PLoS ONE: Praf2 Er en roman Bcl-xL /Bcl-2 Interaktion protein med evnen til at modulere Overlevelse af kræftceller

abstrakt

Forøget ekspression af Bd-XL i cancer er blevet vist at bibringe resistens over for en bred vifte af apoptotiske stimuli og til at modulere en række andre aspekter af cellulær fysiologi, herunder energimetabolisme, cellecyklus, autophagy, mitokondrie fission /fusion og cellulær vedhæftning. Men kun få af disse aktiviteter har en mekanistisk forklaring. Her brugte vi Tandem Affinity rensning at identificere nye Bd-XL interagerende proteiner, som kan forklare de pleiotrope virkninger af Bd-XL overekspression. Blandt de mange proteiner co luftrensende med Bd-XL, fokuserede vi på Praf2, et protein med en forudsagt rolle i menneskehandel. Interaktionen af ​​Praf2 med Bd-XL blev fundet at være afhængig af det transmembrane domæne af Bd-XL. Vi fandt, at Bcl-2 også interagerer med Praf2 og at Bd-XL og Bcl-2 kan også interagere med Arl6IP5, en homolog af Praf2. Interessant overekspression af Praf2 resulterer i translokationen af ​​Bax til mitokondrierne og induktion af apoptotisk celledød. Praf2 afhængig celledød forhindres af co-transfektion af Bd-XL, men ikke ved dens transmembrane domæne deleteret mutant. Derfor knock-down af Praf2 øger clonogenicity af U2OS celler efter etoposid behandling ved at reducere celledød. Afslutningsvis en skærm for Bd-XL-interagerende membranproteiner lad os identificere en roman proapoptotiske protein, hvis aktivitet er stærkt udelukkende modvirkes af membran målrettet Bd-XL

Henvisning:. Vento MT, Zazzu V, Loffreda A, Cross JR, Downward J, Stoppelli MP, et al. (2010) Praf2 er et hidtil ukendt Bcl-xL /Bcl-2 interagerende protein med evnen til at modulere Overlevelse af kræftceller. PLoS ONE 5 (12): e15636. doi: 10,1371 /journal.pone.0015636

Redaktør: Rafael Linden, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasilien

Modtaget: 9. september 2010; Accepteret: November 18, 2010; Udgivet: December 20, 2010

Copyright: © 2010 Vento et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Association for International Cancer Research, Grant Ref .: 05-0416 (https://www.aicr.org.uk/index.stm), og European Science Foundation (ESF), Eurocore Network på Membrane Arkitektur og Dynamics, Contract n.LSHC-CT-2003-503297, til MPS De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den erhvervede evne til at undslippe apoptose er nødvendig på flere trin under udviklingen af ​​kræft. Over-ekspression af Bd-XL-proteinet vides at bibringe resistens over for en bred vifte af potentielt apoptotiske stimuli opstår under udviklingen af ​​kræft, såsom onkogen aktivering, hypoxi og matrix løsrivelse [1] – [3]. Nedsat apoptose på grund af over-ekspression af Bd-XL-genet er derfor kritisk under cancer progression. Nedsat apoptose er også en stor hindring for effektiv behandling af kræft, fordi cytotoksiske terapier for kræft stærkt afhængige induktion af apoptose. Interessant nok har Bd-XL blevet foreslået at spille en unik rolle i almindelighed modstandsdygtighed over for cytotoksiske midler, på grund af en slående sammenhæng mellem øget Bd-XL ekspressionsniveauet og modstand mod et bredt panel af standard kemoterapimidler. Bd-XL virkningsmekanisme er derfor en vigtig del af kemoresistens i cancerceller [4]. Bd-XL tilhører bcl-2-familien af ​​proteiner, hvis medlemmer kan have enten anti-apoptotiske eller pro-apoptotiske funktioner. De proapoptotiske medlemmer af Bcl-2-familien kan opdeles i to undergrupper. De såkaldte multidomain faktorer (Bax og Bak) er proteiner, der deler mere end en Bcl-2 Homologi (BH) domæne. Den anden underfamilie omfatter proteiner deler kun BH3-domænet. Et billede er dukket tyder på, at “BH3 kun” proteiner har forskellige mekanismer for regulering og er målrettet sensorer af forskellige kilder til celle stress. Deres primære funktion synes at være den binding og neutralisering af de anti-apoptotiske Bcl-2-familien membres [5], selv om nogle af dem også er blevet rapporteret at være i stand til direkte at aktivere multidomain proapoptotiske familiemedlemmer [6], [7]. Det er således almindeligt accepteret, at forhøjede Bd-XL proteinniveauet falder modtagelighed for apoptose, fordi det øger den cellulære potentiale til at inaktivere pro-apoptotiske “BH3 kun” proteiner [8].

Udover dets evne til at inhibere kernen apoptotiske maskiner, Bd-xL er blevet vist at modulere en række andre aspekter af cellulær fysiologi. Dets overekspression, for eksempel, er blevet korreleret med høj tumorklassificering og forøget evne til at invadere og metastaserer, uafhængigt af dets evne til at opretholde overlevelse i fravær af matrix fastgørelse [9] – [11]. Bd-XL har vist sig at komplementere

S. cerevisiae

gener, der letter overgangen fra glycolytiske for oxidativ metabolisme [12]. Bd-XL er også i stand til at modulere calciumhomeostase [13], stimulere synapsedannelse [14], langsom cellecyklusprogression [15], modulere autofagi [16], [17], øge mitokondrie fission /fusion [18] og modulerer metabolit udveksling på tværs af ydre mitokondriske membran [19]. Nogle af disse “ukonventionelle” Bd-XL aktiviteter kunne forklares ved dets evne til at interagere med andre end de pro-apoptotiske “kun BH3” faktorer proteiner. Bd-XL har faktisk vist sig at interagere med VDAC1 [20], med IP3 Receptor [21], med Beclin1 [22], og en række andre proteiner.

Bd-XL er både en cytosolisk og en membran-associeret protein [23]. Mens cytosolisk Bd-XL synes at være en homodimer [24], den kvaternære struktur af membranbundet Bd-XL er ikke blevet undersøgt i detaljer, selv om det er blevet rapporteret, at det kunne være involveret i høj molekylvægt komplekser [25] ( Borner personlig kommunikation). I den foreliggende undersøgelse præsenterer vi beviser for, at Bd-XL er faktisk en del af højmolekylære komplekser, og vi forsøger at udføre en omfattende analyse af proteiner kan binde Bcl-xL ved hjælp Tandem Affinity Purification. Interessant fandt vi, at Bd-XL interagerer med proteiner involveret i adskillige cellulære processer. Blandt dem, den sekretoriske pathway var en af ​​de mest repræsenterede veje. Med det formål at validere listen over proteiner, der findes at interagere med Bd-XL, besluttede vi at fokusere vores analyse på samspillet mellem Bd-XL og Praf2, et lille protein tilhører prenylerede Rab acceptor familie, med en forudsagt rolle i ER at Golgi transport [26]. Vi viser, at Praf2 inducerer apoptotisk celledød efter ekspression, og at Bcl-XL modvirker Praf2 s apoptotisk aktivitet. Endelig viser vi, at Praf2 lyddæmpning i U2OS celler gør dem mere modstandsdygtige over for apoptose induceret af det cytotoksiske lægemiddel etoposid.

Resultater

For at undersøge den mulighed, at Bd-XL er forbundet med membranproteiner i højmolekylære komplekser har vi anvendt saccharosegradient fraktioneringer af CHAPS-solubiliserede hele celler ekstrakter. Analysen blev udført under anvendelse af U2OS cellelinien, fordi den udtrykker høje niveauer af Bd-XL og synes at være “afhængige” til Bd-XL-ekspression for overlevelse (ikke vist). Pre-clearede celleekstrakter blev fyldt på saccharosegradienter og underkastet ultracentrifugering som beskrevet i Materialer og Metoder. Fraktioner blev opsamlet, opløst ved SDS-PAGE og analyseret ved immunblot. Figur 1 viser, at proteiner med lav molekylvægt såsom cytochrom C (12 kDa), Rab 4 (25 kDa) eller Bax (20 kDa) er til stede i fraktioner af gradienten, hvor der forventes lavmolekylære proteiner til at sedimentere. Bd-XL, i stedet, er spredt i fraktioner i området fra lav til høj molekylvægt. Dette resultat antyder, at Bd-XL under disse forsøgsbetingelser kunne være involveret i en række forskellige molekylære komplekser.

saccharosegradientfraktionering af U2OS samlede celleekstrakter. U2OS (60 × 10

6 celler) blev lyseret i CHAPS udvinding buffer og klaret ved centrifugering. Ekstrakter blev fraktioneret under anvendelse af en sucrose-gradient 10-40% og lige store volumener af fraktionerne blev analyseret ved immunblot for tilstedeværelsen af ​​Bd-XL, Bax, Rab4 og cytochrom c.

Etablering af HeLa-celler, der udtrykker en TAP-Bd-xL kimære protein

for at kunne identificere det sæt af proteiner interagerer med Bd-xL i de analyserede forhold, vi gjort brug af Tandem Affinity Oprensning [27], [28]. Bd-XL er en hale-forankret protein, der erhverver membranlokalisering indsætte sin C-terminale hydrofob hale i lipiddobbeltlaget af flere membran rum. At undgå interferens med Bd-XL membraninsertion, genereret vi en udtrykkende vektor placere en TAP-tag ved N-terminalen af ​​Bcl-xL. Vi opnåede også en kontrol vektor, hvor en stopkodon tilsat nedstrøms for TAP-sekvensen. Begge konstruktioner blev transficeret i HeLa celler for at opnå kloner stabilt udtrykker enten TAP-Bd-XL eller TAP-stop kun. Vi valgte HeLa-celler, fordi de let kan tilpasses til vækst i suspensionskulturer, for at fremstille udgangsmaterialet egnet til biokemiske oprensninger. I modsætning U2OS, HeLa-celler, endvidere have et relativt lavt ekspressionsniveau af endogen Bd-XL (Fig S1), som kan konkurrere med TAP-Bd-XL for bindingspartnere. For at teste om tilsætning af TAP tag til Bd-XL kan forringe dens evne til at beskytte mod apoptose, vi udfordrede celler, der udtrykker TAP-Bd-XL (HeLa /TAP-Bd-XL) eller TAP-stop (HeLa /TAP) med UV-bestråling og analyseret status spaltning af PARP, som et mål for cellulær caspase 3-aktivitet. Som vist i figur 2A, i forhold til TAP-stop, HeLa udtrykker TAP-Bd-XL viste et reduceret niveau af PARP spaltning produkt. Derfor kan tilsætning af TAP-tag til N-terminalen af ​​Bd-XL ikke hindre evnen hos Bd-XL til at beskytte celler mod UV-induceret apoptose. Vi næste testet, hvis tilsætningen af ​​TAP tag til Bd-XL kunne ændre sin subcellulære fordeling. HeLa /TAP-Bd-XL-celler blev fraktioneret i cytosol (S100), nuklear (Nuclei), tunge membraner (HMM) og lette membraner (LMM) fraktioner ved differential centrifugering. Subcellulære lokalisering af TAP-Bd-XL sammenlignet med endogent Bcl-xL blev analyseret ved immunblot. Analysen er udført under anvendelse af ækvivalente mængder af proteiner til hver given fraktion, og det er ikke informativ på relative fordeling af de analyserede i de forskellige cellulære rum proteiner. Kvaliteten af ​​fraktioneringen blev defineret under anvendelse af antistoffer mod kendte markører af subcellulære afsnit: PARP for den nukleare fraktion, Sec23 for LMM fraktion (mikrosomer) og cytochrom C for HMM fraktion (mitochondrier). Vi analyserede også lokaliseringen af ​​Bax, et andet medlem af Bcl-XL-protein-familien, som er kendt for at lokalisere både på mitokondrier en i cytosolen. Figur 2B viser, at i lighed med endogen Bd-XL, TAP-Bd-XL lokaliserer til HMM fraktion, til LMM og til S100 fraktioner. Derfor kan tilsætning af TAP tag ikke forstyrrer evnen af ​​Bcl-xL at erhverve membran lokalisering.

(A) HeLa-celler, der stabilt udtrykker TAP-mærkede Bd-XL er mere modstandsdygtige end kontrol for UV-induceret apoptose. Analyse af PARP spaltning i HeLa celler, der udtrykker TAP alene eller TAP-Bd-XL og bestrålet eller ikke med UV (200 J /m

2). Celler blev opsamlet 2 og 4 timer efter bestråling og analyseret ved immunblot for udseendet af det spaltede produkt fra PARP. (B) TAP-mærkede Bd-XL lokaliserer til den samme intracellulære rum af endogent Bcl-xL. HeLa-celler, der udtrykker TAP-Bd-XL blev fraktioneret ved differentiel centrifugering til opnåelse af: bane 1, cytosoliske proteiner (S100); bane 2, nukleare proteiner (kerner); bane 3, fraktion den tunge membran (HMM); bane 4, fraktion lyset membran (LMM). 20 ug af hver fraktion blev analyseret ved immunblot for tilstedeværelsen af ​​TAP-BclxL (ved hjælp af kun sekundært antistof) og endogent Bcl-xL. Kvaliteten af ​​fraktioneringen blev bestemt under anvendelse af antistoffer mod Sec23 (LMM), cytochrom c (HMM), Bax (S100 og HMM) og PARP (kerner). (C) HeLa-celler stabilt transficeret med TAP alene eller TAP-Bd-XL blev udsat for Tandem Affinity Purification. Figuren viser et repræsentativt Coomassie farvet SDS-PAGE udføres under reducerende betingelser, der anvendes til at løse eluaterne fra oprensninger. Oprensninger blev udført ved anvendelse membran CHAPS-ekstrakter fra HeLa udtrykker TAP alene (bane 1) eller HeLa udtrykker TAP-Bd-XL (bane 2).

Identifikation af hidtil ukendte Bd-XL-interagerende proteiner ved anvendelse af Tandem Affinity oprensning

for at fremstille et egnet udgangsmateriale til TAP oprensninger, HeLa /TAP-Bd-xL og HeLa /TAP celler blev tilpasset til vækst i suspensionskultur under anvendelse spinde- glasflasker. I betragtning af vores interesse i membran baseret interaktioner vi valgte at fokusere på oprensninger udføres ved hjælp af membran ekstrakter. Cellepellets blev lyseret mekanisk ved anvendelse af en Dounce homogenisator i en detergent-fri hypotonisk puffer. Centrifugering af sidstnævnte cellelysat tilladt os at adskille samlede membraner fra cytosoliske proteiner. Total membraner blev ekstraheret under anvendelse af en CHAPS indeholdende puffer og underkastes tandem affinitetsoprensning. Eluater fra det sidste oprensningstrin blev koncentreret og opløst på SDS-PAGE. Fig. 2C viser repræsentative billeder af TAP oprensninger analyseret på Coomassie farvede geler fra TAP-only udtrykkende celler (bane 1) eller TAP-Bd-XL udtrykkende celler (bane 2). Lidt materiale opstod fra oprensninger fremstillet af TAP kun udtrykkende celler, hvilket indikerer, at baggrunden givet ved uspecifik adsorption til det kromatografiske medier anvendes, er ubetydelig. Bånd svarende til de mest udbredte proteinarter blev skåret fra gelerne og deres identitet blev bestemt ved LC-MS /MS. En liste af protein fundet at co-eluere med TAP-Bd-XL er vist i tabel 1.

Bd-XL er i stand til at interagere med proteiner involveret i adskillige cellulære processer

selv om det ikke kan tages listen af ​​Bd-xL interagerende proteiner præsenteret i tabel 1 som udtømmende, kan det betragtes som en høj konfidens liste. Vi har opdelt alle identificerede proteiner i forskellige funktionelle kategorier, og for hvert protein, vi har angivet den kendte eller formodede sub-cellulær lokalisering. Vi har også udtalt, hvis proteinet allerede tidligere er blevet fundet at interagere med Bel-XL. Det er interessant at bemærke, at de fleste af anti-apoptotiske medlemmer af Bcl-2-protein familien, der tidligere er blevet beskrevet til at interagere med Bd-XL er til stede i den endelige eluat. VDAC1 blev også allerede beskrevet til at interagere med Bd-XL [20], mens VDAC2, en mindre rigelige isoform, har vist sig at interagere med multidomain Bcl-2 familiemedlem Bak [29]. ATP2A2 /SERCA2 stedet, er blevet rapporteret at interagere med Bcl-2 [30]. Samlet tilstedeværelsen af ​​disse proteiner i den endelige eluatet af vores rensning udgør en god indikation af specificiteten af ​​interaktionerne fundet. Ud over de Bcl-2 familiemedlemmer, vi sammensat en gruppe af proteiner, der alle er mitokondrier og er funktionelt involveret i stofskiftet energi og mitokondrie fysiologi. Denne gruppe omfatter 10 af de 17 underenheder af ATP syntase multiproteinkompleks, underenheder II og IV i cytochrom c oxidase og cytochrom b5 type B, alle en del af den biokemiske kæde ansvarlig for oxidativ phosphorylering og ATP produktion. Det omfatter også mitokondrie carbamoyl-phosphat synthetase 1, som spiller en vigtig rolle i at fjerne overskydende ammoniak fra cellen, og VDAC1 og 2, regulatorer om mitokondriel permeabilitet. I denne gruppe indgår vi to mere mitokondrielle proteiner identificeret som Bd-XL forbundet: Stomatin-lignende protein 2 (StomL2) og prohibitin 2. StomL2 har for nylig vist sig at være en del af et kompleks med Mitofusin 2 [31], mens prohibitin 2 formodes at spille en rolle i reguleringen af ​​mitokondrie respiration.

et andet sæt af proteiner kunne grupperes i den funktionelle kategori af transportvirksomheder. De ligger på forskellige membran rum, og er: aminosyretransporter SLC3A2; cellemembranen Na + /K + ATPase transportør ATP1A1; ER bosat calcium transporter ATPase ATP2A2 /SERCA2; transferrin receptor, der kunne ses som en atypisk transportør. En fjerde funktionel gruppe af proteiner direkte eller indirekte forbundet med Bd-XL er sammensat af proteiner med et formodet eller etableret rolle i den sekretoriske gren af ​​intracellulær transport. De, der er komponenter i translokationskomplekset (Sec61 beta, Sec11A), chaperoner er involveret i proteinfoldning bistand i ER (calnexin), proteiner involveret i ER specifikke protein modifikationer (Ribophorin I, OST48, MPDU1) og proteiner med en formodet rolle i ER til Golgi trasport (Sec22b, erge-32, TMP21, TMED5, Praf2) samt ER retention (SSR4, KDEL receptor 1). Andre trafficking proteiner forbundet med Bd-XL blev Rab7, en lille GTPase med en rolle i sene endosom modning og VAMP3, et protein med en formodet rolle i endosomer genbrug. Endelig identificerede vi som roman Bc-xL interagerende proteiner en gruppe af faktorer enten med ukendt eller meget dårligt beskrevet funktion (tabel 1).

Validering af samspillet mellem Praf2 og Bd-XL

forholdet mellem den sekretoriske gren af ​​intracellulær menneskehandel og apoptotisk celledød er langt fra forstået. Blandt de nyligt identificerede proteiner, har Praf2 blevet foreslået at spille en rolle i ER til Golgi transport [26]. Praf2 tilhører prenylerede Rab acceptor (PRA) familie af proteiner, hvis grundlægger, PRA1 /Rabac1, har vist sig at interagere med viral Bcl-2 homolog BHRF1, og modulerer dets aktivitet [32]. For at få indblik i forholdet mellem vesikulær transport og apoptose, besluttede vi at fokusere vores opmærksomhed på Praf2. CDNA’et koder for human Praf2 blev opnået fra IMAGE-konsortium og klonet i pcDNA3 med en tredobbelt HA-mærke fusioneret ved sin C-terminus. For at validere interaktionen mellem Praf2 og Bd-XL, blev 293T-celler transficeret enten med Praf2

HA og

FLAGBcl-xL ekspressionsplasmider alene eller co-transficeret med begge plasmider. 24 timer efter transfektioner Cellerne blev lyseret og Praf2 blev immunpræcipiteret under anvendelse af monoklonalt anti-HA konjugeret agarose. Som vist i fig. 3A,

FLAGBcl-xL kunne påvises i bundfaldet, når co-udtrykkes med Praf2. Vi var derfor i stand til at bekræfte interaktionen af ​​Bd-XL og Praf2 også i en to-komponenter systemet, hvor Bd-XL og Praf2 er samtidigt overudtrykt.

(A) HEK 293T-celler blev enten transficeret med HA- tagged Praf2 eller FLAG-mærket BclxL eller cotransficeret med begge ekspressionsvektorer. Prøver blev underkastet immunpræcipitation, ved anvendelse af anti HA-konjugeret agarose og begge totale lysater (input) og agaroseperler eluater (IP) blev analyseret ved immunblot under anvendelse af anti HA og anti FLAG monoklonale antistoffer. (B) U2OS celler blev transficeret med HA-mærket Praf2 eller tom vektor (Vec) og cellelysater blev underkastet immunpræcipitation under anvendelse HA-konjugeret agarose. Både lysater og agaroseperler blev analyseret ved immunoblot hjælp anti HA og anti Bd-XL-antistoffer.

Konstateringen af, at Praf2 co-renset med Bd-XL ved Tandem Affinity Oprensning klart viser, at Bd-XL er stand til at interagere med endogent Praf2 i HeLa-celler. Vi har nu undersøgt, hvis endogene Bd-XL er i stand til at interagere med Praf2 i U2OS celler. U2OS celler blev transficeret enten med tom vektor eller med Praf2

HA udtrykkende vektor, og lysater blev immunoprecipitaed anvendelse af anti HA-konjugeret agarose. Som vist i fig. 3B, anti HA-konjugeret agarose kan specifikt fremskynde endogene Bd-XL i U2OS celler transficeret med Praf2

HA, men ikke med den tomme vektor.

Flere medlemmer af Bcl-2-familien er i stand til at interagere med flere medlemmer af PRA familien

stiftende medlem af PRA-familien af ​​proteiner, PRA1 /Rabac1, har vist sig at interagere med viral Bcl-2 homolog BHRF1, men ikke med Bcl-2 selv [32] . Vi spurgte derfor hvis bindende evne Praf2 var begrænset til Bd-XL eller kan udvides til Bcl-2 også. Vi spurgte også, hvis tæt homolog af Praf2, Arl6IP5, er også i stand til at interagere med Bd-XL og /eller Bcl-2. Fig. 4, at Praf2

HA også kan interagere med

FLAGBcl-2 (bane 4), og også, at Arl6IP5

HA kan interagere med både

FLAGBcl-xL og

FLAGBcl-2 ( bane 5 og 6). Arl6IP5

HA ekspression resulterer i bands med forskellig elektroforetisk mobilitet. Eftersom de alle er immunpræcipiteret af anti-HA-antistof og da det er blevet beskrevet, at både Praf2 og Arl6IP5 kan give anledning til SDS-uopløselige arter [33], mener vi båndene observeret svarer til monomerer, dimerer og multimerer af Arl6IP5 .

HEK 293-celler blev enten transficeret med FLAG-mærket BclxL eller Bcl-2 alene (bane 1 og 2), eller co-transficeret med HA-mærket Praf2 eller HA-mærkede Arl6IP5 (bane 3 til 6) . Prøver blev underkastet immunpræcipitation under anvendelse HA-konjugeret agarose og begge lysater og agaroseperler blev analyseret ved immunblot under anvendelse af anti HA og anti FLAG-antistoffer. Arl6IP5 monomer: *; Arl6IP5 dimer: **; Arl6IP5 multimer:. ***

Det transmembrane domæne af Bd-XL er afgørende for dens interaktion med Praf2

evne Bd-XL til at interagere med de pro-apoptotiske medlemmer af Bcl-2-familien er kendt for at være medieret af en hydrofob kløft dannet på dens overflade, som BH1, BH2- og BH3-domæner [34]. Omvendt kan bindingen af ​​Bcl-2 /XL til Raf og Ras er blevet vist at afhænge af BH4-domænet [35], [36]. For at definere domæner af Bd-XL er ansvarlig for dens interaktion med Praf2, genereret vi en Bd-XL mutant deleteret af dets første 24 aminosyrer svarer til BH4-domænet (Bcl-xLΔBH4). Vi genererede også en Bd-XL-mutant, i hvilken tyrosin 101 blev erstattet med en lysin (Bcl-xLY101K) (fig. 5A), at en mutation, som er blevet beskrevet afskaffe Bd-XL evne til at interagere med Bax [37]. Endelig fordi Praf2 er et membranprotein [33], frembragte vi en Bd-XL mutant deleteret af dets C-terminale 22 aminosyrer svarende til dets transmembrane domæne (Bcl-xLΔTM). Som vist i fig. 5B, hverken deletion af BH4-domænet eller Y101K mutationen påvirkede Bd-XL evne til at interagere med Praf2. Imidlertid deletion af den C-terminale transmembrandomæne, helt afskaffet Praf2 /Bcl-XL interaktion, hvilket indikerer, at TM-domænet er afgørende for denne interaktion.

(A) Skematisk repræsentation af Bd-XL ekspressionskonstruktioner anvendes i denne undersøgelse. Bd-XL: fuld længde Bd-XL; Bcl-xLΔBH4: Bd-XL mangler de første 24 aminosyrer; Bcl-xLΔTM: Bd-XL, der mangler de sidste 22 aminosyrer; Bcl-xLY101K: Bd-XL med en substitution af tyrosin 101 med lysin. (B) HEK 293-celler blev co-transficeret med HA-mærket Praf2 og BclxL konstrukterne beskrevet i (A), der bærer et FLAG-tag ved N-terminalen. Prøver blev underkastet immunpræcipitation under anvendelse HA-konjugeret agarose og begge lysater og agaroseperler blev analyseret ved immunblot under anvendelse af anti HA og anti FLAG-antistoffer.

Praf2 overekspression inducerer apoptotisk celledød

Det er almindeligt accepteret, at forhøjede Bd-xL protein-niveauet falder modtagelighed for apoptose ved at binde og inaktivere pro-apoptotiske proteiner [8]. Endvidere er det blevet rapporteret, at overekspression af Yip3p (gær PRA1 /Rabac1 homolog) alvorligt inhiberet cellevækst [38]. Vi har derfor testet hvis Praf2 overekspression kunne inducere celledød, og hvis dette kunne blokeres af den samtidige ekspression af Bd-XL eller Bcl-xLΔTM mutant, der viste sig at være ude af stand til at binde til Praf2. HeLa-celler blev transficeret med vektor alene, med Praf2 eller co-transficeret med Praf2 og Bd-XL eller Praf2 og Bcl-xLΔTM. Fig. 6A viser, at Praf2 transfektion resulterede i en stærk induktion af celledød, med næsten 65% af cellerne bliver PI positive. Interessant Praf2 induceret celledød blev fuldstændigt inhiberet af den samtidige transfektion af fuld længde Bd-XL, men der observeredes ingen hæmning når Praf2 blev cotransficeret med Bcl-xLΔTM mutant. Endvidere er celledød induceret af Praf2 ledsaget af caspaseaktivering som vurderet ved fremkomsten af ​​den spaltede form af PARP. Igen blev dette fænomen fuldstændigt blokeret af Bd-XL, men ikke af Bcl-xLΔTM mutant (fig. 6B). Inhibering af Praf2-induceret PARP-spaltning blev også forhindret af den samtidige ekspression af Bcl-2 (data ikke vist).

(A) FACS-analyse af HeLa-celler transficeret med de anførte ekspressionsvektorer og farvet med propidiumiodid ( PI). Procenter af PI positive celler er vist i øverste venstre på hver graf. (B) Alikvoter af HeLa-celler transficeret som i (A) blev analyseret ved immunblot for udseendet af den spaltede form af PARP. Ekspressionsniveauer af Praf2, Bd-XL og Bcl-xLΔTM er også indikeret. (C) Analyse af GFP-Bax lokalisering i U2OS celler transficeret med tom vektor (vec) eller HA-mærket Praf2. Fotografierne er repræsentative for de to vigtigste GFP-Bax lokalisationer observeret i prøverne: diffus cytosolisk og aggregeret. Over fotografierne er angivet i% af GFP-positive celler med en aggregeret lokalisering efter transfektion af celler med tom vektor eller HA-mærket Praf2 i to uafhængige forsøg.

Dernæst ønskede vi at vurdere, om Praf2-induceret apoptose involverede translokationen af ​​Bax til mitokondrierne, en tidlig begivenhed i den indre apoptotiske vej. Vi cotransficeres derfor GFP-Bax konstruere med Praf2 eller vektor kontrol i U2OS. Fig. 6C viser, at GFP-Bax udtryk i U2OS celler kan have enten en diffus cytosolisk farvning, eller kan aggregeres i klynger. Vi har tidligere vist, at GFP-Bax aggregering, i den samme cellelinie, var sammenfaldende med mitokondriel dysfunktion, som målt ved et tab af ATm [39]. Vi brugte et overskud af Praf2 udtrykker eller tomme (VEC) plasmider for at opnå, at alle celler, der modtager GFP-Bax også modtaget Praf2 og tælles% af transfekterede celler med diffust eller aggregerede GFP-Bax signal. Resultatet vist i fig. 6C viser, at Praf2 co-transfektion blev forbundet med mere end 30% af celler, som viser et GFP-Bax aggregeret farvning, respekt til kun 2% observeret i tomme-vektor co-tansfected celler.

Knock-down af Praf2 øger cellulære overlevelse

Vi næste ønskede at definere, om reduktion af Praf2 udtryk ved RNA-interferens også kan påvirke cellulære levedygtighed. Den osteosarcomcellelinie U2OS udtrykker relativt høje niveauer af Praf2. Vi bankede-down Praf2 udtryk i U2OS celler ved hjælp af to forskellige siRNAs rettet mod forskellige regioner af human Praf2 mRNA. Western blot analyse af Praf2 viser et kraftigt fald i Praf2 udtryk i forhold til kontrol-transficerede celler (fig. 7A). Ingen åbenlyse morfologiske forskel var tydelig mellem kontrol og Praf2 knock-down celler 72 timer efter transfektion i normale vækstbetingelser. Vi spurgte derfor hvis Praf2 lyddæmpning kan påvirke cellulære sensibilitet til den toksiske effekt af et kemoterapeutisk middel som etoposid. Som vist i fig. 7B silencing af Praf2 med både siRNAs valgte resulterede i en reduktion på mere end 50% i caspaseaktivering forhold til kontrol transficerede celler. Følgelig clonogenicity af U2OS celler behandlet med etoposid steg fra under 20% af Ctrl transficerede celler til næsten 60% i Praf2 tavshed celler (Fig. 7C). Faldet i caspaseaktivering observeret efter Praf2 RNAi var ikke apoptotiske stimulus-specifik eller celletype-specifik, som det var også tydeligt i U2OS celler behandlet med paclitaxel eller doxorubicin (fig. S2A) og i brystcancer-cellelinie MDA-MB 231 behandlet med etoposid (fig. S2B).

(A) Analyse ved immunoblot af effektiviteten af ​​Praf2 banke ned efter transfektion af U2OS celler med to forskellige siRNA’er rettet mod Praf2 mRNA. (B) U2OS celler transficeret med kontrol (Ctrl) eller Praf2 målretning siRNA’er (siRNA5 og siRNA6) efter 48 timer blev behandlet med 50 pM etoposid i 24 timer. Cellulær caspase 3 og 7 aktiviteter blev målt ved anvendelse af Caspase-Glo 3/7 luminometrisk assay. Grafen viser procentdelen af ​​caspase 3 og 7 aktivering i prøver behandlet med Praf2 målretning siRNA’er sammenlignet med aktiviteten til stede i celler transficeret med kontrol siRNA i 3 uafhængige eksperimenter. (C) Clonogenicity af U2OS celler transficeret med kontrol eller Praf2 målrettet siRNA’er og behandlet eller ej med etoposid. 48 timer efter transfektion af U2OS celler med kontrol siRNA eller Praf2 siRNA6 blev celler behandlet med 50 pM etoposid i 3 timer og end forskydes igen til normalt medium i 2 uger. Kolonier blev farvet under anvendelse af krystalviolet. Grafen repræsenterer procentdelen af ​​kolonier dyrket efter etoposid behandling i forhold til den ubehandlede kontrol.

Discussion

Bd-XL er en C-hale forankret protein med evnen til at lokalisere på flere intracellulære membraner. For at få et bredt billede af sættet af membranproteiner interagerer med Bd-XL, udførte vi Tandem Affinitetsrensning fra totalt cellulært membraner af HeLa-celler, der stabilt udtrykker TAP-mærkede Bcl-xL. Eftersom ioniske detergenter såsom Triton-100 eller NP-40 vides at ændre konformationen af ​​proteiner fra Bcl-2-familien [23], blev udført alle forsøgene i nærværelse af CHAPS, et detergent, der efterlader konformationen af ​​Bd-XL uændret. Som anført i tabel 1, fandt vi mange proteiner co luftrensende med TAP-Bel-XL. Men de sandsynligvis vil afspejle sande protein-protein interaktioner i mindst to grunde. Først og fremmest, som det er vist i bane 1 i fig. 2C, oprensninger fra samme cellelinie, der bærer en TAP-tag-only konstruere genvinde næsten upåviselige proteiner, hvilket antyder, at alle udvundne proteiner faktisk er forbundet til Bcl-xL. For det andet, som beskrevet nedenfor, under anvendelse af denne procedure, vi fandt co-eluering med Bd-XL mange proteiner, der vides at være i stand til specifikt at interagere med Bcl-xL. Vi har opdelt liste over proteiner, der findes at interagere med Bd-XL ind i de funktionelle kategorier er beskrevet nedenfor. Det er værd at bemærke, at alle de proteiner, der findes, er enten trans-membranproteiner eller opløselige proteiner lokaliseret i intracellulære organeller. De fleste af dem lokalisere til sub-cellulære rum er kendt for at blive ramt af Bel-XL. Mange af dem er flere komponenter af protein-komplekser. Disse observationer udgør en god indikation af gyldigheden af ​​den anvendte metode og specificitet og følsomhed af den anvendte teknik. Vi kan derfor drage den konklusion, at Bd-XL kan være involveret i flere forskellige protein-komplekser på flere sub-cellulære sites. Denne konklusion er yderligere understøttet af de saccharosegradientfraktionering data præsenteret i fig.