestokkene tumor udvikling, og udforske veje for proteiner af interesse at forstå de processer, som de deltager i. Vi har påberåbt sig to pathway værktøjer herom, Opfindsomhed og GeneGo s MetaCore. Indledende pathway analyse af listen over 106 opregulerede proteiner ved hjælp af den beregningsmæssige gen netværk forudsigelse værktøj, Opfindsomhed Pathways Analyse, kategoriseret proteinerne i biologiske funktioner. Tredive proteiner blev associeret med inflammation (p = 1,30 × 10

-6). Kræft blev identificeret som en væsentlig sygdom proces (p = 3,71 × 10

-5) i forhold til alle proteiner identificeret, bliver repræsenteret af 52 relevante proteiner fra denne liste. Interessant, blev gener for 11 proteiner forbundet som en gruppe med kræft i æggestokkene (p = 1,41 × 10

-3) (CFH, Clu, IFI30, IGFBP2, IGFBP4, LCN2, MMP2, POSTN, TFF3, TNFRSF9, HE4 (WFDC2 .) HE4, en kendt kandidat markør for ovariecancer [30], [31] blev opreguleret (8,8-fold p. 0,001) i murine plasma datasættet Nogle proteiner fra denne liste er også blevet identificeret i tumor undersøgelser som kliniske resultater prædiktorer (nOV, CLU TNC, POSTN, IGFBP2, LCN2) eller mediatorer af resistens mod kemoterapi (Clu, FBLN1, THBS, STIP1, PTGES3, IGFBP4, ATOX1) [32] -. [45]

58 de 106 opreguleres proteiner i museplasma analyse viste sig at være også beriget med overfladen eller udskilles sub-cellulære rum af ovariecancerceller. Pathway analyse af disse 58 proteiner identificeret fire betydende net ved hjælp Ingenuity (figur 2 og figur S1) og fem netværk med MetaCore workflow (figur S2). de mest udbredte processer fremhævet i opfindsomhed netværk omfattede tumorvækst, celledeling og apoptose, regulering af tumor mikromiljø, angiogenese, cellulære migration, invasion, og metastase (tabel S5). En yderligere vurdering ved hjælp MetaCore s berigelse værktøjer på tværs GeneGo ontologier og Gene ontologi (Figur S2, figur S3, tabel S6) bekræftede celleadhæsion, proliferation, udvikling og ekstracellulær matrix remodeling som væsentlige repræsenterede processer. De to øverste netværk genereret af Opfindsomhed understrege betydningen af ​​TGF-medieret regulering af celleproliferation, stofskifte og cytoskeletal remodeling (figur 2, tabel S5), som skal supplere de MetaCore berigelse resultater (Figur S3). Foruden TGFp, andre centrale knudepunkter (med både opfindsomhed og MetaCore) indbefatter MMP2, p38MAPK, NFkB, og RAS, alle kendt for at være vigtige i ovariecancer [46], [47]. Pathway analyse af de 48 proteiner, der blev anset for at være opreguleret i mus plasma med tumor udvikling, men ikke identificeret som udskilles eller overfladen membranproteiner i æggestokkene cancerceller gav tre væsentlige netværk med Opfindsomhed (figur S4, tabel S5). Listen omfattede formodede inflammatoriske proteiner såsom haptoglobin (HP), S100A8, og CCL8. Kategoriseringen af ​​opreguleres proteiner i plasma baseret på berigelse i æggestokkene cancerceller sub-fraktioner forudsat et middel til at vurdere, hvilke opreguleret proteiner i plasma blev mere sandsynligt stammer fra kræftceller, og som proteiner blev mere sandsynligvis relateret til vært-reaktion.

Top to netværk (A, B) tildelt af Ingenuity Pathway Analyse for opreguleres proteiner i mus plasma, blev også beriget i kræftcellen line data. Centrale knudepunkter omfatter TGFp, PI3K, MMP-2, Ras, og MAPK. Proteiner farvet i rødt repræsenterer opreguleres proteiner, og ikke-farvede proteiner er dem tildelt af Opfindsomt databaser som mulige mellemliggende interaktioner som er baseret på den opfindsomhed databasen. Solid linjer angiver direkte relationer (to molekyler gør fysisk kontakt), og stiplede linjer angiver indirekte forbindelser (kræver ikke fysisk kontakt). Pointene for A) og B) er henholdsvis 51 og 24.

immunoblotanalyse af Mouse og Human Prøver

Et sæt af proteiner identificeret i æggestokkene cancerceller og fundet at være opreguleret i plasma fra tumorbærende mus, TIMP1, LCN2, IGFBP2, PFN1, SPARC, EEF1B2, Clu, og FBLN2, blev udvalgt til immunblot-analyse under anvendelse tumorvæv opsamlet fra musemodeller, konditionerede medier fra humane ovarie cancercellelinjer, og primære ovarietumorer fra forsøgspersoner. Der blev observeret øget proteinniveauer for Timp1, Lcn2, IGFBP2, Pfn1, og Sparc i ovariale tumorvæv isoleret fra K-ras /PTEN (figur 3A) og PTEN /APC (figur 3B) ovariecancer musemodeller sammenlignet med kontrolvæv lysater. Ligeledes berigelse i TIMP1, LCN2, IGFBP2, PFN1, SPARC, EEF1B2, Clu, og FBLN2 blev observeret i konditioneret medium (CM) indsamlet fra æggestokkene kræft cellelinjer afledt af serøse adenokarcinomer (OVCAR-3, SKOV3, CaOV3, OVCAR-5 , OVCAR-8), endometrioide carcinom (TOV112D), klar celle carcinom (ES-2, IGROV1) sammenlignet med konditionerede medier ud fra humant æggestokkene overfladeepitelet (HOSE, figur 3C). Desuden blev ekspressionsniveauer af TIMP1, LCN2, PFN1, IGFBP2, SPARC, EEF1B2, Clu, og FBLN2 forhøjede i æggestokkene tumorlysater sammenlignet med kontrol væv nylig opsamlet fra patienter, der gennemgår kirurgi (figur 3D).

Protein niveauer af TIMP1, LCN2, PFN1, IGFBP2, SPARC, EEF1B2 og CLU blev bestemt ud fra følgende: (A) normal ovarievæv (N) og tumorer i æggestokkene (T) isoleret fra K-ras /PTEN, eller (B) PTEN /Apc musemodel for ovariecancer, (C) konditioneret medium (CM) fra normale humane overflade epitelceller linier (slange) og æggestokkræft cellelinjer og (D) humane primære væv (HPT): normal ovarievæv (N) og ovarie- tumorer (T). For muse præparater, blev væv lysater fremstillet ud fra normale ovarier og tumorer taget fra det samme dyr (a-d) sammen med fire-fem tumorer fra separate dyr (e-i). For humane primære tumor (HPT) prøver blev væv lysater fremstillet ud fra 4 tumorprøver parret med deres respektive normale væv fra den samme patient og 3 enlige tumorprøver, hvor der ikke normale prøver var tilgængelige. Patientprøver er som følger: patient # 14 havde uafhængige bilaterale serøse borderline tumorer i venstre (TL) og højre æggestok (TR), tumorer # 3, # 7 og # 15 er papillære serøse carcinomer, tumor # 12 er en epitelial borderline tumor i mullerian-type, med endocervikale mucinøs og serøs differentiering, tumor # 13 er klar celle karcinom, og tumor # 16 er endometrioide adenocarcinom.

ELISA assays Brug musen og human Plasma

Vi yderligere testet en undergruppe af proteiner, der findes ved massespektrometri at være opreguleret i plasma fra tumorbærende mus, for deres niveauer i humant og murint plasma. Vi sammenlignede også udførelsen af ​​proteiner, der findes at være udskilt af ovariecancerceller men blev enten ikke identificeret i mus plasma eller ikke findes at være forhøjet i plasma fra tumor-bærende mus. 25 proteiner blev valgt baseret på tilgængelighed af ELISA assays. For mus analyser, vi vurderede niveauer af Timp1 og Lcn2 i biologiske væsker og plasmaer fra tumor, der bærer mus (fase I /II, n = 6; Stage III /IV, n = 5, kontrol, n = 18). Timp1 niveauer i fase I /II og trin III /IV prøver blev forøget 5,9-fold (p 0,0001) og 9,5-fold (p 0,0001) sammenlignet med kontroller, henholdsvis (figur 4A). Der blev observeret lignende fund for Lcn2 (figur 4B). Vi undersøgte endvidere, om Timp1 og Lcn2 blev beriget med væske udvundet af sene stadie æggestokkræft og i peritoneale ascites givet nærhed af disse væsker til æggestokkene cancerceller og udskilte natur af proteinerne. Timp1 niveauer blev forhøjet mere end 400 gange og 250 gange i ovarietumor væske og peritoneale ascites sammenlignet med murint plasma henholdsvis (figur 4C). Ligeledes Lcn2 havde en lignende mønster med en 79- og 19-fold forhøjede niveauer i æggestokkene tumor væske og peritoneale ascites, henholdsvis (figur 4D), i overensstemmelse med deres aktive udskillelse i omkringliggende væsker ved tumorceller.

TIMP1 og LCN2 niveauer i murint plasma på forskellige stadier af tumorprogression blev bestemt ved ELISA som beskrevet i Materialer og fremgangsmåder (A, B). Også vist er TIMP1 (C) og LCN2 (D) niveauer i murine ovarietumor væske og peritoneale ascites sammenlignet med plasma. Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af en to-halet t-test * p 0,05, ** p 0,01, og *** p. 0,0001 sammenlignet med kontroller

De 25 proteiner valgt til analyser i humane plasmaer blev enten: 1) opreguleret i museplasma, 2) udtrykkes af ovariecancerceller, eller 3) både opreguleret i museplasma og udtrykkes af ovariecancerceller. Det første sæt af menneskelige plasmaer, herefter benævnt Set 1, bestod af plasmaprøver fra 13 kvinder med epitelial ovariecancer (n = 3 tidligt stadie, n = 10 sent) og 56 raske kvinder. Alle prøver i Set 1 blev indsamlet i klinikken, under ikke-kirurgiske forhold (tabel S7). Analyseresultaterne fra Set 1 er opsummeret i tabel S2, sammen med de muse plasma- og cellelinie data, der anvendes til at vælge de proteiner til testning. Niveauerne af 8 af de 25 proteiner, GRN, IGFBP2, THBS1, RARRES2, TIMP1, PPBP, CD14, og NRCAM, viste sig at være statistisk signifikant (p 0,05) forhøjet i nydiagnosticerede patienter med kræft i æggestokkene sammenlignet med kontroller (tabel 1, figur 5).

i Set 1, protein niveauer i kræftpatienter blev sammenlignet med niveauet i de raske kontrolpersoner, med alle prøver indsamlet i klinikken under ikke-kirurgiske tilstande. I Set 2 blev protein niveauer i kræftpatienter forhold til kontrolgruppen med alle prøver indsamlet i operationsstuen under kirurgiske betingelser. Logistisk regressionsanalyse blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans af ændringer i protein-niveauer mellem case og kontrolgrupper. For Set 2, blev p-værdier for de tidlige og sene stadier beregnes, hvis p-værdien var signifikant i hele sættet 2 (alle sager). * P 0,05, ** p 0,01, og *** p 0,0001 for sager, sammenlignet med kontroller. Marker niveauer blev normaliseret til at give raske kontrolpersoner en middelværdi på 0 og en standardafvigelse på 1. y-aksen repræsenterer de standardiserede markør niveauer.

Interessant, 5 af de 8 proteiner fundet op -regulated i Set 1 (GRN, IGFBP2, THBS1, RARRES2, og TIMP1) blev udskilt proteiner fra skæringspunktet mellem musen plasma og kræft celle data. PPBP blev et udskilt protein, der findes opreguleret i museplasma, men ikke opdaget i æggestokkene cancercellelinier, mens CD14 og NRCAM var celleoverfladeproteiner fra æggestokkene cancercellelinjer, og var ikke kvantificeret i museplasma.

De 8 proteiner, der viste statistisk signifikante øgede niveauer i Set 1 analyser blev yderligere testet i et ekstra sæt af humane plasmaprøver, herefter benævnt Set 2. Set 2 bestod af plasmaprøver fra 55 kvinder med epitelial kræft i æggestokkene (n = 31 tidligt stadium, n = 23 sent tidspunkt, og n = 1 fase ukendt) og 39 kontroller undergår kirurgi. Alle prøver i Set 2 blev indsamlet i operationsstuen under kirurgiske betingelser (tabel S7). Af de 8 proteiner fundet signifikant i Set 1, 5 proteiner (GRN, IGFBP2, RARRES2, TIMP1, og CD14), blev bekræftet at være opreguleret i Set 2 (tabel 1, figur 5). Især alle 5 af de proteiner blev statistisk signifikant forhøjet i prøverne tidlige fase.

Af de 25 proteiner, der blev analyseret, ti havde samstemmende fund i mus plasma og cellelinje data. Interessant, fem proteiner, der var til stede i skæringspunktet mellem kandidater fra mus plasma og celler befolkningsdata (GRN, IGFBP2, THBS1, RARRES2, og TIMP1), viste sig at være betydeligt opreguleret i Set 1 og fire af de fem proteiner blev bekræftet i Set 2, med THBS1 som undtagelsen.

Prøvetagning forhold kan påvirke niveauet af cirkulerende proteiner. For eksempel kan patienter, der har blod udtaget på tidspunktet for kirurgi har forøgede niveauer af visse proteiner som følge af stress [48]. Ved hjælp af en tidligere beskrevet metode [48], vi vurderet, om protein niveauer afveg mellem case og kontrolgrupper efter justering for betingelser for blodprøvetagning. I de prøver anvendt til assays, syv Ovariecancerpatienter havde blod trækker på to tidspunkter: før kirurgi, og på tidspunktet for kirurgi. Protein- niveauerne i begge tidspunkter for hver patient er vist i Figur S5. Regression analyser blev udført ved anvendelse Generaliseret Estimering ligningerne (GEE) metoder [48] at tage højde for sammenhængen i de proteinniveauer af de 7 kvinder med to blod samlinger, og give p-værdier, der er upåvirkede af den multiple blod trækker fra de samme kvinder (tabel S8). Efter justering for betingelser for blod uafgjort, de fem proteiner tidligere fundet signifikant i Set 1 og Set 2 logistisk regressionsanalyse, blev også fundet betydelige i GEE model for sagen versus raske kontrol sammenligning. For en sekundær GEE model blev koefficienten for blod draw betingelser fastlagt fra den første GEE analyse for at undgå bias fra genmontering. Den anden analyse var begrænset til prøver indsamlet ved kirurgi og alle 5 proteiner fundet signifikant i den første analyse var signifikante i tilfældet vs. ikke-sag, tidlig tilfælde vs. ikke-sag, og sene tilfælde vs. ikke-sag sammenligning. Disse resultater understøtter resultaterne fra den logistiske regression og vise, at IGFBP2, TIMP1, RARRES2, CD14, og GRN er forhøjet i alle tilfælde i forhold til at styre og vigtigere i tidlige tilfælde sammenlignet med kontroller.

GRN er blevet beskrevet som en formodet hidtil ukendt vækstfaktor for ovariecancer, og viste sig at være stærkt secerneres af ovariecancerceller [49]. Øget niveau af GRN og RARRES2 i plasma fra patienter med ovariecancer i både den tidlige og sagerne sene stadie er et nye fund i denne undersøgelse. CD14, og IGFBP2 er tidligere blevet analyseret i serum fra æggestokkene kræftpatienter [37], [50], [51]. De blev signifikant forhøjet i denne undersøgelse i museplasma og beriget i udskilt protein brøkdel af æggestokkene cancercellelinier. Konstateringen af ​​interesse i vores undersøgelse er forekomsten af ​​forhøjede niveauer af IGFBP2 og CD14 i tidligt stadie sygdommen. TIMP1 udførte også viste forhøjede niveauer i begge tilfælde tidlige og sene fase. Cellelinje data viste, at TIMP1 blev løsladt fra æggestokkene cancerceller på nanogram per million kræftceller i timen [18], der vil tegne sig for forhøjede niveauer i humane æggestokkene prøver kræftpatient.

Diskussion

Der er i øjeblikket en begrænset forståelse af de ændringer i plasmaproteiner, der opstår med udviklingen af ​​ovarietumorer og for de fleste tumortyper generelt [52], [53]. Opdagelsen af ​​nye plasma markører har repræsenteret en væsentlig udfordring, især for markører, der gælder for tidligt stadie sygdommen. Analyse af høj-dimensionelle genomisk, transkriptomisk eller proteomiske data giver mulighed for de berørte veje, netværk og signalanlæg knudepunkter, der skal undersøges [53], [54]. Nærværende undersøgelse giver evidens for nytten af ​​at integrere data fra dybdegående kvantitativ proteomanalyse af musemodeller for kræft med data fra humane cancerceller for biomarkør identifikation. Her brugte vi en musemodel af epitelial kræft i æggestokkene i kombination med IPAs proteomiske platform til at tillade os at pålideligt vurdere og kvantificere ændringer der omfatter lav hyppighed proteiner i mus plasma med tumor udvikling [53]. Integration med data fra humane ovarie cancer cellelinjer forudsat et middel til at vurdere, hvilke opreguleret proteiner blev udtrykt i kræftceller. Derudover signalering noder, der bidrog opreguleret proteiner i plasma blev bestemt. Som et resultat, proteiner, der sandsynligvis førte fra inflammatoriske og immune respons ændringer var skelnes fra proteiner, som mere sandsynligt førte fra sekretion med tumorceller eller fra tumorigene processer. Ændringer i tumor mikromiljø og ECM er forbundet med autokrin regulering. ECM-proteiner er tidligere blevet identificeret som æggestokkene cancermetastase signatur gener [55], [56]. Ændringer i cytoskelettet blev observeret herunder cytoskelet-medieret migrering, adhæsion, og invasion. Endelig blev cellulær proliferation ændringer observeret og inkorporeret celle apoptose. Adskillige centrale signalsystemer noder blev identificeret i denne undersøgelse, herunder TGFp, MMP2 og NFkB signalering. TGFp, signalering især er centralt for en mangfoldighed af processer, herunder celleproliferation og apoptose, ECM remodellering, cellemigrering, adhæsion, invasion og metastase, angiogenese og inflammation og immun-overvågning [57], [58]. Den TGFp familien er en aktiv mål for forebyggelse og terapi [57] kræft, [58]. Interessant er TGFp kendt for at have både tumor suppressor og pro-oncongenic virkninger i forskellige cancerformer, herunder ovariecancer [59]. TGFp spiller også en rolle i epitel stamcelle niche homeostase [60], og sletning af TGFp-receptor inducerer en yderst proliferativ og invasiv miljø [61]. Tumbar et al. også fastslået, at tabet af TGFp-receptorer i kombination med onkogene Ras forbedret tumorigenicitet. Denne hypotese understøttes også af de genererede netværk i vores vej analyse (figur 2B), hvor NFKB (formentlig under kontrol af TGFp) er tildelt fremkalde Ras, PI3K, og MAPK signalering mod actin-medierede reaktioner kørsel cellulære migration, EMT , invasion og metastase [59]. Denne rolle TGF signalering minder om dens virkninger på embryonale stamceller pluripotens og embryonale væv udvikling, herunder æggestokkene [62] – [64]. I overensstemmelse med denne hypotese, yderligere netværk illustreret ved pathway analyse (figur S1) for det sene stadium proteom fremhæve Notch og Dkk3, kendte stamcellelinjer effektorer [65], [66]. Det er derfor ikke overraskende, at denne effektor er dominerende i plasma og kræft celle line data, at støtte det nuværende rolle TGFP da det fremkalder en række reaktioner relevante for kræft processer (spredning, apotosis, inflammation, angiogenese, autorcrine-regulering af tumor mikromiljø /ECM og vedhæftning, invasion, og metastase).

I en søgning efter potentielle ovariecancer biomarkører, vi udførte en roman integrativ analyse ved at sammenligne mus plasma proteomanalyse data med humane cellelinie og ascites afledt tumor celle data.