PLoS ONE: Cell Migration reguleres af AGE-RAGE Interaktion i Human Oral kræftceller i Vitro

Abstrakt

Avancerede glykeringsslutprodukter (alder) er produceret i en irreversibel ikke-enzymatisk reaktion af kulhydrater og proteiner. Patienter med diabetes mellitus (DM) er kendt for at have forhøjet alderstrin, som er set som en risikofaktor for diabetes-relaterede komplikationer. I et klinisk miljø, er det blevet vist, at patienter med oral cancer i forbindelse med DM har en højere sandsynlighed for cancermetastase og lavere kræft overlevelsesrater. AGE-RAGE (en receptor af aldre) er også korreleret med metastase og angiogenese. Nylige undersøgelser har antydet, at malignitet af cancer kan forstærkes af glyceraldehyd-afledte AGEs; dog den underliggende mekanisme er stadig uklar. Denne undersøgelse undersøgte tilsyneladende tæt sammenhæng mellem AGE-RAGE og malignitet af SAS oral cancer cellelinje. I denne undersøgelse, AGEs steget ERK fosforylering, forbedret celle migration, og fremmet udtryk for RAGE, MMP2, og MMP9. Brug af PD98059, RAGE antistof og RAGE RNAi til at blokere RAGE pathway resulterede i inhibering af ERK-phosphorylering. Cellemigrering, MMP2 og MMP9-ekspression blev også reduceret ved denne behandling. Vores resultater viser, hvor vigtigt AGE-RAGE med hensyn til malignitet af oral cancer, og bidrage til at forklare den dårlige prognose af DM individer med oral cancer

Henvisning:. Ko SY, Ko HA, Shieh TM, Chang WC, Chen HI, Chang SS et al. (2014) Cell Migration reguleres af AGE-RAGE Interaktion i Human Oral Cancer Cells

In Vitro

. PLoS ONE 9 (10): e110542. doi: 10,1371 /journal.pone.0110542

Redaktør: Barry I. Hudson, University of Miami, USA

Modtaget: April 23, 2014 Accepteret: September 16, 2014; Udgivet: 16 Okt 2014

Copyright: © 2014 Ko et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Science Rådet, Taiwan (NSC 100-2314-B-309-002-MY3). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Avancerede glykeringsslutprodukter (alder) er resultatet af en Maillard-reaktion mellem kulhydrater og proteiner. Aging og reduceret metabolisk funktion har vist sig at forøge dannelsen af ​​AGEs [1] – [5]. Øget AGE akkumulering er også blevet observeret hos patienter med Alzheimers sygdom (AD) eller diabetes mellitus (DM) [6] – [8]. Desuden har AGEs vist sig at spille en rolle i patogenesen af ​​DM, således at AGE akkumulering betragtes som en risikofaktor for forskellige komplikationer af sygdommen [9] – [14].

Nyere undersøgelser har vist at aldre og raser (receptorer af aldre) regulerer celle migration [15] – [17]. RAGE overekspression er blevet forbundet med kræft i tyktarmen, strubehovedet, tungen, mave og mund [18] – [20], gennem carcinogenese [21], celleproliferation, metastase, invasion, og angiogenese [22] – [25]. I en klinisk undersøgelse, der omfattede patienter med kræft i mundhulen samt DM, kræft blev mere invasiv, hvilket resulterer i et fald i overlevelsesrater [26]. Denne undersøgelse yderligere identificeret en sammenhæng mellem kræft i mundhulen og DM [27]. RAGE har vist sig at være tæt forbundet med invasion i oral cancer [15], og malignitet af kræft kan forbedres ved Glyceraldehyd afledt AGEs [17]. Men den underliggende mekanisme er ansvarlig for disse effekter er fortsat uklar.

Denne undersøgelse undersøgte tilsyneladende stærk sammenhæng mellem aldre og malignitet af oral cancer. Vores resultater viser, at AGEs øge celle migration og også øge ERK phosphorylering og udtryk for RAGE, MMP2, og MMP9. Forbehandling med PD98059 (en ERK-hæmmer) viste sig at undertrykke virkningen af ​​AGEs; imidlertid blev RAGE-ekspression inhiberes ikke. RAGE antistoffer blev også anvendt til at blokere konjugeringen af ​​AGEs, hvilket resulterede i reduceret ERK-phosphorylering, ekspressionen af ​​MMP2, MMP9, og cellevandring. Desuden RAGE RNAi synes at regulere disse effekter, hvilket tyder på, at AGE-RAGE-systemet ændrer cellemigration gennem ERK phosphorylering og regulering af downstream veje. Vores resultater giver yderligere bevis på, at AGE-RAGE spiller en vigtig rolle i fastsættelsen af ​​malignitet af oral cancer.

Materialer og metoder

Reagenser

phenylmethylsulfonylfluorid fluorider (PMSF), kvæg serumalbumin (BSA), DL-glyceraldehyd, og PD98059 blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). DMEM-medium, føtalt bovint serum (FBS), penicillin, streptomycin, Hanks balancerede saltopløsning (HBSS), trypanblåt, og Lipofectamin RNAiMAX blev indkøbt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). GAPDH (kat nr .: MAB374) blev købt fra Chemicon (Temecula, CA, USA). ERK (kat nr .: SC-94), p-ERK (kat nr .: SC-7383), RAGE (kat nr .: SC-94), og RAGE siRNA (kat nr .: SC-36.374) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). MMP2 (kat nr .: 2763-S) og MMP9 (kat nr .: 2551-S) blev indkøbt fra Epitomics (Burlingame, CA, USA). Nitrocellulosemembraner blev indkøbt fra PALL corp. (Ann Arbor, MI, USA). Forøget kemiluminescens (ECL) blev erhvervet fra Millipore (Billerica, MA, USA). WST-1 kit blev købt fra Clontech Laboratories, Inc. (Mountain View, CA, USA). Kultur-Insert blev købt fra ibidi (Verona, WI, USA).

Forberedelse of Ages

AGEs blev forberedt ved at inkubere BSA (pH = 7,4) i PBS med 20 mM DL-glyceraldehyd på 37 ° C i 1 uge. Produktet blev dialyseret i PBS ved 4 ° C i 2 timer, og denne cyklus blev gentaget 5 gange. Produktet blev derefter opkoncentreret ved 4 ° C under anvendelse af en Amicon Ultra proteinkoncentration rør (Millipore) og centrifugeret ved 3000 rpm i 30 minutter, inden de blev opbevaret ved -80 ° C [28].

Cellekultur og behandling

oral cancer cellelinje SAS (japansk Indsamling af Research Bioressourcer Cell Bank [JCRB], Japan) blev dyrket ved 37 ° C under en CO 5%

2 atmosfære. Kulturen blev opretholdt i DMEM-medier (Invitrogen) rutinemæssigt suppleret med 10% FBS, 100 enheder /ml penicillin, 2 mM L-glutamin og 100 ug /ml streptomycin. Celler blev inkuberet serumfrit i 24 timer før behandling.

trypanblåt -eksklusionsassay

Celler blev podet på plader med 6 brønde i en koncentration på 10

5 pr brønd og dyrket i 24 timer. Cellelevedygtighed blev bestemt efter deres evne til at udelukke 0,5% trypanblåt (Invitrogen) efter behandling med 100-400 pg /ml AGEs i 24 og 48 timer. Et tilsvarende volumen trypanblåt-opløsning (0,1%, vægt /volumen), blev HBSS, og celleopslæmningen kombineret og holdt ved stuetemperatur i fem minutter. Prøver blev derefter sat på et hæmocytometer at kategorisere celler som levende eller døde efter optagelsen af ​​farvestof. Alle tal i denne undersøgelse er de middelværdier for tredobbeltforsøg.

WST-1 assay

Celler blev podet på 96 brønde i en koncentration på 5 × 10

3 per brønd og dyrket i 24 timer. Celleproliferation blev påvist ved WST-1-kittet (Clontech) i konditioneret medium. Prøver blev fremstillet ifølge protokollen beskrevet af producenten. Kort fortalt, efter behandling med AGEs (0-400 pg /ml), blev det konditionerede medium centrifugeret ved 2.000 rpm i 10 minutter. Supernatanten blev derefter overført til 96-brønds plader (100 pl /brønd). Reaktionsblanding (100 pi) blev tilsat til hver brønd, efterfulgt af inkubation i 30 minutter. I inkubationsperioden blev prøver holdt ved stuetemperatur (RT) og beskyttet mod lys. Absorbansen af ​​prøverne blev målt ved 490 nm. Reference bølgelængde bør være større end 600 nm. Alle tal i denne undersøgelse er de middelværdier fra eksperimenter udført i tre eksemplarer.

RNA-interferens Eksperimenter

Celler blev podet på plader med 6 brønde i en koncentration på 2 × 10

5 brønd og dyrket i 24 timer. Cellerne blev derefter transficeret med RAGE siRNA (en pulje af 3 målspecifik 19-25 nt siRNA, Santa Cruz) eller sense-strengen sekvensen af ​​RNAi som negativ kontrol (5′-UUCUCCGCCCGUGUCACGU-3 ‘) [29]. Transfektioner blev udført ved anvendelse af Lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Specifikt fortyndes 40 pmol af RNAi duplex i 250 pi Opti-MEM I reduceret serum medium uden serum. Vi derefter forsigtigt blande Lipofectamine RNAiMAX og fortyndet 4 pi af blandingen i 50 pi Opti-MEM I reduceret serummedium. Den fortyndede RNAi duplex blev kombineret med fortyndet Lipofectamin RNAiMAX og inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur. Endelig blev den RNAi duplex- Lipofectamin RNAiMAX komplekser tilsat til hver brønd. Dette resulterede i et endeligt volumen på 600 pi og en endelig siRNA koncentration på 20 nM. Cellerne blev inkuberet i 48 timer forud for deres brug i forsøg.

Western blot

Proteiner (30 ug) blev resolveret ved anvendelse af 10% SDS-PAGE-gel og derefter overført til nitrocellulosemembraner (PALL Corp .). Membranerne blev blokeret ved anvendelse af fedtfri mælk og inkuberet natten over ved 4 ° C med de følgende primære antistoffer: anti-p-ERK (fortynding af 1:1,000); anti-ERK (fortynding af 1:1,000); anti-MMP2 (fortynding af 1:1,000); anti-MMP9 (fortynding af 1:1,000); anti-RAGE (fortynding af 1:1,000;.. anti-GAPDH (fortynding af 1:40,000) Primære antistoffer blev derefter fjernet og membraner blev vasket med PBST-buffer i 30 minutter Membranerne blev efterfølgende inkuberet i 45 minutter ved stuetemperatur med følgende sekundære antistoffer:. peberrodsperoxidase konjugeret anti-muse (fortynding af 1:4,000) og anti-kanin (fortynding af 1:4,000) (Chemicon) Endelig sekundære antistoffer blev fjernet, og membranerne blev vasket med PBST-puffer to gange i 30 minutter. blev påvist signaler ved hjælp af vestlige Lighting Kemiluminescens Reagent Plus kit (Millipore). de tætheder af signalerne blev målt ved hjælp af et billedbehandlingssystem, og signalerne blev kvantificeret efter at være normaliseret mod dem af GAPDH. Alle tal i dette papir er de gennemsnitlige værdier fra eksperimenter udført i triplikat.

cellemigrationsassay

celler blev podet på plader med 6 brønde under anvendelse Kultur-Insert (ibidi) ved en koncentration på 6 × 10

5 celler per brønd og derefter dyrket i 24 timer. Efter en periode på 24 timer i serum-fri betingelser, blev Kultur-Indstik fjernet, og celler blev vasket ved hjælp HBSS, før behandling med aldre til analyse af celle migration.

Zymorgraphy assay

Efter behandling med 200-400 pg /ml aldre for 4 eller 24 timer blev celler podet på 7 cm skåle i en koncentration på 1 × 10

6 celler. Zymografi blev anvendt til at påvise funktionen af ​​MMP2 og MMP9 i betinget medium. For at opnå dette, anvendte vi 7,5% SDS-PAGE-gel indeholdende 0,1% gelatine (J.T.Baker, Center Valley, PA, USA). Gelen blev derefter vasket med 2,5% Triton X 100 i 30 minutter ved stuetemperatur. Triton X 100 blev fjernet, og gelen blev vasket med RO H

2O. Vi tilføjede derefter renaturering buffer (50 mM Tris-HCI pH 7.2,20% glycerol) i 30 minutter ved stuetemperatur. Renaturering puffer blev fjernet, og gelen blev vasket med RO H

2O. Vi tilføjede derefter udvikle buffer (50 mM Tris-HCl pH 8,8, 5 mM CaCI2, 1 mM ZnCl2) i 24 timer ved 37 ° C. Udvikle puffer blev fjernet, og gelen blev vasket med RO H

2O. Gelfarvning blev udført i 1 time ved stuetemperatur under anvendelse PageBlue proteinfarvning (Fermentas, Lafayette, CO, USA). Gel affarvning blev udført ved hjælp af RO H

2O ved RT. . (Fig S1)

statistiske analyser

Vi har udført student t-test, en-vejs ANOVA, og p-værdier for 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater.

indflydelse af aldre på orale kræftceller

Vi først vurderede indflydelse aldre på cellelevedygtighed. SAS-celler blev behandlet med AGEs (0-400 pg /ml) eller BSA (0-400 pg /ml) i 24 eller 48 timer, hvorefter antallet af celler og proliferationshastighed blev bestemt ifølge trypanblåt udelukkelse (fig. 1A ) og WST-1-assays (fig. 1B). Sammenlignet med kontrol celler, viste ALDER behandlede celler en betydelig reduktion i antallet af celler (24 timer AGEs 100: 2,88 ± 0,16,

P

= 0,006; AGEs 200: 2,6 ± 0,25,

P

= 0,008; AGEs 400: 1,85 ± 0,05,

P

0,0001; 48 timer AGEs 100: 3,1 ± 0,18,

P

= 0.05; AGEs 200: 2,57 ± 0,17,

P

= 0,01; AGEs 400: 2,03 ± 0,08,

P

= 0,003). I modsætning hertil blev BSA vist sig at øge antallet af celler (som en negativ kontrol, 24 timer: 4,77 ± 0,32, NS; 48 timer: 9,25 ± 0,35,

P

= 0,0004) (fig 1A.). Desuden blev celleproliferation vist at blive inhiberet af AGEs (fig. 1B). Endelig behandling af celler med aldre (400 pg /ml; 0-4 timer) forbedret migration; dog havde BSA ikke har nogen effekt på migration (Fig. 1C).

SAS celler blev behandlet med aldre (0-400 pg /ml) eller BSA (0-400 pg /ml) i 24 til 48 timer. Antallet af celler og proliferation blev påvist under anvendelse af trypanblåt farvestof udstødelse (A) og en WST-1 assay (B). AGEs reducerede signifikant antallet af celler; BSA (som en negativ kontrol) øgede levedygtighed (A). AGEs inhiberede også celleproliferation (B). Behandling med aldre (400 pg /ml; 0-4 timer). Forbedret celle migration, mens behandling med BSA ikke gjorde (C)

AGEs regulering af RAGE, MMP2, og MMP9

Celler blev behandlet med aldre (200 og 400 pg /ml) eller BSA (400 pg /ml) i 24 timer. Vi anvendte derefter western blot-analyse til påvisning af RAGE, MMP2, og MMP9. Sammenlignet med kontrol celler, viste det resultat, at AGEs behandlede celler præsenteret en betydelig stigning i RAGE (alder 400: 1,3 ± 0,03,

P

= 0,0007), MMP2 (AGEs 200: 1,28 ± 0,04,

P

= 0,002; AGEs 400: 1,47 ± 0,04,

P

= 0,004), og MMP9 (ages 400: 1,24 ± 0,03,

P

= 0,0008) (figur 2).. Desuden blev funktionaliteten af ​​MMP2 og MMP9 øget efter behandling med aldre til 4 eller 24 timer (Fig S2).

Efter behandling af celler med aldre (200 og 400 mg /ml) eller BSA (400 pg /ml ) i 24 timer, RAGE, MMP2, og MMP9 blev påvist ved Western blot-analyse (A). AGEs signifikant øget udtryk for RAGE, MMP2, og MMP9 (B).

Regulering af ERK phosphorylering med AGEs

For at identificere vejen aldre, SAS celler blev behandlet med AGEs eller BSA i 24 timer. ERK-phosphorylering blev derefter detekteret under anvendelse western blot-analyse. Vores resultater viser, at behandling med AGEs signifikant forøget ERK phosphorylering (alder 400: 1,26 ± 0,06,

P

= 0,01) (fig 3A.). ERK-phosphorylering blev forøget efter 4 timer AGEs behandling (Fig S2); imidlertid forbehandling af celler med PD98059 i 1 time resulterede i en reduktion i ekspressionen af ​​MMP2 og MMP9 (fig. 3B og C). Det fremgår, at PD98059 forbehandling blokerede virkningerne af aldre på celle migration (figur 3D.); imidlertid blev RAGE-ekspression ikke påvirkes (alder 400: 1,27 ± 0,04,

P

= 0,003) (fig 3E.)

Western blot-analyse, der viser, at behandling af SAS-celler med AGEs i 24 timer. resulterede i øget ERK-phosphorylering (A). Forbehandling med PD98059 i 1 time reducerede ERK-phosphorylering, MMP2 og MMP9 (B og C) samt cellemigrering (D); dog RAGE niveauer stadig forøget (E).

Regulering af ERK af AGEs via RAGE

RAGE antistoffer (10 ng /ml forbehandling i 1 time) blev anvendt til at blokere AGE konjugation. Behandling med AGEs resulterede i en betydelig stigning i ERK phosphorylering og udtryk for MMP2, og MMP9 (ERK: 1,31 ± 0,03,

P

= 0,0008; MMP2: 1,38 ± 0,04,

P

= 0,0005; MMP9: 1,32 ± 0,09,

P

= 0,02). Sammenlignet med celler behandlet med aldre alene, celler behandlet med både aldre og RAGE antistof viste signifikant hæmmede ERK fosforylering (

P

= 0,009) samt reduceret ekspression af MMP2 (

P

= 0,05) og MMP9 (

P

= 0,0003) (fig. 4 A og B). RAGE antistoffer blev også vist at undertrykke cellemigrering (fig. 4C).

Anvendelsen af ​​RAGE antistof (10 ng /ml forbehandling i 1 time) for at blokere AGE konjugering resulterede i en signifikant stigning i ERK phosphorylering, MMP2 og MMP9 grund AGEs. Sammenlignet med AGEs behandling (#), RAGE antistof blokeret ERK-phosphorylering, MMP2, og MMP9 (A og B) samt cellemigrering (C).

RAGE RNAi (20 nM i 48 timer) blev derefter anvendt til at lukke munden proteinekspression. Sammenlignet med den RNAi negativ kontrol (N), blev RAGE RNAi vist sig at have en signifikant undertrykke RAGE-ekspression (0,64 ± 0,07,

P

= 0,006) (fig. 5A). Undertrykkelsen af ​​cellemigrering ved RAGE RNAi fandtes at forekomme uafhængigt af virkningerne af AGEs (fig. 5B). Desuden RAGE RNAi hæmmede ERK-phosphorylering (RNAi: 0,64 ± 0,08,

P

= 0,01, N + AGEs: 1,26 ± 0,03,

P

= 0,001) MMP2 (N + AGEs: 1,28 ± 0,04,

P

= 0,003), og udskillelsen af ​​MMP9 (RNAi: 0,58 ± 0,06,

P

= 0,002; N + AGEs: 1,36 ± 0,05,

P

= 0,003). Sammenlignet med N + AGEs, behandling med RNAi + AGEshad en signifikant virkning på alle tre af disse processer (ERK:

P

= 0,02; MMP2:

P

0,003; MMP9:

P

= 0,04) (fig. 5C og D). Den negative kontrol viste ikke signifikante virkninger.

RAGE RNAi (20 nM i 48 timer) blev anvendt til at lukke munden proteinekspression. Sammenlignet med den RNAi negativ kontrol (N), RAGE RNAi væsentligt reduceret RAGE-ekspression (A). Undertrykkelsen af ​​cellemigrering ved RAGE RNAi forekom uafhængigt af behandling med AGEs (B). RAGE RNAi inhiberede også ERK-phosphorylering, MMP2, og MMP9. Sammenlignet med N + AGEs (#), RNAi + AGEs præsenteret en betydelig reduktion (C og D) og den negative kontrol havde ingen effekt.

Diskussion

Et forhold mellem oral cancer og DM er blevet påvist af tidligere forskere [30] – [32]. Patienter, der lider oral cancer, sammenholdt med DM er ansigt med stærkt invasive cancerceller, og lave overlevelsesrater [26]. Imidlertid har mekanismen bag forholdet mellem oral cancer og DM ikke blevet belyst. Dette er den første undersøgelse for at undersøge en mulig sammenhæng mellem alder og kræft i mundhulen. Vi har udført denne forskning for at identificere den rolle, AGE-RAGE-system i oral cancer, og at belyse forholdet mellem oral cancer og DM

Forskere har tidligere rapporteret, at aldre og RAGE regulere celle migration [15]. – [17], [33]. Vores resultater bekræfter, at AGEs forbedre celle migration og viser også, at AGEs reducerer cellernes levedygtighed. Takino et al. opnået lignende resultater under anvendelse af glyceraldehyd-afledte AGEs [17]. Desuden Bhawal et al. rapporterede, at RAGE er tæt forbundet med den invasivitet af oral cancer [15], og vores resultater viser, at AGEs regulerer celle migration via ekspression af RAGE. I en klinisk indstilling, er udtryk for MMP2 og MMP9 syntes at være tæt knyttet til metastase i mundtlig kræft [34], [35]. AGEs har endvidere vist sig at øge udskillelsen af ​​MMP2 [17] og regulere MMP9-ekspression [36], [37] via ERK-vejen [23], [38]. Vores resultater understøtter disse tidligere fund; specifikt er denne ERK phosphorylering og ekspressionen af ​​MMP2 og MMP9 reguleret af AGEs. Derudover CD44 er en migrering faktor relateret til raseri [39]. Men vi kunne ikke observeret signifikant forskel i CD44-ekspression efter AGEs behandling (data ikke vist). En lignende rapport bekræftede, at ekspressionen af ​​CD44 ikke påvirkes af AGEs [40]. Dette antyder, at AGEs-RAGE regulere cellemigration via en vej, der er ikke CD44 afhængige

Nylige undersøgelser har antydet, at RAGE er en multiple receptor, som regulerer celleproliferation gennem dens ligand (S100 eller HMGB1) [41]. – [43]. Xu et al. og Meghnani et al. også foreslå, at RAGE øger celledeling og relaterede veje [44], [45]. Desuden har HMGB1 vist sig at regulere celleproliferation og metastase via RAGE og melanom-inhiberende aktivitet (MIA) vej hos oral cancer [46]. I vores undersøgelse, aldre og BSA synes at variere i deres virkninger på SAS celler. AGEs blev vist at reducere antallet af celler; dog BSA steg det. Mere specifikt i denne undersøgelse celler blev inkuberet serum-fri i 24 timer før behandling; således BSA kan have fungeret som en vækstfaktor. Vores konklusion om, at AGEs faldt antallet af celler og samtidig øge ERK fosforylering viser tydeligt, at AGEs forskellige i deres virkninger på celler. Valencia et al. også vist, at divergerende veje for genekspression aktiveres af RAGE ligand S100 og AGEs [47]. Derfor virkningerne af AGE-RAGE-system adskiller sig fra de andre ligander

Brugen af ​​PD98059 at blokere ERK vej resulterede i undertrykkelse af celle migration og også reduceret ekspression af MMP2 og MMP9.; blev imidlertid ingen forskel observeret med hensyn til indflydelsen af ​​AGEs i stigende RAGE-ekspression. Brugen af ​​RAGE antistof og RNAi at blokere AGEs-RAGE vej resulterede i hæmmet ERK phosphorylering og celle migration og også reduceret ekspression af MMP2 og MMP9. Disse resultater viser, at virkningerne af aldre på cellemigration ske via ERK fosforylering. Interessant, foreslog en tidligere klinisk studie, at stigningen i RAGE niveauer i kræft korreleret med metastaser [15], [33]. Med andre cellemodeller, RAGE syntes at regulere cellemigrering [15], [48], [49]. Vores resultater viser, at virkningerne af RAGE RNAi indflydelse celle migration, ERK fosforylering, og MMP9 udtryk uafhængigt af hinanden. Dette fund giver yderligere støtte til den påstand, at RAGE medierer metastase gennem ekspression af MMP9 via ERK-vejen.

I denne rapport AGEs faldt cellernes levedygtighed og forbedret celle migration, samtidig fremme ERK phosphorylering og øge ekspressionen af MMP2 og MMP9. PD98059, RAGE antistof, og RNAi viste sig at mægle AGE regulering. Dette er den første undersøgelse for at vise, at RAGE regulerer ekspressionen af ​​MMP9 via ERK-vejen. Endnu vigtigere, demonstrerede vi den rolle, AGE-RAGE spiller i malignitet af oral cancer gennem regulering ERK og nedstrøms veje, i sidste ende påvirker celle migration i kræft i mundhulen. Den mekanisme, hvorved AGE-RAGE fungerer i vores

in vitro

model af oral cancer er præsenteret i fig. 6. AGEs øge RAGE-ekspression, som stimulerer den nedstrøms vej for ERK-phosphorylering og resulterer i opregulering af MMP2 og MMP9. Dette vil til gengæld øger cellemigrering, der manifesterer i malignitet af cancer. Disse resultater forklarer, hvorfor tilfælde af oral cancer samtidig med DM nuværende øget cancer invasion og reducerede overlevelsesrater. Resultaterne viser også, at ophobningen af ​​AGEs alderdomssvækkelse eller DM øger sandsynligheden for at udvikle ondartet kræft.

AGEs øge RAGE udtryk og stimulere nedstrøms vej af ERK fosforylering. Dette har den virkning opregulering MMP2 og MMP9 udtryksformer og øge celle migration, der manifesterer sig som malignitet.

Støtte oplysninger

figur S1.

Lukning af celle migration område. Migration område blev målt ved anvendelse ImageJ og kvantificeres ved at registrere ændringer i sårområdet. AGEs faldt betydeligt størrelsen af ​​sår-området, mens PD98059, RAGE antistof, og RAGE RNAi undertrykt migration på 4 timer. Analyse var adfærd envejs ANOVA, og resultatet var statistisk signifikant (p 0,0001)

doi: 10,1371 /journal.pone.0110542.s001

(TIF)

Figur S2..

Funktionsmæssigt af MMP 2 og MMP 9. Efter behandling af SAS-celler med aldre (400 ug /ml) i 0,5-4 timer, blev påvist ekspressionen af ​​ERK-phosphorylering. Det funktionelt af MMP 2 og MMP 9 blev detekteret ved zymorgraphy efter AGEs behandling i 4 eller 24 timer. Resultaterne viser, at AGEs øget ERK fosforylering (A). MMP 2 og MMP 9 blev forøget med aldre på 4 timer, men kun MMP 2 blev forøget ved 24 timer (B)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0110542.s002

(TIF)